CN114752641B - 一种樟芝菌硒多糖的制备方法 - Google Patents
一种樟芝菌硒多糖的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种樟芝菌硒多糖的制备方法，属于生物技术领域。该方法利用樟芝菌对硒元素的富集与转化能力，将樟芝菌多糖与硒相结合，所得樟芝菌硒多糖，兼具二者的生物学功能，为樟芝菌的开发利用提供新的思路。通过调整樟芝菌液体发酵培养基的成分与含量，添加一定浓度的无机硒溶液，在促进樟芝菌生长的同时，大幅度提高樟芝菌硒多糖含量和硒含量。采用液体发酵法培养樟芝菌富硒菌丝体，与固态发酵法相比，生产周期短、效率高、成本低、对环境友好，可为工业化大规模制备樟芝菌硒多糖提供一定的理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种樟芝菌硒多糖的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
樟芝（Antrodia cinnamomea）是来源于我国台湾地区的一种药食两用真菌，又称樟菇、牛樟芝、牛樟菇、红樟芝等，隶属于真菌界、担子菌门、担子菌亚门、同担子菌纲、无摺菌目、多孔菌科、薄孔菌属，具有“神芝”、“森林中的红宝石”的美称。野生樟芝的生长条件极为苛刻，仅能寄生于中国台湾地区特有的牛樟树上，且生长速度极为缓慢，近年来牛樟树遭到了严重盗伐，使得野生樟芝子实体的数量更为稀少。樟芝最早由中国台湾早期原住民发现，发现食用樟芝可以改善宿醉、肝脏、体力透支等方面的问题。近年来，科学研究表明，樟芝具备抗炎、护肝、增强免疫力和抗癌等多方面药理活性。
樟芝多糖作为樟芝中主要的活性成分之一，在抗炎、增强免疫、抗疲劳、抗血管生成、抗癌等方面有良好功效。各项深入研究表明樟芝菌菌丝体半乳葡聚糖、β-D-葡聚糖、硫酸化多糖等成分对炎症反应均能起到显著抑制作用。作为具有较高生物安全性与药理活性的一类化学成分，樟芝菌多糖在相关保健品、胶囊产品开发等方面有着巨大的潜力。
硒是人体必需的微量元素，对人体健康有着重要影响，研究表明，硒具有抗氧化、抗炎、增强免疫、抑制肿瘤等多种生物活性。而人体摄入硒含量不足，会引起克山病、大骨头病、糖尿病、甲状腺功能障碍、心脑血管疾病等多种疾病。人体无法合成硒，只能通过食物获取硒元素，但我国是世界上硒元素含量较低的国家之一，难以直接满足人们需求。
硒多糖是多糖与硒元素相结合形成的有机硒化合物，在具备补硒功效的同时，还能够发挥有机硒人体易吸收、生物利用率高的优点，并保留多糖的多种生物活性，是一种理想的补硒原料。研究表明，通过食用菌微生物富集方式制备的富硒多糖能够起到1）诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞迁移；2）抑制相关炎症因子的释放，起到显著抗氧化和抗炎活性；3）对脂多糖诱导的肺损伤起到有效保护作用等多种作用。
目前，已有大量学者通过食用菌富硒的方式研究硒多糖的制备与结构特征，包括灵芝富硒多糖、真姬菇硒多糖、蛹虫草硒多糖和猴头菇硒多糖等。樟芝作为一种良好的药食两用真菌，具有较高的开发利用价值，但关于其菌丝体的富硒研究却很少。
发明内容
本发明旨在提供一种樟芝菌硒多糖的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种樟芝菌硒多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）将樟芝菌接种于含有无机硒的发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液；
（2）将步骤（1）的发酵液离心获得樟芝菌菌丝体，离心收集沉淀，烘干研磨后得到樟芝菌菌丝体粉末；
（3）将步骤（2）的樟芝菌菌丝体粉末进行浸提、浓缩、醇沉和冷冻干燥，收集所得沉淀物，得樟芝菌富硒粗多糖；
（4）将步骤（3）的樟芝菌富硒粗多糖进行脱蛋白和纯化，冷冻干燥后，即为樟芝菌硒多糖。
