CN114790438B - 一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法，包括以下步骤：(1)取牛樟芝菌株S‑29在PDA斜面培养基上培养，得到牛樟芝菌种；(2)将牛樟芝菌种接入种子培养基中培养，得到种子液；(3)取种子液接种于液态发酵培养基中进行发酵培养，初步培养后加入油性溶剂，继续培养，即完成。与现有技术相比，本发明提供的发酵方法制备得到的胞外多糖抗氧化活性得到显著提高，尤其是对超氧阴离子、羟自由基以及DPPH自由基的清除效果。此外，发酵方法工艺简便、成本较低，能够大量获得牛樟芝低分子量胞外多糖，有着重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药用真菌技术领域，涉及一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法。
背景技术
自由基是生物体内一些正常生化反应的中间代谢产物，具有高度化学活性和极强的氧化反应能力，是机体有效的防御系统。一般来说，受控的自由基对人体是有益的，它们既可以帮助传递维持生命活力的能量，也可以用来杀灭细菌和寄生虫，同时参与排除毒素。但当机体处于特殊环境或受到外界条件的刺激时，机体会积累过多的自由基，从而攻击生物大分子(蛋白质、脂质和核酸等)，造成细胞凋亡或组织病变。越来越多的基础研究及临床实验显示，自由基参与多种疾病的病理过程，诱发糖尿病、心脏病、关节炎及某些癌症等100多种疾病，加速机体的衰老和死亡。因此，自由基清除剂可作为保健食品的重要功效成分。
抗氧化剂在保护机体细胞和组织免受氧化损伤中具有重要作用。然而化学合成的抗氧化剂在安全性方面备受质疑，因此，筛选和应用具有较低副作用和良好生物可接受性的天然抗氧化剂变得越来越重要。多糖是一种天然的生物大分子，具有低毒性、低成本、高生物相容性等优点被广泛关注。研究表明，很多植物、微生物或真菌来源的多糖由于其丰富的官能团而表现较高的自由基清除能力和抗氧化活性，主要体现在提高机体抗氧化酶活性、清除体内自由基、抑制脂质过氧化、保护生物膜等作用。
牛樟芝(Antrodia camphorata)是一种起源于中国台湾的可食用真菌，在当地被广泛用于治疗肝炎、肝硬化和肝癌。目前已从牛樟芝中分离得到多种生物活性成分，包括三萜、多糖、泛醌类化合物及马来酸琥珀酸衍生物等。其中多糖是牛樟芝重要的活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗血管生成等功效。野生牛樟芝生长环境较为复杂，只生长在中国台湾特有百年以上的樟树树干腐朽之心材内壁或枯死樟木潮湿表面，野生牛樟芝采摘极为困难，这也导致牛樟芝多糖价格非常昂贵。液态发酵法是牛樟芝人工培养的良好方式，能够快速的获得菌体以及多糖等代谢产物，然而目前报道的牛樟芝多糖大多为大分子量多糖，且产量较低，缺乏能够快速吸收的低分子量胞外多糖。
公开号为CN104448026A(发明名称：一种提高牛樟芝多糖抗氧化活性的方法) 的专利文献公开了通过水浸提的方法制备牛樟芝多糖的方法，提取出的多糖具有明显的抗氧化性，但上述文献中所公开的是利用提取制备的方法提高牛樟芝多糖的抗氧化性，是通过制备过程的纯化步骤去除杂质，提高多糖纯度，从而提高抗氧化性。但是，目前并没有关于利用发酵方法提高牛樟芝低分子量胞外多糖产量以及抗氧化性的方法报道。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法，有效提高牛樟芝低分子量胞外多糖产量，并进一步提升其自由基清除效果。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法，包括以下步骤：
(1)取牛樟芝菌株S-29(Antrodia camphorata S-29，其保藏编号为CGMCC 9590)在PDA斜面培养基上培养，得到牛樟芝菌种；
(2)将牛樟芝菌种接入种子培养基中培养，得到种子液；
(3)取种子液接种于液态发酵培养基中进行发酵培养，初步培养后加入油性溶剂，继续培养，即完成。
进一步的，步骤(1)中，培养条件具体为：在25～30℃下避光培养10～15天，优选为在28℃下避光培养13天。
进一步的，步骤(2)中，所述种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，玉米浆 4g/L，大豆蛋白胨5g/L。
进一步的，步骤(2)中，培养条件具体为：在25～30℃下，优选为28℃，控制摇床转速为100～200rpm，优选为150rpm，培养3～5天，优选为4天。
进一步的，步骤(3)中，所述液态发酵培养基的配方为：葡萄糖60g/L，玉米浆2g/L，大豆蛋白胨3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L。
