CN108546305A - 一种发芽糙米多糖组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种发芽糙米多糖组合物及其制备方法和应用。本发明提供了一种发芽糙米多糖组合物，包括鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，所述鼠李糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为8.1～8.5:4.3～4.7:9.9～10.3。本发明提供的发芽糙米多糖组合可通过抑制α‑葡萄糖苷酶活性和促进细胞的葡萄糖消耗两种途径降低血糖。

Description

一种发芽糙米多糖组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种发芽糙米多糖组合物及其制备方法和应用。

技术背景

糖尿病是继癌症和心血管疾病后第三严重的慢性疾病，严重地危害着人类的健康。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为一类治疗糖尿病的新型降血糖药物已广泛应用，临床药物多为化学合成的，存在价格昂贵和副作用大的缺点。

发芽糙米中含有大量的生理活性成分如GABA，膳食纤维，γ-谷维素等，具有抗氧化，降低血脂、降血压、降血糖等作用，是α-葡萄糖苷酶抑制剂的天然植物性来源。现阶段对于发芽糙米的提取，一般以获取得到多糖组合物即可，主要研究的是其收率的问题，对于提取出的具有降血糖活性的多糖成分的具体活性成分并没有深入研究和报道；仅从现有技术中获得的多糖虽然也具备降血压、降低血脂、降血糖等活性功能，但其降血糖组成成分不明确，降低血糖的效果还得不到实际应用。

发明内容

为了开发新的降糖功能因子，同时为了促进发芽糙米综合利用，使稻米深加工产业向着高利用、高增值方向发展，本发明提供了一种发芽糙米多糖组合物及其制备方法和应用。

本发明提供了一种发芽糙米多糖组合物，所述发芽糙米多糖组合物包括鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，所述鼠李糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为8.1～8.5:4.3～4.7:9.9～10.3。

本发明还提供了上述发芽糙米多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)提取发芽糙米总多糖，得到发芽糙米总多糖提取液；

2)将步骤1)的发芽糙米总多糖提取液进DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换树脂柱，上柱后先用去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱，收集所述NaCl溶液的洗脱液，脱盐。

优选的，上述发芽糙米多糖组合物的制备方法还包括步骤3)：用Sepharose CL-6B凝胶柱对步骤2)所述脱盐后的洗脱液进行纯化：上柱后用先去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱；收集所述NaCl溶液的洗脱液，脱盐。

优选的，步骤3)所述脱盐后还包括真空冷冻干燥的步骤。

优选的，步骤1)所述提取发芽糙米总多糖的步骤包括：将发芽糙米粉在水中超声处理，超声处理后的料液中加入0.5～3.5％质量百分比的纤维素酶酶解，得到发芽糙米总多糖提取液。

优选的，所述超声处理的超声功率为150～250w，时间为20～40min；所述超声处理的处理温度为40～60℃。

优选的，所述酶解的pH值为4.0～7.0；酶解温度为35～65℃，时间为0.5～3.5h。

优选的，所述酶解后，还包括脱色和脱蛋白步骤。

本发明还提供了上述发芽糙米多糖组合物以及上述制备方法制得的发芽糙米多糖组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

有益效果：

本发明提供的发芽糙米多糖组合物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达到57.36％；对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗也有明显促进作用。本发明提供的发芽糙米多糖组合物能通过抑制α-葡萄糖苷酶活性和促进细胞的葡萄糖消耗两种途径降低血糖，使胰岛素抵抗HepG2细胞的糖原含量显著提高，胰岛素抵抗的缓解作用显著，明显改善了胰岛素抵抗的糖原含量。本发明提供的发芽糙米多糖组合物在浓度为50mg·L^-1时的降血糖作用效果最接近二甲双胍。