在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，所述含有无机硒的发酵培养基的组成为Na2SeO31.5~2.5 mg/L、麦芽糖20~32 g/L、可溶性淀粉16~24 g/L、玉米浆干粉3~9 g/L，硫酸铵6~12 g/L、MgSO4·7H2O 0.5~1 g/L、K2HPO40.5~1 g/L、pH值6.0~7.0。
在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，将樟芝菌以体积比15~20%的接种量接种于含有无机硒的发酵培养基中，温度24~28℃，130~150 r/min培养9~10 d。
在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，所述洗涤的方法为利用蒸馏水冲洗樟芝菌菌丝体直至水洗液无色。
在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，烘干温度为50~55℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤（3）中，所述浸提的方法为水浴浸提或超声浸提。
在本发明的一种实施方式中，所述水浴浸提温度为75~95℃，时间为1~1.5 h，次数为2~3次；所述超声浸提时间为0.5~1 h，次数为2~3次。
在本发明的一种实施方式中，步骤（3）中，将浸提液体积浓缩至原体积的1/2或1/4。
在本发明的一种实施方式中，步骤（3）中，所述浓缩的方法为加热减压浓缩，浓缩温度不高于55℃，真空度不低于0.050 MPa。
在本发明的一种实施方式中，步骤（3）中，所述醇沉的方法为向浓缩液中加入4~5倍体积的无水乙醇，静置12~24 h，3000~4000 r/min离心15~20 min，取沉淀进行冷冻干燥。
在本发明的一种实施方式中，步骤（4）中，所述纯化为采用柱层析和/或超滤进行纯化。
本发明还提供根据上述制备方法制备得到的樟芝菌硒多糖。
本发明还提供上述方法在食品领域中的应用。
有益效果
（1）本发明利用樟芝菌对硒元素的富集与转化能力，将樟芝菌多糖与硒相结合，所得樟芝菌硒多糖，兼具二者的生物学功能。
（2）本发明通过调整樟芝菌液体发酵培养基的成分与含量，添加适当浓度的无机硒溶液，在促进樟芝菌生长的同时，提高樟芝菌硒多糖含量和硒含量。
（3）本发明采用液体发酵法培养樟芝菌富硒菌丝体，与固态发酵法相比，生产周期短、效率高、成本低、对环境友好，可为工业化大规模制备樟芝菌硒多糖提供理论依据。
附图说明
图1 樟芝菌液态发酵生长曲线示意图。
图2 樟芝菌硒多糖DEAE-52纤维素离子交换柱层析分离图。
图3 樟芝菌硒多糖的紫外可见光扫描图谱。
图4 樟芝菌硒多糖的红外光谱图。
图5 樟芝菌菌丝体硒含量与樟芝菌菌丝体硒多糖含量对比图。
图6 无硒多糖、硒多糖对RAW264.7细胞NO释放量(A)和SOD活力(B)的影响。
图7 无硒多糖、硒多糖对RAW264.7细胞释放TNF-α(A)、IL-6(B)、IL-1β(C)的影响。
图8 DEAE-52纤维素离子交换层析柱一次洗脱曲线(A)和紫外可见光扫描图谱(B)。
图9 DEAE-52纤维素离子交换层析柱二次洗脱曲线(A)和紫外可见光扫描图谱(B)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为对本发明保护范围的限制。在不偏离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，加入的各原料除特别说明外，均为市售。
樟芝菌：已公开于文章，王正齐, 张薄博, 陈磊,等. 响应面法优化樟芝胞外多糖的发酵条件[J]. 食品工业科技, 2018, 39(11):9.。
樟芝菌的活化：将樟芝菌接种于斜面培养基中，28℃恒温培养，菌丝均匀长满斜面保存备用。
