CN102775513A - 磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法 - Google Patents

Abstract

一种磷酸酯化龙眼肉多糖，由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、果糖和山梨糖组成，磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518.5。磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，包括如下步骤：（1）龙眼肉多糖分离提取，（2）除蛋白及色素，（3）龙眼肉多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化，（4）龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化。(5)用磷酸酯化试剂POCl₃对龙眼肉多糖进行酯化。采用本发明能够用人工合成的方法制备磷酸酯化龙眼肉多糖，制备得的多糖含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、果糖和山梨糖。

Description

磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法。 

背景技术

糖基磷酸酯类化合物，特别是葡萄糖基磷酸酯类化合物的合成及其生物活性的研究早有报道。研究表明多糖的磷酸酯类衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节剂等生物活性。果糖、葡萄糖等单糖本身不具有抗肿瘤、抗病毒等生物活性，但对其磷酯化后就具有这些活性。Hayachi等发现葡萄糖基磷酸酯衍生物具有抗肿瘤、抗病毒等生物活性，并作为药物而应用于临床。磷酸果糖可用于治疗重型脑梗死、拮抗庆大霉素肾毒性以及用于辅助治疗心律失常等。陈茹玉等合成的N,N-二(2-氯乙基)果糖基磷酰胺酯的抗肿瘤活性实验结果表明该类化合物对L1210细胞和S-180腹水癌有一定的抑制作用。 

在糖基上引入磷酸根，可使一些本无活性的糖类化合物具有了活性，并能提高某些多糖、寡糖的生物活性。因此就很有必要研究各种寡糖、多糖及其类似物的磷酸酯的生理功能，以期能够找到磷酰化后产物的生理功能的一些规律，研究磷酸基团在生理功能中的作用，为设计生理活性更好的磷酸酯衍生物提供参考数据。 

由于从自然界分离得到的寡糖或多糖的磷酸酯数量有限，种类也不多，影响对糖的磷酸酯的生物活性及磷酸酯在生物体内的作用进行系统的研究，为了深入研究糖的磷酸酯衍生物，转向了人工合成。但用人工合成磷酸酯化龙眼肉多糖的方法尚未见有报道。 

发明内容

本发明目的是提供一种磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法，它能够用人工合成的方法制备磷酸酯化龙眼肉多糖。 

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种磷酸酯化龙眼肉多糖，该多糖由葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸、果糖和山梨糖组成，磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518.5。 

该多糖的结构片段为： 

所述的磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，包括如下步骤： 

（1）龙眼肉多糖分离提取 

将龙眼干果剥壳去核，按质量体积比为龙眼肉：蒸馏水=1：4，采用热水提取，控制温度在90℃下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，65℃下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍于其体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼肉粗多糖， 

（2）除蛋白及色素 

称取一定量的龙眼肉粗多糖用蒸馏水配制成5.00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为1g/ml，然后置于50℃恒温水浴锅中保温3h，最后于100℃灭酶5min，4000r/min离心15min，去掉沉淀物，合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液，将已去除蛋白的粗龙眼肉多糖配成5.00g/ml的水溶液，滴加30%H₂O₂去除色素，用量为多糖溶液体积的15.00%，用0.10mol/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8.0，于45℃水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0，4h后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5.00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35～40%，在冰箱中4℃放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45℃减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖， 

（3）去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化 

二乙胺基乙基纤维素作为柱填料，柱参数为：Φ2.5cm×40cm，分别用双馏水、0.125mol/L的NaCl、0.30mol/L的NaOH溶液作为洗脱液进行洗脱，控制流速6s/滴，每10ml收集一管，用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测，合并正态峰的收集液，50℃减压浓缩，浓缩液透析48小时后再浓缩、干燥，得到氯化钠馏分的龙眼肉多糖， 