附图说明

图1为本发明实施例2所述DEAE Sepharose CL-6B洗脱曲线；

图2为本发明实施例2所述Sepharose CL-6B洗脱曲线；

图3为本发明实施例3所述结构表征中的标准单糖液相色谱图；

图4为本发明实施例3所述结构表征中的发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3的液相色谱图；

图5为本发明实施例3所述结构表征中的发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3的红外谱图；

图6为本发明实施例3所述结构表征中的发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3的¹H-NMR谱图；

图7为本发明实施例4所述各组分多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；

图8为本发明实施例4所述发芽糙米多糖组分SPS-1的浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制作用影响；

图9为本发明实施例6所述多糖组分SPS-1对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型丙酮酸激酶的影响；

图10为本发明实施例6所述多糖组分SPS-1对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型己糖激酶激酶的影响；

图11为本发明实施例6所述多糖组分SPS-1对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型糖原合成的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种发芽糙米多糖组合物，所述发芽糙米多糖组合物包括鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，所述鼠李糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为8.1～8.5:4.3～4.7:9.9～10.3；优选的，所述鼠李糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为8.3:4.5:10.1。

本发明提供的发芽糙米多糖组合物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达到57.36％；对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗也有明显促进作用。本发明提供的发芽糙米多糖组合物能通过抑制α-葡萄糖苷酶活性和促进细胞的葡萄糖消耗两种途径降低血糖，使胰岛素抵抗HepG2细胞的糖原含量显著提高，胰岛素抵抗的缓解作用显著，明显改善了胰岛素抵抗的糖原含量。本发明提供的发芽糙米多糖组合物在浓度为50mg·L^-1时的降血糖作用效果最接近二甲双胍。

本发明还提供了上述发芽糙米多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)提取发芽糙米总多糖，得到发芽糙米总多糖提取液；

2)将步骤1)的发芽糙米总多糖提取液进DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换树脂柱，上柱后先用去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱，收集所述NaCl溶液的洗脱液，脱盐。

在本发明中，步骤1)所述提取发芽糙米总多糖的步骤优选包括：将发芽糙米粉在水中超声处理，超声处理后的料液中加入0.5～3.5％质量百分比的纤维素酶酶解，得到发芽糙米总多糖提取液。

本发明所述发芽糙米优选为20～30℃条件下发芽8～16h的发芽糙米，更优选为28℃下发芽12h的发芽糙米。本发明将发芽糙米在水中超声处理，超声处理前优选对所述发芽糙米粉碎处理，所述粉碎的粒径优选过150目筛，更优选为过200目筛；所述发芽糙米粉与水的体积比优选为1:(5～15)，更优选为1:10。本发明所述超声处理的超声功率优选为150～250w，更优选为200w；所述超声处理的时间优选为20～40min，更优选为30min；所述超声处理的温度优选为40～60℃，更优选为50℃。

本发明在超声处理后的料液中加入0.5～3.5％质量百分比的纤维素酶酶解，所述纤维素酶的添加量优选为1.5～2.5％，更优选为2％。本发明所述酶解的pH值优选为4.0～7.0，更优选为4.5；酶解温度优选为35～65℃，更优选为55℃；酶解时间优选为0.5～3.5h，更优选为2.5h。采用本发明提供的方法提取发芽糙米总多糖，其多糖提取率较常规方法高，最高为24.8％。

本发明优选对酶解后的料液进行脱色、脱蛋白处理；优选的，所述脱蛋白步骤在脱色之后进行。本发明对具体的脱色、脱蛋白处理方法没有特别限定，本领域常规方法即可。所述脱蛋白处理可以减少后续过柱分离时出现的杂峰。

在本发明中，步骤2)所述上柱前，优选将发芽糙米总多糖提取液真空冷冻干燥，然后溶于去离子水中，配为一定浓度的多糖溶液，所述多糖溶液的浓度优选为10～30mg/mL，更优选为20mg/ml。本发明优选对上述配制好的总多糖溶液离心去杂处理，所述离心的转速优选为7000～9000r/min，更优选为8000r/min；所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。本发明将离心后的上清液进DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换树脂柱。