进一步的，步骤(3)中，种子液的接种量为5％-30％，v/v。
进一步的，步骤(3)中，发酵培养的温度为25～30℃，优选为28℃，摇床转速为100～200rpm，优选为150rpm，pH为4.5～5.5，pH值优选为5。
进一步的，步骤(3)中，发酵培养的时间为6～18天，其中，初步培养的时间至少2天，继续培养的时间至少4天。
进一步的，步骤(3)中，所述油性溶剂为植物油、油酸、油醇中的一种或几种的混合。
进一步的，步骤(3)中，所述油性溶剂的添加量为发酵液体积的5％-30％， v/v。
本发明所提供的发酵方法能够显著提高牛樟芝液态发酵菌体量以及低分子胞外多糖产量，胞外多糖产量达到236.42mg/L，比空白对照多糖产量提高了2.7倍，且发酵液中多糖组分单一，经过简单的除蛋白醇沉后就能得到纯度85％以上的低分子胞外多糖单一组分。体外自由基清除实验结果表明，经过油性溶剂促进发酵后，牛樟芝低分子量胞外多糖抗氧化性能显著提高，其中超氧阴离子去除率由45.87％提高至64.83％，羟自由基清除率由73.13％提高至86.73％，DPPH自由基清除率由 31.73％提高至47.76％。本发明的发酵方法技术工艺简单、高效，能够显著提高牛樟芝多糖的抗氧化活性，有着重要的工业应用价值。
附图说明
图1为牛樟芝胞外多糖的抗氧化活性评估图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料。
牛樟芝低分子胞外多糖的提取测定：
取200mL发酵液，抽滤弃菌体，4500r/min离心15min后，取水相发酵液；将水相发酵液在60℃旋蒸浓缩为原体积的四分之一，4500r/min离心15min，取上清；向上清中缓慢加入三氯乙酸至终浓度(此处指的是体系中三氯乙酸的终浓度) 为4％，m/v；9000r/min离心15min，去除蛋白，然后边搅拌边加入无水乙醇，4℃静置过夜；9000r/min离心15min，收集沉淀，用乙醇清洗沉淀3次，用去离子水溶解沉淀，透析72h，每4h换一次水；透析完成后冻干后即得牛樟芝胞外多糖。采用硫酸苯酚法测定多糖含量。
超氧阴离子清除率的测定：
采用邻苯三酚自氧化法测定牛樟芝多糖的超氧阴离子自由基清除率，准确称取0.1261g邻苯三酚，用10mM盐酸溶解并定容至100mL，吸取0.1mL不同浓度的牛樟芝多糖，加入1.8mLTris-HCL缓冲液(50mM，pH＝8)和2mL去离子水混匀后，25℃水浴20min，再加0.1mL邻苯三酚溶液，25℃反应4min，于325nm处测吸光值，以同浓度Vc为阳性对照。
其中As1表示样品反应液的吸光值，Ab1表示去离子水代替邻苯三酚反应液的吸光值，A01为去离子水代替样品反应液的吸光值。
羟自由基清除率的测定：
分别配置6mmol/L FeSO4溶液、6mmol/L H2O2溶液和6mmol/L水杨酸溶液；吸取5mL不同浓度牛樟芝多糖溶液，加入1mL FeSO4溶液、1mL水杨酸溶液充分混匀后加1mL H2O2溶液启动反应，37℃条件反应10min后在510nm处测吸光值，以同浓度Vc为阳性对照。
其中As2代表样品与硫酸亚铁、水杨酸、H2O2的反应液吸光值，Ab2代表用去离子水代替H2O2反应液的吸光值，A02代表用去离子水代替样品反应液的吸光值。
DPPH自由基清除率的测定：
配置0.02mM DPPH-C2H5OH混合液，吸取2mL不同浓度牛樟芝多糖溶液，加入1mLDPPH无水乙醇溶液，充分混匀，室温避光反应30min后在517nm处测吸光值，以同浓度Vc为阳性对照。
其中As3为样品与DPPH-C2H5OH混合液的吸光值，Ab3为去离子水代替 DPPH-C2H5OH混合液的吸光值，A03去离子水代替样品样品反应液的吸光值。
ABTS自由基清除率的测定：
准确配置ABTS工作液：将7.4mM ABTS溶液和2.6mM过硫酸钾溶液等体积混合，25℃避光静置12h后用甲醇稀释至其A734为1.1±0.023范围内吸取150μL 不同浓度的牛樟芝多糖溶液，加入2850μL ABTS工作液，充分混匀，室温避光反应20min后在517nm处测吸光值，以同浓度Vc为阳性对照。
其中As4为样品与ABTS工作液的吸光度，Ab4为去离子水代替ABTS工作液的吸光度，A04是去离子水代替样品反应液吸光度。
实施例1：对照发酵实验
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，玉米浆4g，大豆蛋白胨5g。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g，玉米浆2g，大豆蛋白胨3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g。
所用培养基均在115℃灭菌20min。
