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一种米糠多糖类活性组分的制备方法 Download PDF

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一种米糠多糖类活性组分的制备方法，属于大米精深加工技术领域。本发明以脱脂米糠为原料，采用热水提取多糖、复合酶解去除淀粉和蛋白质、氢氧化钙处理去除植酸盐，制得粗制米糠多糖RBP，其总糖含量为85.4％，得率为2.82％；继续采用凝胶过滤柱层析和离子交换柱层析，分离纯化得到RBP－M活性组分。采用动物实验研究米糠多糖RBP和RBP－M的免疫调节活性，发现它们对免疫功能低下小鼠在细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫方面具有显著增强作用。

Description

一种米糠多糖类活性组分的制备方法
技术领域
一种米糠多糖类活性组分的制备方法，属于大米精深加工技术领域。
背景技术
稻谷经砻谷去掉稻壳后就得到糙米，米糠则是糙米碾白过程中被碾下的皮层及少量米胚和碎米的混合物。米糠的主要成分是糖类、脂肪及蛋白质，并含有较多的灰分和维生素。米糠的质量与各营养成分的数量取决于碾米的精度以及碾米过程中胚乳破碎的程度。
米糠一般占稻米总重的6～8％，但它却包含有稻米64％的重要营养成分以及90％以上的人体必须元素。联合国工业发展组织(UNIDO)把第三世界的米糠称之为一种未充分利用的资源(an under-utilized raw material)。在国外米糠被誉为“天赐营养源”。随着现代科技的进步，米糠全身皆是宝的奥秘已得以揭示。世界上许多大公司对于米糠中功能性成分的提取富集很感兴趣。据不完全统计，截止目前已公开的有关米糠深加工的专利有50多件。
多糖作为来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然高分子化合物，是构成生命的四大基本物质之一。人们对于糖类的早期研究只注意到它作为能源物质的重要性和细胞的组成成分，只是近几十年来人们对多糖的生物活性才有了进一步的认识。多糖具有多种生物活性，同维持生物机能密切相关。多糖与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖在细胞识别、细胞生长、分化、代谢、胚胎发育、细胞癌变、病毒感染、免疫应答等方面起着不容忽视的作用。自20世纪50年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，多糖的研究受到越来越广泛的重视。近20年来，由于生物学、化学等学科的飞速发展，人们对多糖及其复合物的活性作用有了越来越深入的认识。多糖在抗肿瘤、免疫增强、降血糖、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗凝血等方面发挥着生物活性作用。
米糠中存在多种类型的多糖，米糠多糖(RBP)是一类结构复杂的杂聚糖，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等组成，主要的多糖有脂多糖、阿拉伯木聚糖和葡聚糖等。米糠活性多糖不仅具有一般多糖的生理功能，而且还具有较强的提高血清肿瘤坏死因子水平、增强机体免疫功能及降血糖、降血压、降胆固醇等防治老年心血管疾病的功能，这已被科学界和医学界所证实。米糠活性多糖被认为具有与人参、当归等中草药多糖相类似的功效，而米糠资源丰富和价格低廉，非常适合开发利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种米糠多糖类活性组分的制备方法，对脱脂米糠进行综合利用，提高农副产品附加值。
本发明的技术方案：以米糠油生产中的副产品脱脂米糠为原料，用热水提取其中的水溶性多糖，用淀粉酶和糖化酶酶解去除淀粉，用蛋白酶酶解反应去除蛋白质，用氢氧化钙沉淀分离植酸盐，再经过超滤浓缩、乙醇沉淀制得粗制米糠多糖RBP产品；或对RBP继续进行Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析，取RBP-a组分，再对RBP-a进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，得到RBP-M主要免疫活性组分。
(1)挤压膨化对米糠多糖提取的影响
对米糠进行挤压膨化处理可有效钝化其中的脂肪酶，从而稳定米糠的理化性质。特别是采用挤压膨化工艺还可提高米糠中可溶性碳水化合物的含量，由此可以提高米糠多糖的得率。因此我们采用经过挤压膨化处理的脱脂米糠为原料。
(2)料水比对多糖得率的影响
多糖得率随着料水比的增加而增加，但其增加程度很小；但在料水比小于1∶6时，米糠与水的混合体系较稠难以搅动，所以采用料水质量比为1∶8。
(3)热水提取工艺条件的优化
热水提取温度60～95℃，提取时间1～5小时，pH值5.0。采用响应面分析法(RAS)来寻求最佳工艺参数，设计组合使米糠多糖的得率为最佳。优化工艺条件为温度80℃，时间1.5小时，pH值5.0。在此工艺条件下放大5倍，重复试验2次，进行米糠多糖的提取，平均得率为2.82％。
(4)蛋白酶酶解反应去除蛋白质
