KR830002898B1 - 항종양성물질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

항종양성물질의 제조방법

본 발명은 항종양성물질을 갖는 다당류 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 항암활성을 갖는 다당류와, 항암성 다당류를 생산할 수 있고, 하이포마이세테스류의 이사리아 속에 속하는 균주의 균사체 및/ 혹은 기질의 추출물로부터 혹은 상기 균주가 배양되는 배양 배지로부터 그러한 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 하이포마이세테스류의 이사리아 속에 속하는 어떤 종류의 균주, 그리고 항암성 다당류를 생산할 수 있는 모든 균주가 사용될 수 있다.

그러나 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면, 기지의 곰팡이류의 기질(조직)을 배양하여 얻은 이사리아 아티피컬라 야수단 K-2583의 균주가 사용되었다.

이와같은 균주의 특성은 다음과 같다. 이 균주는 키시뉴에우스 티피쿠스 키시다(일종의 거미)에 기생하며 이거미의 죽은 몸은, 땅밑에서, 이 균주의 균사체로 덮여 있으며 이곳으로부터 기질이 전개된다. 기질은 높이 5-8cm, 백색, 원통형이다 .줄기 꼭대기는 직경이 2.5-4.0mm 이고 부드러운 표면을 가지며 지탱하는 약간 두꺼운 부분도 있고 이곳은 줄기보다 모양이 길다. 지탱하는 부분은 약간 벨벳 같으며 보라색 구멍이 있고 원통형이고 약간 부드러운 무색이고 크기는 4.5×1.5-2.0μ이다.

이러한 특성에 의해서 이균주는 이사리아 아티피콜락 야수다라고 정의되었다. 이균주는 일본에 저장되었다.

본 발명의 항암성 다당류는 배양되온 이균주의 기질 및/혹은 균사체의 액상 추출물이나 균사체를 배양시켜온 여과된 육즙배지로부터 얻을 수 있다.

그러나, 자연에서 그러한 기질을 충분량만큼 모으는 것은 쉽지 않다. 그러므로 많은 양의 기질을 얻기 위해 균주를 배양하는 것이 이롭다. 하이포마이세테스류의 곰팡이를 배양하기 위해서 잘 알려진 방법 즉, 나무진애 혹은 톱진애 배지상에서 배양할 수 있다. 이와같이, 예를들어, 200g의 톱진애, 100g의 쌀겨 및 300ml의 물을 잘 혼합하여 배양배지를 만들어 적당한 용기에 넣어서 멸균시킨다. 사면배양 배지내에서 각각 배양된 균주를 상기 제조된 배양배지 위에서 통상적인 방법에 따라 25-27℃에서 약 1달간 균사체가 충분히 자라도록 배양시킨다. 배양배지를 20-25℃에서 약 1달간 방치하여 기질이 그곳에서 자라도록 한다. 그렇게 자란 기질을 모아 본 발명의 출발물질로 사용한다.

본 발명에 사용된 균사체는 고체배양 혹은 액체배양 같은 통상적인 배양방법에 따라 얻을 수 있다. 고체 배양에서는, 예를들면, 한천, 젤라틴, 전분, 나무진애, 펄프, 기타 통상적인 배양배지나 그의 조합물을 사용할 수 있다. 액체배양에서는, 미생물배양 기술에서 잘 알려진 여러가지 영양분을 함유하는 액체배양 배지가 사용될 수 있다. 이와같이, 액체배양 배지는 탄소원 즉 글루코스, 말토즈, 락토즈, 슈크로즈, 전분, 당밀 등, 질소원(유기 및 무기성 질소원 물질)즉 펩톤, 이스트추출물, 이스트, 옥수수적신액체, 요소, 암모니움염류 등, 그리고 하나 혹은 그 이상의 유기 및 무기염류 즉 인산염, 마그네슘염류 등을 함유한다. 생장에 필요한 기타 물질 즉 비타민도 첨가될 수 있다. 이러한 고체 및 액체 배양배지에 필요한 물질은 곰팡이 배양기술지에 잘 알려져 있으므로, 상세한 설명은 필요없을 것이다. 액체 배양은 안정배양, 진탕배양 혹은 심부배양같은 어떤 통상적인 방법으로도 행해질 수 있다. 경제적이고 용이한 면에서, 액체배양이 고체배양 보다 좀 더 이롭다.