牛樟芝菌种先在PDA斜面培养基中以28℃培养13天，然后接入种子培养基中培养，种子液28℃、150r/min培养4天之后接入发酵培养基(此处种子液的接种量为15％，v/v)。
发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速150r/min，pH 5.0，培养至12天。牛樟芝胞外多糖含量为87.5mg/L，胞外多糖分子量为2.9×104Da，牛樟芝菌体量为8.87g/L。
实施例2：添加油酸发酵
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，玉米浆4g，大豆蛋白胨5g。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g，玉米浆2g，大豆蛋白胨3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g。
所用培养基均在115℃灭菌20min。
牛樟芝菌种先在PDA斜面28℃培养13天，然后接入种子培养基中培养。种子液在28℃、150r/min培养4天之后接入发酵培养基(此处种子液的接种量为15％， v/v)。
发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速150r/min，pH 5.0，培养2天后加入油酸5％(v/v)，然后继续培养至6天。用此方法促进牛樟芝菌体生长，牛樟芝胞外多糖含量为122.5mg/L，胞外多糖分子量为2.8×104Da，牛樟芝菌体量为 11.75g/L。
实施例3：添加油酸发酵
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，玉米浆4g，大豆蛋白胨5g。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g，玉米浆2g，大豆蛋白胨3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g。
所用培养基均在115℃灭菌20min。
牛樟芝菌种先在PDA斜面28℃培养13天，然后接入种子培养基中培养。种子液28℃、150r/min培养4天之后接入发酵培养基(此处种子液的接种量为15％， v/v)。
发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速150r/min，pH 5.0，培养4天后加入油酸15％(v/v)，然后继续培养至12天。用此方法促进牛樟芝菌体生长，牛樟芝胞外多糖含量为236.42mg/L，胞外多糖分子量为2.6×104Da，牛樟芝菌体量为14.67g/L。
实施例4：添加油酸发酵
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，玉米浆4g，大豆蛋白胨5g。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g，玉米浆2g，大豆蛋白胨3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g。
所用培养基均在115℃灭菌20min。
牛樟芝菌种先在PDA斜面28℃培养13天，然后接入种子培养基中培养。种子液28℃、150r/min培养4天之后接入发酵培养基(此处种子液的接种量为15％， v/v)。。
发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速150r/min，pH 5.0，培养6天后加入油酸30％(v/v)，然后继续培养至18天。用此方法促进牛樟芝菌体生长，牛樟芝胞外多糖含量为178.8mg/L，胞外多糖分子量为2.5×104Da，牛樟芝菌体量为12.48g/L。
实施例5：添加油醇发酵
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，玉米浆4g，大豆蛋白胨5g。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g，玉米浆2g，大豆蛋白胨3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g。
所用培养基均在115℃灭菌20min。
牛樟芝菌种先在PDA斜面28℃培养13天，然后接入种子培养基中培养。种子液28℃、150r/min培养4天之后接入发酵培养基(此处种子液的接种量为15％， v/v)。。
发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速150r/min，pH 5.0，培养4天后加入油醇15％(v/v)，然后继续培养至12天。用此方法促进牛樟芝菌体生长，牛樟芝胞外多糖含量为173.46mg/L，胞外多糖分子量为2.7×104Da，牛樟芝菌体量为13.63g/L。