（4）氯化钠流分的龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化 

取氯化钠流分的龙眼肉多糖，用Φ2.0cm×40cm的丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱作进一步纯化，洗脱液为蒸馏水，洗脱条件为1滴/4s，洗脱流分分别进行减压浓缩后进行醇沉，离心，沉淀 真空干燥，取第一个洗脱流分干燥后的多糖，命名为龙眼肉多糖A，并用龙眼肉多糖A进行磷酸酯化， 

（5）磷酸酯化龙眼肉多糖的合成 

配制0.025g/ml的龙眼肉多糖A溶液，取1.00ml磷酸酯化试剂POCl₃，加入3ml的吡啶，0℃反应15min后，缓慢加入0.025g/ml的龙眼肉多糖A溶液20.0ml，在0℃下进行反应60min，再加入浓度为10mol/L的NaOH溶液调至pH=7.0，再透析24h，除去游离的磷、盐和吡啶，透析结束后，倾出溶液，加入1.5倍于倾出溶液的无水乙醇，醇沉，3000r/min离心10min，取沉淀物，再用90%的乙醇洗涤沉淀物3次，45℃减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。 

本发明的有益效果在于： 

1.利用人工合成方法制备出磷酸酯化龙眼肉多糖。 

2.通过核磁共振、高效液相色谱、红外光谱初步分析龙眼肉多糖A的化学结构。并通过Sephadex G-100凝胶柱对磷酸酯化龙眼肉多糖进行分子量测定，红外光谱确定磷酸酯化龙眼肉多糖的结构。 

附图说明

图1是龙眼肉多糖A完全水解后的高效液相图谱。 

图2是单糖标准品的高效液相色谱图。 

图3是龙眼肉多糖A的¹³C-NMR。 

图4是龙眼肉多糖A的DEPT135。 

图5是龙眼肉多糖A的HMBC。 

图6是龙眼肉多糖A的¹HNMR。 

图7是龙眼肉多糖A的红外图谱。 

图8是磷酸酯化龙眼肉多糖后红外图谱。 

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。 

本发明所述磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，包括如下步骤： 

（1）龙眼肉多糖分离提取 

将龙眼干果剥壳去核，按质量体积比为龙眼肉：蒸馏水=1：4，采用热水提取，控制温度在90℃下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，65℃下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍于其体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼肉粗多糖， 

（2）除蛋白及色素 

称取一定量的龙眼肉粗多糖用蒸馏水配制成5.00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为1g/ml，然后置于50℃恒温水浴锅中保温3h，最后于100℃灭酶5min，4000r/min离心15min，去掉沉淀物，合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液，将已去除蛋白的粗龙眼肉多糖配成5.00g/ml的水溶液，滴加30%H₂O₂去除色素，用量为多糖溶液体积的15.00%，用0.10mol/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8.0，于45℃水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0，4h后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5.00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35～40%，在冰箱中4℃放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45℃减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖， 

（3）去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化 

二乙胺基乙基纤维素作为柱填料，柱参数为：Φ2.5cm×40cm，分别用双蒸水、0.125mol/L的NaCl、0.30mol/L的NaOH溶液作为洗脱液进行洗脱，控制流速6s/滴，每10ml收集一管，用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测，合并正态峰的收集液，50℃减压浓缩，浓缩液透析48小时后再浓缩、干燥，得到氯化钠流分的龙眼肉多糖， 

（4）氯化钠流分的龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化 

取氯化钠流分的龙眼肉多糖，用Φ2.0cm×40cm的丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱作进一步纯化，洗脱液为蒸馏水，洗脱条件为1滴/4s，洗脱流分分别进行减压浓缩后进行醇沉，离心，沉淀真空干燥，取第一个洗脱流分干燥后的多糖，命名为龙眼肉多糖A，并用龙眼肉多糖A进行磷酸酯化， 