上柱后，本发明先用去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱。本发明所述去离子水和NaCl溶液洗脱时的体积用量优选为上样量的30～40倍，更优选为上样量的37.5倍；所述洗脱的流速优选为4～6mL/min，更优选为5mL/min。所述NaCl溶液的浓度优选为0.1mol/L。本发明单独收集NaCl溶液洗脱液，脱盐，制得所述发芽糙米多糖组合物。本发明对具体的脱盐方法没有特别限定，本领域常规方法即可。在本发明的实施例中，选用Sephadax G50柱进行脱盐处理。

在本发明更优选的方式中，上述技术方案脱盐后，还包括步骤3)：用SepharoseCL-6B凝胶柱对上述脱盐处理后的洗脱液进行纯化：上柱后用先去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱，收集NaCl溶液的洗脱液，脱盐。

在本发明中，步骤3)所述上柱前，优选将脱盐处理后的洗脱液真空冷冻干燥，然后溶于去离子水中，配为一定浓度的多糖溶液，所述多糖溶液的浓度优选为15～25mg/mL，更优选为20mg/ml。本发明优选对上述配制好的总多糖溶液离心去杂处理，所述离心的转速优选为3500～4500r/min，更优选为4000r/min；所述离心的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明将离心后的上清液进Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱。

上柱后，本发明先用去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱。本发明所述去离子水和NaCl溶液洗脱时的体积用量优选为上样量的30～40倍，更优选为上样量的37.5倍；所述洗脱的流速优选为4～6mL/min，更优选为5mL/min。所述NaCl溶液的浓度优选为0.1mol/L。本发明单独收集NaCl溶液洗脱液，脱盐，制得所述发芽糙米多糖组合物。本发明对具体的脱盐方法没有特别限定，本领域常规方法即可。在本发明的实施例中，选用Sephadax G50柱进行脱盐处理。

在本发明中，步骤3)所述脱盐后优选进行真空冷冻干燥，以便储存。

本发明还提供了上述发芽糙米多糖组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，以上述发芽糙米多糖组合物为唯一活性成分，或以上述发芽糙米多糖组合物搭配其他活性成分，结合本领域可接受的药物载体，制得α-葡萄糖苷酶抑制剂。在本发明中，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂中的发芽糙米多糖组合物的质量分数优选为0.1～99.9％；所述其他活性成分与所述发芽糙米多糖组合物的质量比为0.01～100:1。

下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

超声波辅助纤维素酶法提取发芽糙米总多糖，得到粗纯化后的多糖样品。

1)使用龙粳稻米为原料，砻谷得到糙米，28℃发芽12h制得发芽糙米。

2)取发芽糙米粉5.0g，加入蒸馏水，料液体积比1:10，超声波功率200w，超声波超声时间30min，超声温度50℃，冷却至室温后，添加2％质量百分数的纤维素酶，在pH值4.5、55℃条件下酶解2.5h，得到发芽糙米总多糖提取液。

3)按照如下公式计算发芽糙米多糖提取率：

结果：发芽糙米的多糖提取率为24.8％。

4)精密称取经预处理的AB-8树脂20ml，湿法装柱，柱下端塞入脱脂棉并压平，待柱内树脂稳定后，将4BV的2mg·mL^-1的粗多糖溶液(发芽糙米总多糖提取液真空冷冻干燥后加入去离子水配制获得)以2BV的速度进行脱色，待样品液完全进入柱内后，用2倍上样体积的蒸馏水进行冲洗，收集脱色后液浓缩至上样体积，测定大孔树脂吸附法多糖的脱色率、多糖损失率。结果：大孔树脂AB-8脱色率86.7％；多糖损失率19％。