斜面培养基组成为：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、K2HPO40.5 g /L、蛋白胨5 g/L。
总多糖含量的测定方法：为每升发酵培养基中所有樟芝菌富硒菌丝体经热水浸提/或超声浸提、醇沉后所得乙醇沉淀物，采用苯酚硫酸法进行测定，单位为g/L。
硒含量的测定方法：为樟芝菌富硒菌丝体内硒含量，采用原子荧光光谱法进行测定，单位为μg/g。
富硒率的测定方法：为每升发酵液中樟芝菌富硒菌丝体的硒含量与每升发酵液中Na2SeO3添加量的比值，单位为%。
实施例1
1. 液态发酵：将活化的樟芝菌菌株按10%（v/v）接种量接种于种子培养基中（100mL），其中种子培养基组成为：葡萄糖50 g/L，玉米浆干粉16 g/L，大豆水解液20 mL/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，柠檬酸0.5 g/L，pH自然，装液量100 mL/250 mL，发酵温度28℃，130 r/min培养3 d，即得樟芝菌种子液；将种子液按15%（v/v）接种量接入发酵培养基中（75 mL），其中发酵培养基组成为：麦芽糖24 g/L，可溶性淀粉16 g/L，玉米浆干粉9 g/L，硫酸铵9 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Na2SeO32 mg/L，K2HPO40.5 g/L，初始pH值调至pH=7.0，装液量75 mL/250 mL，发酵温度28℃，150 r/min培养9 d，得樟芝菌发酵液。
2. 樟芝菌菌丝体的获取：发酵结束后，使用布氏漏斗抽滤樟芝菌发酵液以除去液态发酵培养基，并用蒸馏水冲洗数遍直至冲洗液无色，获得樟芝菌富硒菌丝体，并测定硒含量和富硒率。置于55℃恒温烘箱中烘干至恒重，打碎为樟芝菌富硒菌丝体粉末备用。将菌丝体粉末称重，记录为生物量（图1）。
3. 樟芝菌硒多糖的提取：取樟芝菌富硒菌丝体粉末5 g，按料液比30:1（mL/g）加入蒸馏水，置于80℃恒温水浴锅中浸提1 h，吸取上清液，重复2次。收集上清液，采用加热减压浓缩，将所得上清液体积浓缩至原体积的1/2，浓缩温度为50℃，真空度0.70 MPa，获得浓缩液。在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，弃去上清液，将沉淀物冷冻浓缩，即得樟芝菌富硒粗多糖。采用苯酚硫酸法测定其中的多糖含量，记录为总多糖含量（图1）。
4. 樟芝菌硒多糖的除杂：将冻干后的粗多糖以去离子水溶解，配置成多糖溶液，加入多糖溶液体积5倍的Sevag试剂，震荡混合，充分震荡反应20 min，4000 r/min离心15min后，除去氯仿层和中间的蛋白质层，取上清液继续进行除蛋白操作，直至没有变性蛋白层的出现。合并上清液，将多糖溶液浓缩至一定体积，冷冻干燥，得到多糖粉末。将所得多糖粉末依次用丙酮、无水乙醇洗涤多糖粉末，待其沉淀后静置一段时间，更换溶液，重复三次，沉淀冷冻干燥，得到脱蛋白硒多糖。
5. 樟芝菌硒多糖的纯化：将所得脱蛋白硒多糖以去离子水溶解，上样至已平衡好的DEAE-52纤维素离子交换层析柱中，规格为（2.6×30 cm），平衡液为去离子水。洗脱过程中洗脱液分别为去离子水、0.1 mol/L的NaCl水溶液，脱蛋白硒多糖上样量为200 mg，以蠕动泵控制流速为1 mL/min，采用自动收集器收集洗脱液（5 min/管）。采用苯酚硫酸法检测各管洗脱液中多糖含量，以收集管号为横坐标，吸光值为纵坐标绘制多糖洗脱曲线，根据洗脱曲线合并目标组分，浓缩、冻干，加蒸馏水复溶，重复上样2次得樟芝菌硒多糖纯品。
6. 通过紫外光谱扫描和红外光谱图鉴定樟芝菌硒多糖。
实施例2