RBP中除含有大量多糖(67.2％)外，还含有一定量的蛋白质(17.4％)及其它非糖杂质(主要是植酸盐类)。目前用于多糖除蛋白的主要方法有：Sevage法、三氟三氯乙烷法、苯酚法、等电点沉淀法、三氯乙酸法、正丁醇法和酶法。相对以上几种方法，酶法去除蛋白工艺则相对较好，可以较好的完成蛋白质的去除和糖类物质的保留。选取酶用量、温度、时间、pH值四个因素进行工艺条件优化：酶用量为底物浓度的0.5-1.5％，温度为40-60℃，水浴1-2.5h为适宜的工艺条件，此时蛋白质百分含量为2.75％，蛋白质的去除百分率达到85％。
(5)Ca(OH)2沉淀分离植酸盐
以10％Ca(OH)2一次沉淀法去除提取液中的植酸。因为提取液体系的pH值为5左右，故用10％Ca(OH)2调节pH至中性。由于石灰乳的溶解有一个过程，其碱性释放缓慢，常使刚调好的pH值片刻后又发生改变(升高)，造成工艺不稳定，难控制，为此，我们以提取液中(植酸)磷含量的变化考察了搅拌时间对植酸沉淀的影响。搅拌时间从10min增加至50min，提取液中总磷含量降低显著，即植酸沉淀为植酸钙的作用显著，50min以后，植酸沉淀充分，控制搅拌0.5-1小时，尤以选择50min为最佳。经过石灰乳的沉淀工艺，粗制米糠多糖(RBP)中灰分含量由14％降为1.3％，灰分去除率达到约92％，RBP纯度得以提高。
(6)沉析液乙醇质量浓度对米糠多糖得率的影响
多糖得率的总趋势是随着沉析液乙醇质量分数的增加而增加，到60％以上渐趋缓慢，这与多糖分子量大小有关，大分子量多糖溶解性较差，在低浓度的乙醇中即可沉淀，而小分子量多糖则要在较高的乙醇浓度下才能沉淀，部分单糖与寡糖不会沉淀，即使是乙醇浓度达到90％也还能溶解在其中。在提取工艺中，我们控制沉析终浓度为质量分数60-80％的乙醇进行多糖的沉淀。
(7)RBP凝胶过滤柱层析
采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱对RBP浓缩液进行分级纯化，用0.2mmol/L的NaCl溶液进行洗脱，自动部分收集，可以分级分离成三个主要组分：RBP-a、RBP-b及RBP-c，其中RBP-a活性最显著。
(8)RBP-a离子交换柱层析
将RBP-a的浓缩液加至DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，离子强度线性梯度洗脱，自动部分收集，可以分级分离成四个主要组分：RBP-L、RBP-M、RBP-N及RBP-O，体外活性检测结果表明含量较高组分RBP-M活性最显著。
本发明的有益效果：国内外已有用全脂新鲜米糠作原料、用沸水浸泡提取米糠多糖的公开文献报道，已有加硫酸铵或乙醇等有机溶剂沉淀提取米糠多糖的公开文献报道，也已有研究米糠多糖的降血糖活性、降血脂活性和抑瘤活性的公开文献报道；但本发明以脱脂米糠为原料，采用热水提取(水温低于沸点)、复合酶解、氢氧化钙处理工艺，蛋白质去除率达到85％，灰分去除率达到约92％；采用凝胶过滤柱层析和离子交换柱层析分离纯化，得到活性组分RBP-M。RBP-M的主要单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖等；构效关系研究表明，RBP-M的活性主要由多糖部分贡献，与蛋白质、脂多糖、酚酸类物质无关；采用动物实验研究RBP和RBP-M的免疫调节活性，证明其可增强免疫功能低下小鼠的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫活性。国内外未见与此相同的公开文献、成果或专利报道。
附图说明
附图为米糠多糖类活性组分制备工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
取1000g脱脂米糠，加入10L蒸馏水，加热至85℃，搅拌提取2小时，2500rpm离心20分钟，85℃条件下加淀粉酶(0.5％)酶解反应半小时，降温至65℃，调pH至4.0加糖化酶酶解去除淀粉，再降温至45℃加蛋白酶(1.5％)酶解反应1小时去除蛋白质，加10％Ca(OH)2回调pH至中性，搅拌1小时，离心沉淀分离植酸盐，上清液经超滤浓缩，4倍酒精沉淀，静置，离心，沉淀复溶后或经旋转蒸发浓缩，真空或喷雾干燥得到RBP；或沉淀复溶后进一步分离纯化得到RBP-M。
实施例2
取1000g脱脂米糠，加入20L蒸馏水，加热至95℃，搅拌提取1.5小时，2500rpm离心20分钟，85℃条件下加淀粉酶(0.5％)酶解反应1小时，降温至65℃，调pH至4.0加糖化酶酶解去除淀粉，再降温至40℃加蛋白酶(1.5％)酶解反应1.5小时去除蛋白质，加10％Ca(OH)2回调pH至中性，搅拌0.5小时，离心沉淀分离植酸盐，上清液经超滤浓缩，4倍酒精沉淀，静置，离心，沉淀复溶后或经旋转蒸发浓缩，真空或喷雾干燥得到RBP；或沉淀复溶后进一步分离纯化得到RBP-M。
实施例3
取RBP浓缩液(8mg/ml)10ml，加入Sepharose CL-6B凝胶过滤柱，
用0.2mmol/L的NaCl溶液进行洗脱，自动部分收集，得到三个组分：RBP-a(38mg)、RBP-b(18mg)及RBP-c(20mg)，其中RBP-a活性最显著。将RBP-a的浓缩液(20mg/ml)20ml加至DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，离子强度线性梯度洗脱，自动部分收集，可以分级分离成四个主要组分：RBP-L(58mg)、RBP-M(219)、RBP-N(88mg)及RBP-O(16.5mg)，体外活性检测结果表明含量较高组分RBP-M活性最显著。