5)精确配制10mg·ml^-1的多糖溶液(发芽糙米总多糖提取液真空冷冻干燥后加入去离子水配制获得)，加入其体积比1/5的三氯甲烷-正丁醇(4:1)溶液，振摇30min，离心，上清液再加入多糖溶液1/5体积的三氯甲院-正丁醇(4:1)溶液，反复多次脱蛋白处理，弃去多糖溶液与有机试剂间的胶状变性蛋白质层，计算Sevag法的多糖脱蛋白率、多糖损失率。结果：Sevag法脱蛋白率为84.3％；多糖损失率为18.3％。

实施例2

发芽糙米总多糖的精细分离

A.DEAE-Sepharose CL-6B层析

将溶胀好的凝胶DEAE-Sepharose CL-6B取出后，加水与凝胶体积比例为1:3，搅拌混匀凝胶后，超声去除气泡，湿法装柱(Φ26mm×300mm)，用水洗脱过夜。将实施例1得到的粗纯化后的多糖样品溶解在蒸馏水中，将其配为浓度为20mg/mL多糖溶液，用离心机8000r/min离心10min，取4mL上清液上样，流速5mL/min，每管收集5mL，用蒸馏水洗脱收集30管后，再用0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl分别进行梯度洗脱，每个梯度依次接收30管，用苯酚-硫酸跟踪检测含糖管A490，做出梯度洗脱曲线，对发芽糙米进行层析纯化。

按照洗脱曲线收集各个主峰，分离图如图1所示：去离子水洗脱出一种成分多糖，其含量为32.82％，经不同浓度的NaCl梯度洗脱，得到三种组分多糖，含量分别9.91％、8.15％、7.42％。对收集后的洗脱液减压浓缩后，Sephadex G50脱盐，收集脱盐后的各组分多糖真空冷冻干燥。

B.Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶层析

将DEAE-Sepharose CL-6B层析分级分离的多糖继续用凝胶柱进行纯化。采用湿法装柱(Φ26mm×600mm)的方法，将溶胀好的凝胶填料用玻璃棒引流沿柱内壁缓慢填入避免产生气泡，用蒸馏水不断的洗脱使填料达到稳定状态。将DEAE-Sepharose CL-6B分离的多糖各个级分，溶于蒸馏水中，4000r/min离心20min，取上2mL上清液上Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱，0.1mol/L的NaCl洗脱，流速1mL/min，2mL/管收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测含糖管，绘制洗脱曲线。

按照洗脱曲线收集各个主峰，如图2所示：去离子水洗脱多糖得到一个组分为WPS，含量为24.16％；0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/LNaCl溶液梯度分别得到三个组分SPS-1、SPS-2、和SPS-3，含量分别为8.28％、7.09％、5.94％。对收集后的洗脱液减压浓缩后，Sephadex G50脱盐，浓缩后真空冷冻干燥备用。

实施例3

对实施例2所述发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3进行结构表征。

采用高效液相色谱法，单糖对照品为鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)。称取2mg样品于安瓶瓶中，加入2mL三氟乙酸，封管，置于110℃烘箱中酸解7h，待反应完全后冷却至室温，用氮吹仪吹干，即可得到水解后的单糖混合物。加少量蒸馏水溶解，用0.1mol/LNaOH调样品pH至中性，用水定容至1mL备用。

分别精密称取标准单糖等摩尔混合配制成浓度为2mmol/L的标准单糖混合溶液。经纯化的发芽糙米多糖用2mo1/L H₂SO₄在100℃封管水解8h，水解产物经BaCO₃中和，得到的单糖样品进行测定。流动相为乙睛：水＝8：2(体积比)；流速为1mL/min；柱温为室温；进样量20mL。红外光谱检测：分别将1.00mg的干燥发芽糙米多糖粉末与溴化钾(KBr)粉末混合于玛瑙研钵上研磨均匀，在压力8Mpa左右的压片机上进行压片，5min后样品放入样品室的光路中，操作OPUS软件，使红外光谱仪在4000～400cm^-1波长范围内进行光谱扫描。发芽糙米多糖核磁共振光谱检测：取各个组分发芽糙米多糖样品20mg经D₂O交换3次后，溶于0.5mL D₂O中，用BRUKER 400核磁共振仪，测定¹H-NMR(频率400MHz，温度296.9K)，并对结果进行分析。