（5）磷酸酯化龙眼肉多糖的合成 

配制0.025g/ml的龙眼肉多糖A溶液，取1.00ml磷酸酯化试剂POCl₃，加入3ml的吡啶，0℃反应15min后，缓慢加入0.025g/ml的龙眼肉多糖A溶液20.0ml，在0℃下进行反应60min，再加入浓度为10mol/L的NaOH溶液调至pH=7.0，再透析24h，除去游离的磷、盐和吡啶，透析结束后，倾出溶液，加入1.5倍于倾出溶液的无水乙醇，醇沉，3000r/min离心10min，取沉淀物，再用90%的乙醇洗涤沉淀物3次，45℃减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。 

单糖组成分析 

1.多糖的水解  精确称取龙眼肉多糖A50.0mg置安瓿中，加5mL1.0mol/L三氟乙酸，封管，置102℃烘箱内水解6h，冷却至室温，转移到10ml量瓶中，用3mol/LNaOH溶液中 和至pH=7.0后加水定容至刻度，摇匀，4000rpm离心10mim，取上清液作为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化的供试品溶液。 

2.衍生物的制备  配制对照品混合溶液，含甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖7种单糖对照品，每种单糖对照品的浓度均为0.2mg/ml，分别精密吸取供试品溶液和对照品混合溶液各0.4ml，置于不同的试管中，依次加入0.4mL0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液和0.4ml0.3mol/LNaOH溶液，混匀，置70℃水浴加热100min，并不时振摇，取出后室温冷却10min，用0.5ml0.3mol/L HCl溶液中和，并加双蒸水补充至2.0ml，加入5.0ml氯仿萃取，充分振荡，静置分层。取上层水相，过0.45μm微孔滤膜。 

3.色谱条件  色谱柱：Agilent TC-C18(4.6mm×250mm,5μm)；柱温：25℃；检测器为紫外检测器：PD-10A VP Plus；检测波长：250nm；进样量：10μl；流动相：0.05mol/L乙酸铵溶液+乙腈（80+20）；流速：1.0ml/min；洗脱时间：35min 

从图2中可以得出高效液相色谱各标准品的出峰时间：甘露糖10.8min、鼠李糖14.3min、半乳糖醛酸19.5min、葡萄糖21.8min、半乳糖24.6min、木糖26.3min、阿拉伯糖27.0min。龙眼肉多糖A完全水解液高效液相分析图的洗脱峰与标准品洗脱峰对比，葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸三种单糖洗脱保留时间一致，且峰形明显，初步说明龙眼肉多糖A主要由葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸等组成。 

核磁共振NMR分析龙眼肉多糖A结构 

¹HNMR测试条件为600MHz，22℃，溶剂为DMSO-d₆，¹³CNMR测试条件为125MHz，22℃，溶剂为DMSO-d₆。 

由图6¹HNMR可知，龙眼肉多糖A异头氢的化学位移：5.27ppm，5.09ppm为α-吡喃型糖残基的异头氢，4.51ppm为β-吡喃型糖残基的异头氢。 

由图3¹³CNMR(125MHz，22℃，DMSO-d₆)和图4DEPT135可知，103.60ppm，98.03ppm，95.82ppm，92.13和92.02为糖环异头碳。103.60ppm，98.03ppm的C在DEPT135中不出现峰，说明这两个化学位移的C是季碳，103.60ppm为果糖的异头碳，98.03ppm为山梨糖的异头碳，90~67ppm的C峰为正峰，是糖环上的次甲基的碳，60~65ppm的C峰为负峰，是糖环上亚甲基的碳。179.93ppm是半乳糖醛酸6位上的C，71.11ppm为半乳糖醛酸4为上的C，从图5HMBC确定糖环的链接方式。 