액체배양을 행할 때 하기 조건이 사용될 수 있다.

처음 pH 2-9 배양시간 3-30일

배양온도 15-35℃

심부배양의 경우 배지는 30-500r.p.m의 속도로 교반시키면서 0.1-2.0L/L/min속도로 통기시킨다. 고체나 액체배양에서 자란 균사체를 통상적인 방법에 따라 모으고 본 발명의 출발물질로 사용한다.

예를들면, 액체배양의 경우, 균사체를 생성한 액체배양 배지를 통상적인 분리 공정 즉, 원심분리여과하여 모을 수 있다. 이런 분리공정에 따라 얻은 여액을 여과된 육즙에 넣어 본 발명의 출발물질로 사용한다.

본 발명에 따라, 상기한 방법에 따라 모은 기질 및/혹은 균사체를 수용성 용매로 추출한다. 이런 경우 기질 및/혹은 균사체는 그와같이 직접 추출할 수 있다. 원한다면 그런 추출전에, 기질 및 혹은 균사체를 물로 세척, 공기건조, 분말화 혹은 비극성 용매로 추출하는 등의 전처리를 할 수 있다.

추출에 사용되는 수용성 용매는 물이나 물 및 적어도 하나의 수용성 물질 즉, 산, 염기, 염 혹은 유기용매와의 혼합물이다. 전처리 되거나 전처리 되지 않은 기질이나 균사체를 수용성 용매와 혼합한다. 용매의 온도는 120℃이하만 유지하면 중요하지 않다. 바람직한 온도는 경제적인 측면에서 선택될 수 있다.

추출은 원하는 추출효과에 충분한 시간동안 행한다. 일반적으로, 고온에서의 추출시간을 단축될 수 있다. 상기한 바람직한 온도범위 내에서, 추출은 30분-10시간동안 바람직하게 행해진다. 추출은 유리, 유리선, 에나멜 혹은 스테인레스 철로된 용기내에서 교반하에 하는 것이 바람직하다. 용매의 양은 넓은 범위로 변할 수 있으나 일반적으로 기질 및/혹은 균사체의 중량(건조시)의 10-100배이다. 분말화된 기질이나 균사체의 사용이 추출에 바람직하다. 추출후, 균사체나 기질 및 기타 고체물질을 여과나 원심분리같은 통상의 방법에 의해 액상 추출물로부터 제거한다. 액상추출물을 예를들어 진공증발이나 그 이상의 처리를 하여 농축시킨다.

일반적으로 수용성 추출물을 처음 부피의 1/3-1/10로 농축시킨다.

상기에서 얻은 추출물을 정제하여 침전시키고 원하는 다당류를 회수한다. 여기서 사용한 "액상추출물"이라는 용어는 균사체 및/혹은 기질 그리고 기타 고체물질을 추출물로부터 제거한 결과 생긴 여액이나 원심분리액이다.

여과된 육즙이 사용될 수 있으며, 정제하여 침전시키고 원하는 다당류를 회수하는 것이 바람직하다. 여기서 사용된 "여과된 육즙"이라는 용어는 활성성분, 즉 다당류를 함유하고, 상기한 방법에 따라 액체배양에 의해 균주가 배양되온 배양배지인 배양된 육즙으로부터 균사체 및 기타 고체물질을 제거하여 얻은 여액을 말한다. 여과된 육즙을 진공증발이나 그와 유사한 처리를 하여 농축시킨다.

일반적으로 여과된 육즙을 처음 부피의 1/3-1/10까지 농축시킨다. 농축된 여과육즙을 정제한다.