发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3高效液相色谱分析如图3、图4和表1所示。

表1发芽糙米多糖单糖组成分析结果

结果表明，水洗多糖WPS由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成的。摩尔比为7.8:9.1:6.3:3.9:4.4；盐洗多糖SPS-1由鼠李糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔比为8.3:4.5:10.1；盐洗多糖SPS-2由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔比为10.3:7.9:6.7:4.1；盐洗多糖SPS-3由鼠李糖、阿拉伯糖、和葡萄糖组成，摩尔比4.8:2.2:6.5。

发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3红外光谱图如图5和表2所示。

表2发芽糙米多糖各组分红外分析结果

结果表明：发芽糙米多糖的各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3在红外4000cm～1400cm^-1的扫描范围内都表现出了聚糖分子很明显的吸收峰，糖类分子中的O-H伸缩振动峰在光谱中3390cm^-1附近；C-H伸缩振动峰在光谱中2925cm^-1附近；C＝O伸缩振动峰在光谱中1650～1540cm^-1附近；C-H变角振动峰在光谱中1420cm^-1附近出现；C-O-C、C-O-H的伸缩振动峰在光谱中1160～1020cm^-1附近出现；在800～1200波长范围内，每一特定的多糖特征峰出现的位置强度都具有高度的专一性，其中水洗多糖组分在红外光谱中1200～1000cm^-1之间有三个明显的吸收峰，这三个吸收峰一般是吡喃糖环结构的吸收峰，表明水洗多糖中吡喃糖环的结构较多，水洗多糖组分在952.37cm^-1处出现明显的吸收峰，分析原因可能是醛基变角的振动，759.38cm^-1有明显的吸收峰，原因可能是因为吡喃糖对称环状的振动，因此水洗多糖中可能含有D-吡喃葡萄糖环状结构。1729.99cm^-1有明显的吸收峰，是因为有-COO的存在，因此SPS-2多糖组分中存在着糖醛酸。892.36、890.41、899.74cm^-1处的吸收峰是因为有β-糖苷键的存在，因此SPS-1、SPS-2、SPS-3三种组分的多糖都含有β-糖苷键的结构。由吡喃环a型C-H键变角振动所产生的吸收峰在860.33、844.61、828.99、851.37cm^-1处显示出来，说明α-糖苷键结构大量存在于水洗多糖的多糖组分中；而三种盐洗多糖(SPS-1、SPS-2、SPS-3)的多糖组分中不但有α-糖苷键还有β-糖苷键结构；SPS-2和SPS-3这两种盐洗多糖组分在815.39、817.01cm^-1处有吸收峰，分析原因可能是呋喃环中C₁-H的变角振动产生的吸收峰，因此这两种多糖组分中可能含有α-D甘露吡喃糖；各组分多糖分别在1018.97、1014.25、1018.39、1009.99cm^-1处有吸收峰，这个范围内的吸收峰是D-Glu的特征吸收峰；各多糖组分在1616cm^-1处没有明显的吸收峰，因为此范围内是氨基的特征吸收峰，所以说明发芽糙米多糖在前期纯化脱蛋白的效果比较好。828.99cm^-1处可能是α-D-Man的特征吸收峰，759.38cm^-1处可能是α-D-Xyl的特征吸收峰。