1. 液态发酵：将活化的樟芝菌菌株按接种量12%（v/v）接种于种子培养基中（75mL），其中种子培养基组成为：葡萄糖55 g/L，玉米浆干粉14 g/L，大豆水解液15 mL/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，K2HPO40.8 g/L，柠檬酸0.8 g/L，pH自然，装液量75 mL/250 mL，发酵温度26℃，110 r/min培养4 d，即得樟芝菌种子液；将种子液按20%（v/v）接种量接入发酵培养基中（75 mL），其中发酵培养基组成为：麦芽糖20 g/L，可溶性淀粉20 g/L，玉米浆干粉3g/L，硫酸铵6 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，Na2SeO32.5 mg/L，初始pH值调至pH=5.0，装液量75 mL/250 mL、发酵温度27℃，110 r/min培养9 d，得樟芝菌发酵液。
2. 樟芝菌菌丝体的获取：发酵结束后，使用布氏漏斗抽滤樟芝菌发酵液以除去液态发酵培养基，并用蒸馏水冲洗数遍直至冲洗液无色，冷冻干燥后，获得樟芝菌富硒菌丝体，并测定硒含量和富硒率。置于55℃恒温烘箱中烘干至恒重，打碎为樟芝菌富硒菌丝体粉末备用。将菌丝体粉末称重，记录为生物量。
3. 樟芝菌硒多糖的提取：取樟芝菌富硒菌丝体粉末5 g，按料液比40:1（mL/g）加入蒸馏水，超声浸提30 min，吸取上清液，重复2次。收集上清液，采用加热减压浓缩，将所得上清液体积浓缩至原体积的1/3，浓缩温度为45℃，真空度0.50 MPa，获得浓缩液。在浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜，弃去上清液，将沉淀物冷冻浓缩，即得樟芝菌富硒粗多糖。采用苯酚硫酸法测定其中的多糖含量，记录为总多糖含量。
4. 樟芝菌硒多糖的除杂：将冻干后的粗多糖以去离子水溶解，配置成多糖溶液，加入多糖溶液体积6倍的 Sevag 试剂，震荡混合，充分震荡反应 30 min，3000 r/min 离心20 min后，除去氯仿层和中间的蛋白质层，取上清液继续进行除蛋白操作，直至没有变性蛋白层的出现。合并上清液，将多糖溶液浓缩至一定体积，冷冻干燥，得到多糖粉末。将所得多糖粉末依次用丙酮、无水乙醇洗涤多糖粉末，待其沉淀后静置一段时间，更换溶液，重复三次，沉淀冷冻干燥，得到脱蛋白硒多糖。
5. 樟芝菌硒多糖的纯化：将所得脱蛋白硒多糖以去离子水溶解，上样至已平衡好的DEAE-52纤维素离子交换层析柱中，规格为（2.6×30 cm），平衡液为去离子水。洗脱过程中洗脱液分别为去离子水、0.3 mol/L的NaCl水溶液，脱蛋白硒多糖上样量为300 mg，以蠕动泵控制流速为1.5 mL/min，采用自动收集器收集洗脱液（3 min/管），采用苯酚-硫酸法检测各管洗脱液中多糖含量，以收集管号为横坐标，吸光值为纵坐标绘制多糖洗脱曲线，根据洗脱曲线合并目标组分，浓缩、冻干，加蒸馏水复溶，重复上样2次得樟芝菌硒多糖纯品。
6. 通过紫外光谱扫描和红外光谱图鉴定樟芝菌硒多糖。
实施例3
在实施例1的基础上，调整发酵培养基中各组分的含量
发酵培养基组成为：Na2SeO3添加量1.5 mg/L，麦芽糖32 g/L，可溶性淀粉24 g/L，玉米浆干粉6 g/L，硫酸铵6 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，初始pH值调至pH=6.0。装液量110 mL/250 mL，发酵温度30℃，150 r/min培养9 d。
分别测定生物量、硒含量、富硒率和总多糖含量。
实施例4
在实施例1的基础上，调整发酵培养基中Na2SeO3添加量分别为0、1、2、3 mg/L，发酵培养后得到a、b、c、d四组菌丝体硒含量不同的樟芝菌富硒菌丝体，按照实施例1的方法进行多糖的提取得到四组樟芝菌硒多糖。
分别测定a、b、c、d四组樟芝菌菌丝体硒含量与硒多糖硒含量。
当Na2SeO3添加量为0 mg/L时，菌丝体硒含量与提取所得硒多糖内硒含量几乎为0，与Na2SeO3添加量为1、2、3 mg/L的实验组相比，说明本发明的方法中添加Na2SeO3可以产生樟芝菌硒多糖，结果见表1。同时，a、b、c、d四组所得菌丝体的硒含量成线性相关，四组硒多糖内硒含量也成线性相关性，表明通过测定菌丝体硒含量判定硒多糖内硒含量是可行的，此法可以更为便捷的判断硒多糖的硒含量，减少时间、实验成本（图5）。