表1为龙眼肉多糖A的¹H NMR和¹³C NMR化学位移归属， 

表2为龙眼肉多糖A的HMBC数据分析。 

表1龙眼肉多糖A的¹H NMR和¹³C NMR化学位移 

表2龙眼肉多糖A的HMBC数据分析 

龙眼肉多糖A结构片段： 

磷酸酯化龙眼肉多糖合成的具体方法： 

运用Design Expert8.0.6软件对磷酸酯化反应条件进行优化，选择中心复合模型Box-Behnken建立实验数学模型，选取吡啶/POCl₃的体积比，反应的温度，反应的时间为影响因素，磷酸酯化取代度为响应值，进行编码和结果分析，模型分析得出的最佳反应条件： 吡啶/POCl₃=3.05:1，反应温度为-0.60℃，反应时间为59.82min。根据实验室条件，实验采用吡啶/POCl₃=3:1，反应温度为0℃，反应时间为60min，用此条件反应，重复3次，平均取代度为0.0184，实验结果与模型预测值0.0183851比较，在实验的误差范围之内。 

1.固定磷酸酯化试剂POCl₃为1.00ml，加入3倍体积比的吡啶，0℃反应15min。 

2.0.5000g的龙眼肉多糖A，加入20.0ml蒸馏水，超声助溶，功率40w。 

3.将溶解的龙眼肉多糖A溶液缓慢加入POCl₃-吡啶混合物中，在0℃下进行反应60min。 

4.反应结束后，往反应液中加入10mol/L的NaOH溶液调至pH=7.0，再透析24h，以除去游离的磷，盐和吡啶。 

5.透析结束后，倾出溶液，加入1.5倍的无水乙醇，醇沉，3000r/min离心10min，取沉淀，再用90%的乙醇洗涤沉淀3次，45℃减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。 

磷酸酯化前后红外光谱分析 

在干燥灯下，分别取于45℃减压干燥至恒重的经纯化后的龙眼肉多糖A和磷酸酯化龙眼肉多糖样品，分别加入干燥的KBr于玛瑙研钵轻轻研磨均匀，经压片机压成透明薄片，在4000-400cm^-1下扫描，扣除空气空白背景后得到龙眼肉多糖A和磷酸酯化龙眼肉多糖的红外扫描图谱。 

由图7可知，3436.92cm^-1为-OH的伸缩振动的吸收峰，表明多糖存在分子内的氢键；2931.02cm^-1为C-H不对称伸缩振动峰，其吸收峰较弱，是糖类的特征峰；1615.40cm^-1是羰基C=O伸缩振动峰；1417.87cm^-1是羧基C=O对称伸缩振动峰，说明龙眼肉多糖A是酸性多糖；1384.42cm^-1是KBr中的杂质峰；1144.51cm^-1、1099.98cm^-1、1015.72cm^-1的吸收峰是吡喃糖苷类特征峰；956.30cm^-1为α-D-吡喃糖端基异构体的吡喃环振动吸收峰；894.21cm^-1左右处吸收是β-D吡喃糖键的特征吸收峰；837.66cm^-1为α-D-葡萄吡喃糖苷的特征吸收峰；根据红外图谱推测龙眼肉多糖A是含有β-D型吡喃糖和α-D型端基吡喃糖的酸性多糖。 

由图8可知，磷酸酯化龙眼肉多糖除保持着原龙眼肉多糖A的红外特征峰，除P-O-C的特征吸收峰与吡喃糖环上的C-O-C、C-OH的特征吸收峰重合，不易看出外，1740.64cm^-1为羧基C=O伸缩振动峰，说明在磷酸酯化反应的过程中有糖环水解开环生成醛酸，1259.86cm^-1为P=O的特征吸收峰，535.11cm^-1处有磷酸酯键的特征吸收峰，证明磷酸基与龙眼肉多糖A结合成酯。 

磷酸酯化龙眼肉多糖分子量的测定 

1.葡聚糖凝胶G-100凝胶柱的填装选用Φ2.0cm×40cm层析柱，关闭止水夹后，加蒸馏水至1/2柱高，把预处理好的葡聚糖凝胶G-100混悬液缓慢搅拌倾入柱内，当沉降的凝胶高度达3cm左右时，打开止水夹控制流速以使填料均匀沉降。当填料沉降至一定高度后检查柱面是否平整，以恒定流速，以蒸馏水平衡24h。 