发芽糙米多糖各组分WPS、SPS-1、SPS-2、SPS-3各组分核磁共振如图6所示。通过¹H-NMR谱可以研究发芽糙米多糖中有关糖苷键构型的问题，在¹H-NMR中4.0～5.5ppm的区域是多糖的糖苷键中质子信号主要存在的区域，但因为质子信号间的重叠与干扰的缘故，导致分析¹H-NMR谱图不是很清晰，所以要在4.8～5.5ppm这段区域内对首碳上的特征信号进行分析判断。5.0ppm是区分吡喃糖构型的质子信号的临界值，若样品首碳上的质子位移大于5.0ppm为α-型糖苷，小于5.0ppm为β-型糖苷。另外从氢谱中也可以判断某种均一多糖是否存在六元环吡喃糖还是五元环呋喃糖，如5.4ppm附近出现质子信号并且J^1,2值小于2，则认为该物质属于呋喃糖。发芽糙米多糖各纯化组分的¹H-NMR图谱可以看出，4.70ppm附近的谱峰为溶剂D₂O中氘质子信号，WPS主要存在α-型糖苷构型，结合红外的分析结果推测该处信号可能是α-Araf-(1→引起；SPS-1、SPS-2和则均以α和β-型糖苷构型。4.90ppm、4.88ppm和4.85ppm可能是在β-Galp-(1→引起，SPS-2和SPS-3在1.79～2.04的微弱吸收峰可能存在乙酰基团，与红外图谱结果吻合。

实施例4

发芽糙米各组分多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

经柱层析分离纯化，洗脱出的各组分发芽糙米多糖干粉配置成浓度为0.5mg/mL，以阿卡波糖为对照组，测定各组分对α-葡萄糖苷酶的抑制情况。配置浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，调节pH 6.8，分别取出0.60mL磷酸缓冲液和0.20mL的α-葡萄糖苷酶溶液(0.2U/mL)与0.10mL的不同组分的发芽糙米各组分多糖溶液进行混合，混合均匀作为待测样品；将混合溶液放在37℃的水浴锅中，水浴加热10分钟后加入浓度为20mmol/L的PNPG溶液0.20mL。开始计时，5分钟后加入1mL浓度为1mol/L的Na₂CO₃溶液终止该反应。于405nm处测其吸光值，计算发芽糙米各组分多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率，筛选出对α-葡萄糖苷酶抑制作用最明显的多糖组分。

发芽糙米多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用影响如图7所示。经层析柱层析出的四个多糖组分对α-葡萄糖苷酶均有一定程度的抑制作用，盐洗脱出的SPS-3多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用最小，抑制率为18.87％；盐洗脱出来的SPS-1组分多糖对α-葡萄糖苷酶抑制抑制率最大抑制率为57.36％，表明盐洗脱出来的SPS-1多糖组分中的酶抑制物质的含量较高。而SPS-3多糖组分中酶抑制物质的含量最小；0.1mol/L的NaCl溶液能够将大部分被吸附的酶抑制物质洗脱下来；水洗多糖组分和SPS-2多糖组分中酶抑制物质含量相似，对α-葡萄糖苷酶抑制率基本相同。

发芽糙米多糖组分SPS-1对α-葡萄糖苷酶抑制率的测定如图8所示。从图中可以看出，作用在0～0.6mg/mL范围内，随着多糖浓度的增加其对α-葡萄糖苷酶抑制率随之增加。多糖浓度在0mg/mL～0.6mg/mL范围内，其浓度抑制率呈线性相关，其回归方程为y＝6.163x+20.22，R²＝0.993，求其IC₅₀是0.28mg/mL。在0.6mg/mL～1.0mg/mL范围内，随着发芽糙米多糖浓度的增大，α-葡萄糖苷酶抑制率趋于平稳，在浓度为0.6mg/ml时发芽糙米多糖对α-葡萄糖苷酶抑制率与对照药品阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率基本相同。因此总体上发芽糙米多糖具有较好的酶抑制活性，并且在浓度为0.6mg/mL时抑制效果最好。

实施例5

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的发芽糙米多糖组分对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