액상추출물 및 여과된 육즙을 각각 정제하거나 액상추출을 및 여과된 육즙을 합해 혼합물을 정제한다. 정제는 하기 공정중 어느것에 의해서도 행할 수 있다.

(A) 매우높은 극성 유기용매(즉 저급 알코올류 및 케톤류, 예를들면 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 아세톤 등)를 가하거나 염석(황산암모니움, 염화나트륨, 염화칼륨 등을 가하여)시키므로써 원하는 물질을 침전시킴.

(B) 투석, 겔여과(덱스트란이나 폴리아크릴아미드겔 즉, 세파덱스, 비오-겔 등을 사용하여), 이온교환수지처리(여러가지 상업용 음이온 및 양이온 교환수지 즉 맘베르리트, 도웩스, 두오리트 등을 사용하므로써), 한외여과 및 그의 혼합으로써 산류, 이온류 및 저분자량 물질을 제거하여 실질적으로 순수한 용액을 얻고 그로부터 원하는 활성물질을 회수한다.

(C) 세벡(sevag)방법, 트리폴로로트리클로로메탄 방법, 단백효소 처리같은 유리단백질 제거를 위한 처리 이러한 공정들은 모두 잘 알려져 있다. 원한다면 2 혹은 2이상을 합하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 그러나, 농축 후에 액상추출물이나 여과된 육즙을, 탈색, 탈산성화 및 저분자 물질의 제거효과를 위해, 이온 교환수지처리, 투석, 겔여과, 한외여과 및 그의 혼합므로부터 선택된 공정을 실시한다. 그러한 정제된 용액으로부터, 원하는 활성 성분은 냉동건조같은 적당한 공정에 의해 해수될 수 있다. 원한다면 상기한 공정(들)을 반복하여 원하는 정도의 정제물을 얻는다.

이와같이 해서 얻은 물질은 하기 특성을 갖는다.

(1) 이 물질은 희거나 약간 브라운 색을 띤 분말이고 비-투석성이다.

(2) 몰리시(Molisch)반응, 안트론(Anthron)반응 및 닌히드린(ninhydrin)반응에 양성이다.

(3) 엘손-모르게안(Elson-Morgain)반응에 약한 양성이거나 음성이다.

(4) 요드반응과 비알(Bial)반응에 음성이다

(5) 이 물질은 물과 유기성 용매, 산, 염기성염 및 그 유사체와 같은 수용성 물질의 수용액에 가용성이나 석유에테르, 에틸에테르, 벤젠, 아세톤, 에탄올, 메탄올같은 유기용매에는 불용성이다.

(6) 이 물질은 정확한 융점이 없고 강한 열에 탄소화된다.

(7) 0.1N 수용성 황산에 이 물질을 녹이고 이 용액(0.5중량 백분율의 이 물질을 함유)을 100℃에서 5시간 가열하여 얻은 이 물질의 가수분해물은 적어도 하나 혹은 그 이상의 글루코스, 갈락토즈 및 만노즈, 그 종류나 정제량에 따라 변하는 당류를 함유한다.

(8) 이 물질의 원소분석 결과는 C35.78%, H : 6.28% N : 0.65%이다.

상기 특성으로부터, 이 물질은 상기한 당으로 구성되고 적어도 8000분자량을 갖으며 평균분자량이 약2×10⁵인 고분자 다당류라고 믿어진다.

본 발명의 다당류는 세포독성이나 통상적인 약제 사용시 흔히 볼 수 있는 부작용 즉 백혈구수의 감소, 간 및 기타 기관의 빈혈, 비장위축, 체중감소 및 식욕손실 등을 나타내지 않는다.

쥐에 있어서 이 다당류의 심한 독성(LD₅₀)은 복강내주사시 2000mg/kg 이상이었다.

본 발명의 다당류는 항암활성이 있다. 항암활성은 하기 시험에 의해 확인되고 결정되었다.