2.柱平衡后，依次精确称取T系列标准葡聚糖T-500、T-70、T-40、T-10及磷酸酯化龙眼肉多糖各5.00mg，用1ml0.1mol/L NaCl溶解后，分别上样，以0.1mol/L NaCl溶液为洗脱液，分别过葡聚糖凝胶G-100凝胶柱，以6.8s/滴的速度每6ml收集一管，用浓硫酸-苯酚法测每管吸光度值。计算各T系列标准葡聚糖及磷酸酯化龙眼肉多糖经过凝胶柱的洗脱体积Ve。最后精确称取蓝色葡聚糖5.00mg用0.1mol/LNaCl溶解后上柱求得柱的外水体积Vo，即Ve：自上样开始到出现最大峰所流出的体积，Vo：为柱床内存在于凝胶外面的水相体积。 

3.分子量标准曲线的绘制：以Ve/V₀为横坐标，lgM为纵坐标绘制多糖分子量测定标准曲线，M为标准T系列葡聚糖的分子量：葡聚糖T-500分子量为500000，葡聚糖T-70分子量为70000，葡聚糖T-40分子量为40000，葡聚糖T-10分子量为10000。 

通过实验得出分子量标准曲线方程为：y=-2.1919x=14.294，R²=0.9927，磷酸酯化龙眼肉多糖的Ve=58.0ml，代入方程计算出磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518.5。 

磷酸酯化龙眼肉多糖取代度的测定 

1.最大吸收峰测定：用可见分光光度计对磷酸钼进行扫描，得出最大吸收峰波长824nm。 

2.称取无水正磷酸二氢钾0.4393g，溶解于双蒸水，再移入1000mL容量瓶中，定容摇匀，配制成磷含量为100μg/ml的磷储备液。 

3.将质量分数为96%，密度为1.84g/ml的硫酸与质量分数为65%，ρ₂₀=1.38g/ml的硝酸等体积混合配制成硫酸-硝酸溶液。 

4.吸取10.00ml储液注入250ml的容量瓶内，定容摇匀，配制成lml含4μg磷的磷标准溶液。 

5.钼酸铵溶液的制备：将10.6g钼酸铵四水化合物(NH₄)₆·Mo₇O₂₄·4H₂O，溶解于500ml蒸馏水中，移入1000ml烧瓶，再加入500ml的10mol/L硫酸溶液使之混合并冷却至室温。 

6.磷含量标准曲线的绘制：7只50ml的锥形瓶，分别加入磷标准溶液0.00ml、1.00ml、 2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml和10.00ml于7只锥形瓶内，它们分别对应于4μg、8μg、12μg、16μg、20μg和40μg的磷，加蒸馏水补至每只瓶的溶液体积为30ml，并混合均匀。用移液管依次向锥形瓶内加入4.00ml钼酸铵溶液和2.00ml浓度为50g/L抗坏血酸溶液，摇匀。将以上7份反应液分别置于沸水浴中加热10min，取出立刻放入冷水浴中使之冷却至室温，转移入50ml容量瓶中，加水至刻度、混合均匀。以空白溶液作为对照溶液，用分光光度计在最大吸收波波长处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，磷含量为横坐标，再用Excel对标准曲线散点图进行线性回归，得到二者的线性关系方程式。 