A.HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

将处于对数生长期的HepG2细胞消化后，用含2％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为10⁶个L^-1，转入96孔板中。培养细胞至单层可以贴壁后，将含有胰岛素的培养液加入到细胞中，未加入胰岛素的细胞作为对照，5％CO₂的培养箱中37℃孵育细胞36h。去掉培养液，用浓度为0.01mol·L^-1的PBS溶液进行洗涤，继续孵育20分钟。重复操作上述实验步骤两次，在由浓度为0.01mol·L^-1的PBS溶液洗涤后换上无血清的培养基，孵育24h。分别加入0、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8mol·L^-1浓度的胰岛素，每个样品三个平行对照。探究胰岛素最佳作用时间，设置5组，每组1个空白孔、1个孔加胰岛素，胰岛素的浓度为最佳浓度，5组的孵育时间分别为24h、24h、36h、48h、60h，每组三个平行对照。

B.对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

将处于对数生长期的HepG2细胞消化后，用含2％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为10^-6个L^-1，转入4个24孔板中，培养36h。在各组均包含浓度为10nmol·L^-1的胰岛素和均不添加胰岛素组的基础上，分别设置四组即空白对照组、胰岛素抵抗模型组、终浓度为10^{- 3}mol·L^-1的二甲双胍组和发芽糙米多糖处理组(发芽糙米多糖的浓度分别为1、5、10、50、100mg·L^-1)。检测12、24、36、48h后培养基中葡萄糖的含量，并计算各组细胞的葡萄糖消耗量(通过不铺细胞的空白孔为空白对照)，每组三个平行对照。

不加胰岛素组发芽糙米多糖组分SPS-1对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响结果如表3所示。

表3不加胰岛素组多糖组分SPS-1对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响结果表

加胰岛素组发芽糙米多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响结果如表4所示。

表4加胰岛素组多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响结果表

结果表明：不管是否存在胰岛素，发芽糙米具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的多糖组分SPS-1都可以较为明显的增加正常HepG2细胞和胰岛素抵抗HepG2细胞模型对葡萄糖的消耗量，可以使HepG2细胞得胰岛素抵抗作用增强，并且正常HepG2细胞和胰岛素抵抗HepG2细胞模型对葡萄糖的消耗程度都随着发芽糙米具有抑制α-葡萄糖苷酶活性多糖组分SPS-1浓度变化而变化，当多糖组分浓度为50mg·L^-1时，正常HepG2细胞和胰岛素抵抗HepG2细胞模型对葡萄糖消耗的程度最大。在存在胰岛素的条件下，二甲双胍可以很明显的使正常HepG2细胞和胰岛素抵抗HepG2细胞对葡萄糖的消耗量增大。说明发芽糙米具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的多糖组分SPS-1的功能与二甲双胍相似，但它们两者之间还存在着区别。在多糖组分SPS-1浓度为50mg·L^-1时作用效果最接近二甲双胍的作用效果。

实施例6

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的发芽糙米多糖组分SPS-1对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢的影响

为了进一步说明发芽糙米多糖组分SPS-1具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的多糖组分对HepG2细胞胰岛素抵抗的作用，本发明还研究了上述多糖组分SPS-1对糖代谢过程中关键酶活性和糖原含量的影响：配制浓度为0.05mol/L的Tris-HCl溶液，和磷酸盐缓冲液(PBS)，调节PBS的pH到7，PBS起到匀浆介质的作用。将细胞取出到离心管中，1000r/min，离心10min，收集沉淀。加入0.7ml的PBS，轻轻将其混匀，再次1000r/min，离心10min，收集沉淀。采用超声细胞破碎仪对细胞进行破碎，超声功率为300W，超声时间为4秒，反复对细胞进行超声破碎操作四次，每次间隔30秒，超声过程在冰浴中进行。分别按照丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)试剂盒和己糖激酶(HK)试剂盒的说明书进行测试丙酮酸激酶和己糖激酶(hexokinase,HK)的酶活。

重复上述实验操作步骤，将细胞裂解液对细胞进行裂解，每管中加入碱溶液0.25ml并沸水浴20分钟，冷却到室温，加入双蒸水0.25ml，按照糖原试剂盒对HepG2细胞的糖原含量进行测试。