表1
实施例5
在实施例1的基础上，制备樟芝菌硒多糖。
在本实施例中，为评价樟芝菌硒多糖的抗炎作用，将RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于12孔板，待细胞贴壁后除去原有培养基，按实验分组进行处理，分别为空白组（完全培养基）、模型组（完全培养基）、硒多糖实验组（硒多糖浓度分别为50、100、150、200、250 μg/mL的培养基）。实验设置3复孔，放置于培养箱内培养12 h后，除空白组外其他组均加入含1 μg/mL脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）培养基，空白组更换完全培养基，作用24h。收集细胞上清液与细胞。按试剂盒说明测定NO、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。
加入脂多糖作用后，短时间内会激活RAW264.7细胞的炎症反应，NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的转录水平会显著增加，细胞内SOD活力会受到抑制。
与空白组相比，受到LPS诱导后的模型组NO释放量显著增高、SOD活力显著降低，意味着炎症模型的成功建立。与模型组相比，硒多糖处理组细胞的NO释放量都显著降低，并且与样品浓度的增加呈现一定的正相关性。硒多糖处理组在实验范围内均能显著提高SOD活性，于100 μg/mL浓度时SOD活性可达到8.186 U/mgprot。以上数据表明，硒多糖对 LPS 诱导的RAW 264.7细胞炎症模型具有抗氧化保护作用，综合来说，硒多糖既能够显著降低NO释放量，同时对于提高SOD的活力的效果更强（图6）。
模型组细胞的TNF-α、IL-6、IL-1β释放量均显著上升。与模型组相比，硒多糖实验组在250 μg/mL条件下TNF-α释放量可下降17%，在200 μg/mL条件下IL-6释放量可下降23%；硒多糖对IL-1β释放量的影响则呈现先下降后上升的趋势，在150 μg/mL达到最好的效果（172.145±pg/mL）。硒多糖在100~250 μg/mL浓度范围内能显著降低TNF-α、IL-6的释放量。实验结果表明，硒多糖可以减弱LPS诱导的RAW264.7细胞炎症（图7）。
对比例
为更好验证本发明中所采用的培养基配方对产樟芝菌硒多糖的优势，进行了几个对比实验。
对比例1-2中只调整发酵培养基中Na2SeO3的添加量：对比例1的发酵培养基中Na2SeO3的添加量为1 mg/L；对比例2的发酵培养基中Na2SeO3的添加量为3 mg/L，其余条件均与本发明实施例1相同。
对比例3-6中只调整发酵培养基中碳源和氮源及其用量：对比例3的发酵培养基中不含麦芽糖，可溶性淀粉的含量调整为40 g/L；对比例4的发酵培养基中麦芽糖含量为8 g/L，可溶性淀粉含量为32 g/L；对比例5中不含硫酸铵，玉米浆干粉的含量调整为15 g/L；对比例6的发酵培养基中玉米浆干粉含量为9 g/L，硫酸铵含量为6 g/L，其余条件均与本发明实例1相同，结果见表2。
表2
对比例7-8中只调整样品经DEAE-52纤维素离子交换层析柱洗脱次数而不进行除杂步骤，对比例7中脱蛋白硒多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱一次洗脱后，测定洗脱曲线，根据洗脱曲线合并目标组分，浓缩、冻干得樟芝菌硒多糖纯品；对比例8中脱蛋白硒多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析柱一次洗脱后，测定洗脱曲线，根据洗脱曲线合并目标组分，浓缩、冻干，加蒸馏水复溶，重复上样1次得樟芝菌硒多糖纯品。