20±2g ICR-JCL 균주의 쥐를 사르코마-180 암세포나 에르리히(Ehrlich)양세포로 복강내에 접종했다. 접종 1주일 후에 복수액의 충분한 증가를 쥐안에서 관찰했다. 그 안의 암세포는 매쥐마다 4000,000 세포의 속도로 다른 쥐들의 겨드랑이에 피하이식되었다. 이 쥐들은 각각 5-8마리의 여러군으로 나뉘어었다. 처음군(대조군)은 오직 식염만 투여하고 기타 군은 모두 본 발명의 다당류를 투여했다. 식염이나 다당류의 처음 투여는 하루 이식 후에 복강내에서 행해졌고 연속적인 투여를 2일에 한번씩 5번 반복했다. 쥐에 이식된 고체암을 볼 수 있었고 마지막 투여 일로부터 18일째 체중의 평균증가율을 측정하고 부작용을 측정하고 다당류 치료군으로부터 제거된 종양과 마찬가지로 대조군으로부터 제조된 종양의 양을 측정하기 위해 해부했다. 하기표에 나타난 "억제율(IR)"은 다음 식에 따라 계산되었다.

여기서

는 매 대조군 쥐로부터 제거된 종양의 평균 중량이고 T는 다당류로 치료된 군의 쥐로부터 제거된 종양의 평균 중량이다.

쥐에 있어서 선천성 종양에 대한 항암활성도 또한 측정되었다. 시험방법은 종양을 사용, 쥐의 군체 그리고 투여방법을 제외하고는 상기에 기술된 것과 같다. 선천성 쥐에 있어서는 고체형태의 3-메틸 콜안트렌-유도 사르코마(Meth A)을 BALB/C, 사용했다. 이 시험에 사용된 군체는 일본의 BALB/C이었다. 투여방법은 종양내 투여다.

본 발명의 다당류가 사르코마-180, 에르리히 카르시노마 및 메트(Meth)-A에 대해 강한 항암활성을 나타낸다는 것이 확인되었다.

도면을 부분적으로 참조한 하기 실시예에서 본 발명을 더욱 설명할 것이고 여기서 그림 1,2 및 3은 본 발명에 따른 다당류의 적외선 스펙트럼이다(KBr정).

[실시예 1]

균주(FERM-p5086, ATCC(20603)이사리아아티피콜라 야수다를 하기 액체 배양배지에서 배양시켰다.

클루코스 20g

폴리펩톤(Daigo) 5g

이스트 추출물(Difco) 1g

인산칼륨(1급) 1g

황산 마그네슘(7H₂O) 0.5g

물 1리터

처음 pH 5.6-5.8 (조정없이)

100ml의 상기 배양배지를 각각의 500ml 엘렌마이어 플라스크에 넣어 배양시켰다. 플라스크를 솜으로 막고 120℃에서 30분간 멸균시켰다. 냉각시킨 후, 2%글루코즈, 0.5%에비오스 및 1.5%의 한천을 함유한 사면 배양배지에서 각각 배양되면 상기 균주를 통상적인 방법에 따라 접종시켰다. 27℃의 진탕배양기에서의 7일 후에 플라스크의 내용물을 연속적인 배양을 위해 사용했다. 30ℓ의 스텐레스철 발효기내의 상기 액체배양배지 20ℓ를 120℃에서 30분간 멸균하고 냉각시켰다. 상기 얻은 플라스크 내용물을 상기 발효기내의 배양배지에 접종시켰다. 배지를 27℃에서 16일간 교반(250r.p.m)하면서, 그리고 0~5ℓ/ℓ/min의 속도로 통기시키면서 호기성 배양을 했다.