Claims (8)

1.一种米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是以米糠油生产中的副产品脱脂米糠为原料，用热水提取其中的水溶性多糖，用淀粉酶和糖化酶酶解去除淀粉，用蛋白酶酶解反应去除蛋白质，用氢氧化钙沉淀分离植酸盐，再经过超滤浓缩、乙醇沉淀制得粗制米糠多糖RBP产品；或对RBP继续进行Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析，取RBP-a组分，再对RBP-a进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，得到RBP-M主要免疫活性组分。
2.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是所用原料脱脂米糠，是经过挤压膨化处理的脱脂米糠。
3.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是热水提取，料水质量比为1∶6～1∶20，提取温度60～95℃，提取时间1～5小时，pH值5.0。
4.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是蛋白酶酶解反应，酶用量为底物浓度的0.5～1.5％，酶解温度40～60℃，酶解时间1～2.5小时。
5.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是分离植酸盐，用10％Ca(OH)2沉淀法去除提取液中的植酸，不断搅拌，不断加10％Ca(OH)2溶液调节提取液pH值至中性，搅拌0.5～1小时。
6.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是乙醇沉淀米糠多糖，控制沉析终浓度为质量分数60～80％的乙醇。
7.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是凝胶过滤柱层析，采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱对RBP浓缩液进行分级纯化，用0.2mmol/L的NaCl溶液进行洗脱，自动部分收集，可以分级分离成三个主要组分：RBP-a、RBP-b及RBP-c，其中RBP-a活性最显著。
8.根据权利要求1所述的米糠多糖类活性组分的制备方法，其特征是离子交换柱层析，将RBP-a的浓缩液加至DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，离子强度线性梯度洗脱，自动部分收集，可以分级分离成四个主要组分：RBP-L、RBP-M、RBP-N及RBP-O，体外活性检测结果表明含量较高组分RBP-M活性最显著。
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