实施例6：添加植物油发酵
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，玉米浆4g，大豆蛋白胨5g。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g，玉米浆2g，大豆蛋白胨3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g。
所用培养基均在115℃灭菌20min。
牛樟芝菌种先在PDA斜面28℃培养13天，然后接入种子培养基中培养。种子液28℃、150r/min培养4天之后接入发酵培养基(此处种子液的接种量为15％， v/v)。。
发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速150r/min，pH 5.0，培养4天后加入植物油15％(v/v)，然后继续培养至12天。用此方法促进牛樟芝菌体生长，牛樟芝胞外多糖含量为170.24mg/L菌体，胞外多糖分子量为2.5×104Da，牛樟芝菌体量为12.87g/L。
实施例6：抗氧化能力分析
按照实施例1(对照发酵)和实施例3(添加油酸发酵)发酵条件，分别制备得到两组牛樟芝胞外多糖样品AC-1、AC-2。采用苯酚硫酸法测定总糖含量；采用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量；采用间羟基联苯比色法测定总糖醛酸含量。结果如表1所示，本专利发酵得到的多糖组分单一，经过简单的除蛋白醇沉后就能得到纯度85％以上的低分子胞外多糖单一组分。
表1牛樟芝多糖的基本化学组成
为探究本发明提出的发酵技术是否能够提高牛樟芝胞外多糖的抗氧化性，分别配置不同浓度的AC-1及AC-2，并以同浓度的抗坏血酸为阳性对照，对比研究不同发酵方式下牛樟芝胞外多糖的自由基清除效果。
本实验采用超氧阴离子清除率、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率及ABTS 自由基清除率这四个指标对多糖样品的抗氧化性进行研究。本实施例中，超氧阴离子自由基清除率实验中所选的牛樟芝多糖的浓度为1、2、3、4、5mg/mL；羟自由基清除率实验中所选的牛樟芝多糖的浓度为0.5、1、1.5、2、2.5mg/mL；DPPH自由基清除率测定实验中所选的牛樟芝多糖的浓度为1、2、3、4、5mg/mL；ABTS 自由基清除率测定实验中所选的牛樟芝多糖的浓度为1、2、3、4、5mg/mL。结果如图1所示，实施例3所制备牛樟芝多糖AC-2的抗氧化能力显著高于实施例1制备多糖样品AC-1。经过油性溶剂促进发酵后，牛樟芝低分子量胞外多糖抗氧化性能显著提高，超氧阴离子去除率由45.87％提高至64.83％，羟自由基清除率由73.13％提高至86.73％，DPPH自由基清除率由31.73％提高至47.76％。牛樟芝多糖AC-2 的自由基清除能力呈浓度依赖性提高。
综上，本发明所提供的发酵方法能够显著提高牛樟芝液态发酵菌体量以及低分子胞外多糖产量，发酵结束后，发酵液经过简单的除蛋白醇沉后就能得到纯度85％以上的低分子胞外多糖单一组分。本专利采用的发酵方法能够显著提高牛樟芝胞外多糖对超氧阴离子自由基、羟自由基DPPH等自由基的清除率。本发明成本低、高效率、操作简单耗时较少，为牛樟芝多糖的活性研究和进一步应用提供数据支持和理论依据，具有良好的应用前景。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取牛樟芝菌株S-29在PDA斜面培养基上培养，得到牛樟芝菌种；
（2）将牛樟芝菌种接入种子培养基中培养，得到种子液；
（3）取种子液接种于液态发酵培养基中进行发酵培养，初步培养后加入油性溶剂，继续培养，即完成；
步骤（2）中，所述种子培养基的配方为：葡萄糖20 g/L，玉米浆4 g/L，大豆蛋白胨5g/L；
步骤（3）中，所述液态发酵培养基的配方为：葡萄糖60g/L，玉米浆2 g/L，大豆蛋白胨3g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L；
步骤（3）中，种子液的接种量为5%-30%，v/v；
步骤（3）中，发酵培养的温度为25~30℃，摇床转速为100~200rpm，pH为4.5~5.5；
步骤（3）中，发酵培养的时间为6~18天，其中，初步培养的时间为2~6天，继续培养的时间为4~12天；
步骤（3）中，所述油性溶剂为油酸；
步骤（3）中，所述油性溶剂的添加量为发酵液体积的5%-30%；
步骤（1）中，培养条件具体为：在25~30℃下避光培养10~15天；
步骤（2）中，培养条件具体为：在25~30℃下、控制摇床转速为100~200rpm培养3~5天。
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