이와같이 얻은 배양육즙을 여고하여 1700g의 균사체(젖은)와 15ℓ의 여과된 육즙을 얻었다. 균사체를 1ℓ의 물로 세척하고 세척액체를 여과된 육즙과 합했다. 세척된 균사체를 2ℓ의 물과 혼합한 혼합물을 120℃에서 30분간 밀폐된 용기에서 가열했다. 혼합물을 실온까지 식히고 여과한 후 여액을 1ℓ까지 농축시켰다. 농축된 액상추출물로 물로 투석하고 냉동 건조하여 4.0g의 백색 엷은 갈색 분말 물질을 얻었다. 이 물질은 적외선 스펙트럼은 그림 1에 있다. 여과된 육즙(16ℓ)을 2ℓ까지 농축시키고 물로 투석한 후 냉동건조하여 26·5g의 백색-엷은 갈색 분말 물질을 얻었다.

이 물질의 적외선 스펙트럼은 그림 2에 있다.

이 다당류 물질의 항암활성은 하기표 1과 2에 나타나 있다.

[표 1]

암 세 포 : 사르코마 180/4×10⁶세포/쥐

동물군체 : ICR-JCL 20g±2g.

치 료 : 이식한지 1일 후에 복강내투여(대조군 : 식염) 5번

판 정 : 고체형 종양무게

IR(억제율)=(C-T)/C 100

C : 대조군으로부터 제거된 종양의 평균중량

T : 다당류로 치료된 군으로부터 제거된 종양의 평균중량

[표 2]

방세포 : 에르리히 카르시노아 4×10⁶세포/쥐

동물균체 : 치료 및 판정을 표 1과 같다.

[실시예 2]

실시예 1과 같은 방법으로 FERM-P5086, ATCC 20603균주를 발효기에서 배양했다. 여과된 육즙(16ℓ)를 하기 방법에 따라 정제했다. 이와같이 여과된 육즙을 진공증발에 의해 2ℓ로 농축시키고 농축물을 흐르는 물에서 24시간 투석시켰다. 투석물(2.5ℓ)을 수용성 NaOH로 pH8.0으로 맞추고 DEAE-세파덱스 처리를 했다. DEAE-세파덱스를 통과한 액체를 에탄올과 함께 가해 50%알코올 농도로 만들어 침전을 형성하고 이것을 1ℓ의 물에 녹여 다시 흐르는 물에 24시간 투석시켰다. 투석물을 냉동건조하여 24.9g의 고체물질(다당류)를 얻었는데 이것은 백색-엷은 갈색의 분말물질로 글루코즈, 갈락토스, 만노스로 구성되어 있다. 이 물질의 적외선 스펙트럼은 그림 3과 같다. 쥐에 있어서 이 물질의 항암활성은 다음과 같다.

(A) 쥐에 있어서의 항암활성(사르코마-180)

암세포 : 사르코마-180/4×10⁶세포/쥐

동물군체 : ICR-JCL 20±2g

치료=: 이식한지 1일 후에 복강내투여(대조군 : 식염) 5번

판 정 : 고체형종량의 중량

IR(억제율)=(C-T)/C×100

C : 대조군으로부터 제거된 종량의 평균중량

T : 다당류의 치료된 군으로부터 제거된 종양의 평균중량

(B)쥐에 있어서의 항암활성(사르코마-180)

치 료 : 이식한지 1일 후에 정맥내에 투여(대조군 : 식염) 5번

암 세 포 : 동물군체 및 판정은 (A)와 같다.

(C) 쥐에 있어서의 항암활성(매트 A)

암 세 포 : 메트 A2×10⁴세포/쥐

동물군체 : BALB/C 20±2g

치 료 : 이식한지 1일 후 매일 종양내에 투여(대조군 : 식염)10번

판 정 : (A)와 같다.

[표 3]

Claims (1)

1. 항암성 다당류를 생산할 수 있고 하이포마이세테스류의 이사리아 속에 속하는 균주의 기질이나 균사체의 액상추출물이나 배양 배지로부터 여과된 육즙을 생성하고 그 여과된 육즙이나 액상 추출물로부터 정제된 형태의 다당류를 회수하는 것으로 구성된, 함암활성을 갖는 다당류의 제조방법.

   제1도, 제2도, 제3도는

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