HK和PK是糖代谢过程中起到关键作用的两种酶。在糖酵解和糖原合成的过程中己糖激酶是起到关键作用的限速酶。而在糖酵解过程中丙酮酸激酶起到催化磷酸烯醇式丙酮酸的作用并将ADP转化为ATP，产生丙酮酸。有研究指出糖代谢过程中的关键酶HK、PK在胰岛素抵抗细胞中都会减少。

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的发芽糙米多糖组分SPS-1对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型丙酮酸激酶的影响如图9所示；对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型己糖激酶的影响如图10所示；对HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型糖原合成的影响如图11所示。

从图9～10中可以看出，胰岛素抵抗模型组与空白组的HK和PK活力值相比较，胰岛素抵抗模型组的HK和PK活力很明显的下降。随着时间的变化，在12h、24h，加入的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的发芽糙米多糖组分SPS-1能很快也很明显的提高了IR-HepG2细胞的PK活力，第一个时间点检测PK活力提高了18.21％，第二个时间点检测的PK活力提高了17.35％；同样在12h、24h这两个时间点对HK的活力进行检测，加入的多糖组分能很快也很明显的提高IR-HepG2细胞的HK活力，第一个时间点检测HK活力提高了11.35％，第二个时间点检测HK活力提高了10.47％。由此可见，发芽糙米多糖组分SPS-1使糖的酵解过程加快了，加大了细胞对葡萄糖的吸收。但经过36h后，HK和PK酶活力开始下降，在48h时检测两种酶活发现两种酶活都在下降，并且在48h，HK和PK酶活下降显著，分析原因可能是长时间培养使一部分酶失活，使其酶活力下降。

糖原的合成是胰岛素降低机体葡萄糖浓度的另外一条途径，由图11可知，模型组中IR-HepG2细胞糖原含量与对照组细胞糖原含量相比下降了16.92％。随着时间的变化，糖原的含量在加入发芽糙米多糖组分后，IR-HepG2细胞的糖原含量有着明显的上升，可见对缓解胰岛素抵抗起到了很明显的作用，提高了胰岛素抵抗的糖原含量。在作用了12h后糖原含量上升了19.35％。因为加入发芽糙米多糖组分SPS-1后，提高了HK与PK的活性，加快了糖酵解，使糖原含量升高。

以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种发芽糙米多糖组合物，其特征在于，所述发芽糙米多糖组合物包括提取自发芽糙米的鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，所述鼠李糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为8.1～8.5:4.3～4.7:9.9～10.3。

2.权利要求1所述发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取发芽糙米总多糖，得到发芽糙米总多糖提取液；

2)将步骤1)的发芽糙米总多糖提取液进DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换树脂柱，上柱后先用去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱，收集所述NaCl溶液的洗脱液，脱盐。

3.根据权利要求2所述的发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤3)：用Sepharose CL-6B凝胶柱对步骤2)所述脱盐后的洗脱液进行纯化：上柱后用先去离子水洗脱，再用0.08～0.12mol/L的NaCl溶液洗脱，收集所述NaCl溶液的洗脱液，脱盐。

4.根据权利要求3所述的发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，步骤3)所述脱盐后还包括真空冷冻干燥的步骤。

5.根据权利要求2～4任意一项所述的发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将发芽糙米粉在水中超声处理，超声处理后的料液中加入质量百分比为0.5～3.5％的纤维素酶酶解，得到发芽糙米总多糖提取液。

6.根据权利要求5所述的发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，所述酶解后，还包括将得到的酶解液脱色和脱蛋白。

7.根据权利要求5所述的发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声功率为150～250w，时间为20～40min；所述超声处理的处理温度为40～60℃。

8.根据权利要求5所述的发芽糙米多糖组合物的制备方法，其特征在于，所述酶解的pH值为4.0～7.0；酶解的温度为35～65℃，时间为0.5～3.5h。

9.权利要求1所述发芽糙米多糖组合物以及权利要求2～8任意一项所述制备方法制得的发芽糙米多糖组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。