7.样品总磷含量的测定：称取30.0mg的磷酸酯化龙眼肉多糖，将所称样品倒入消化瓶内，加入1.50ml硫酸-硝酸混合溶液，逐渐加热消化至瓶内液体微沸，继续煮沸至棕色气体变成白色，液体变成澄清为止，目的在于除去过量的HNO₃。待消化液冷却到室温后，加入4.50ml蒸馏水，用10mol/L氢氧化钠溶液将pH值调至7.0，再将瓶内溶液移入50ml的容量瓶内，加水至刻度，并充分摇匀。吸取15.00ml样品液于50ml锥形瓶内，按次序先加入4.00ml钼酸铵，再加入2.00ml抗坏血酸溶液，加入后立刻混合将锥形瓶置于沸水浴中加热10min。再放入冷水浴中使之冷却到室温，移入50ml容量瓶中，定容摇匀。用分光光度计在最大吸收波长下测定该溶液的吸光度，并从标准曲线趋势线中计算出相应的磷含量。样品进行三次平行测定，取平均值。 

8.取代度Ds的计算：磷总含量X 

$X=\frac{m_1\×V_0\×100}{m_0\×V_1\×{10}^6}$

X-样品磷总含量，% 

m₁-从标准曲线的趋势线计算得出的样品液中磷质量，μg； 

V₀—样品液的定量体积，ml； 

m₀-试验样品的质量，g； 

V₁-用于测定的样品液的等分体积，ml。 

取代度Ds 

$\mathrm{Ds}=\frac{5.23\×X}{100-3.32\×X}$ 。

Claims (3)

1.一种磷酸酯化龙眼肉多糖，其特征在于，该多糖由葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸、果糖和山梨糖组成，磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518.5。

2.一种磷酸酯化龙眼肉多糖，其特征在于，该多糖的结构片段为：

3.如权利要求1所述的磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）龙眼肉多糖分离提取

将龙眼干果剥壳去核，按质量体积比为龙眼肉：蒸馏水=1：4，采用热水提取，控制温度在90℃下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，65℃下旋转蒸发仪减压浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍于其体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼肉粗多糖，

（2）除蛋白及色素

称取一定量的龙眼肉粗多糖用蒸馏水配制成5.00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为1g/ml，然后置于50℃恒温水浴锅中保温3h，最后于100℃灭酶5min，4000r/min离心15min，去掉沉淀物，合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液，将已去除蛋白的粗龙眼肉多糖配成5.00g/ml的水溶液，滴加30%H₂O₂去除色素，用量为多糖溶液体积的15.00%，用0.10mol/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8.0，于45℃水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0，4h后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5.00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35～40%，在冰箱中4℃放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45℃减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖，

（3）去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化

用二乙胺基乙基纤维素作为柱填料，柱参数为：Φ2.5cm×40cm，分别用双馏水、0.125mol/L的NaCl、0.30mol/L的NaOH溶液作为洗脱液进行洗脱，控制流速6s/滴，每10ml收集一管，用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测，合并正态峰的收集液，50℃减压浓缩，浓缩液透析48小时后再浓缩、干燥，得到氯化钠流分的龙眼肉多糖，

（4）氯化钠流分的龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化

取氯化钠流分的龙眼肉多糖，用Φ2.0cm×40cm的丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱作进一步纯化，洗脱液为蒸馏水，洗脱条件为1滴/4s，洗脱流分分别进行减压浓缩后进行醇沉，离心，沉淀真空干燥，取第一个洗脱流分干燥后的多糖，命名为龙眼肉多糖A，并用龙眼肉多糖A进行磷酸酯化，

（5）磷酸酯化龙眼肉多糖的合成

配制0.025g/ml的龙眼肉多糖A溶液，取1.00ml磷酸酯化试剂POCl₃，加入3ml的吡啶，0℃反应15min后，缓慢加入0.025g/ml的龙眼肉多糖A溶液20.0ml，在0℃下进行反应60min，再加入浓度为10mol/L的NaOH溶液调至pH=7.0，再透析24h，除去游离的磷、盐和吡啶，透析结束后，倾出溶液，加入1.5倍于倾出溶液的无水乙醇，醇沉，3000r/min离心10min，取沉淀物，再用90%的乙醇洗涤沉淀物3次，45℃减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。

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