经检测，实施例1中樟芝菌硒多糖经DEAE-52纤维素离子交换柱层后（图2），得到中性多糖组分SAPS-1和酸性多糖组分SAPS-2；紫外扫描图谱显示中性多糖组分SAPS-1中不含有大量硒多糖，且不含有蛋白质和核酸杂质，而SAPS-2组分中仍然含有少量蛋白杂质难以去除（图3）。因此，将二者分别收集。
红外光谱图中，中性多糖在3394.90 cm-1附近有一个较宽且强度较大的吸收峰，对应多糖样品中O-H的伸缩振动；在2928.49 cm-1-2975.10 cm-1附近存在特征吸收峰，对应多糖样品中C-H的伸缩振动，在1650.85 cm-1附近的特征吸收峰与多糖的COOH或羰基中C=O的非对称振动相对应；在1401.39 cm-1附近的特征吸收峰对应于-CH2的变形振动；在1000-1300 cm-1之间的吸收峰用于识别多糖中主要的化学基团。1088.74 cm-1、1049.85 cm-1附近的吸收峰表示C-O-C或C-O-H的伸缩振动，表明可能具备吡喃环构型。在881.10 cm-1、804.71cm-1处的吸收峰意味着组分中可能含有α构型糖苷键和β构型糖苷键（图4）。
与上述对比例1和2相比，本发明的方法中Na2SeO3添加量大幅度提高了樟芝菌总多糖含量、硒含量和富硒率。
与上述对比例3和4相比，本发明的方法所用培养基的碳源及复合比例，大幅度提高了樟芝菌总多糖含量、硒含量和富硒率。
与上述对比例5和6相比，本发明的方法所用培养基的氮源及复合比例，大幅度提高了樟芝菌总多糖含量与硒含量。
与上述对比例7和8相比，本发明的方法所用洗脱方法，可以有效去除樟芝菌硒多糖内蛋白质与核酸等杂质，获取纯樟芝菌硒多糖，同时保证中性多糖依然为主要硒多糖成分（图8~9）。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (1)
1.一种樟芝菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将樟芝菌以体积比15%接种量接种于含有无机硒的发酵培养基中，温度28℃，150r/min培养9d，获得发酵液，所述含有无机硒的发酵培养基的组成为Na2SeO3 2 mg/L、麦芽糖24 g/L、可溶性淀粉16 g/L、玉米浆干粉9 g/L，硫酸铵9 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、pH值7.0；
（2）将步骤（1）的发酵液过滤获得樟芝菌菌丝体，利用蒸馏水冲洗樟芝菌菌丝体直至水洗液无色并收集沉淀，置于55℃恒温烘箱中烘干研磨后得到樟芝菌菌丝体粉末；
（3）将步骤（2）的樟芝菌菌丝体粉末加入蒸馏水，置于80℃恒温水浴锅中浸提1 h，重复2次；收集上清液，采用加热减压浓缩，将所得上清液体积浓缩至原体积的1/2，浓缩温度为50℃，真空度0.70 Mpa，获得浓缩液；在浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，静置过夜，弃去上清液，将沉淀物冷冻浓缩，得樟芝菌富硒粗多糖；
（4）将步骤（3）的樟芝菌富硒粗多糖以去离子水溶解，配置成多糖溶液，加入多糖溶液体积5倍的 Sevag 试剂，充分震荡反应20 min，4000 r/min离心15 min后，除去氯仿层和中间的蛋白质层，取上清液继续进行除蛋白操作，直至没有变性蛋白层的出现；合并上清液，将多糖溶液浓缩和冷冻干燥，得到多糖粉末；将所得多糖粉末依次用丙酮、无水乙醇洗涤多糖粉末，待其沉淀后静置，更换溶液，重复三次，沉淀冷冻干燥，得到脱蛋白硒多糖；
将所得脱蛋白硒多糖以去离子水溶解，上样至已平衡好的DEAE-52纤维素离子交换层析柱中，平衡液为去离子水；洗脱过程中洗脱液分别为去离子水、0.1 mol/L的NaCl水溶液；脱蛋白硒多糖上样量为200 mg，以蠕动泵控制流速为1 mL/min，采用自动收集器以5 min/管的频率收集洗脱液，合并目标组分，浓缩、冻干，加蒸馏水复溶，重复上样2次得樟芝菌硒多糖纯品。
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