KR910004367B1 - 항종양성 고분자 글루캔 및 그의 제조방법 - Google Patents
항종양성 고분자 글루캔 및 그의 제조방법Info
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Abstract
내용 없음.
Description
제 1 도는 본 발명 물질의 적외선 흡수 스펙트럼
본 발명은 항종양 작용과 면역조절 작용을 가진 신규 다당류 β-1,3-글루캔(glucan)과 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 β-1,3-글루캔은 오리오바시디움(Aureobasidium)속에 속하는 미생물 변이주(Aureobasidium pullulans L48 : KFCC 10245)를 탄소원, 질소원, 및 그외에 미생물이 필요로 하는 성분들을 포함하는 배지중에서 액침 배양하여 생성된 세포의 다당류를 에탄올 침전으로 회수하고 정제하여 얻은 신규 고분자 다당류로서 글루코즈(glucose)를 주성분으로 하며, 다음 구조식을 갖는 글루코피라노즈(glucopyranose)를 반복체로 중합된 것이다.
본 발명의 β-1,3-글루캔은 사르코마(sarcoma)-180세포, L1210세포와 B16세포에 강한 항종양 작용을 가지며 면역조절 작용으로서 항보체 활성을 가지는 신규의 다당류이다.
최근 미생물에서 유래한 다당류가 우수한 항암작용 및 기타 약리효과를 갖는 유효성분이라는 사실이 밝혀짐에 따라 이 물질을 제조하는 방법과 그것의 물리 화학적 성질 및 생물학적 작용에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 지금까지 다음과 같은 몇가지 항종양성 β-1, 3-글루캔이 밝혀져 있다.
(1) 렌티난(Lentinan)
랜티너스 에도데스(Lentinus edodes(Berk))로 부터 생성된 β-1,3-글루캔으로 제안된 화학적 구조는 다음과 같다.
(Nature 222, 687-688, 1969 ; Carbohydr. Res. 47, 99-104, 1976)
(2) 스키조필란(Schizophyllan)
스키조필럼 코뮨( Schizophyllum commune(Fries))으로 부터 생성된 β-1,3-글루캔으로 제안된 화학적 구조는 다음과 같다.
(일본 농예화학회지 44, 337-342, 1970 : 동학회지 45, 162-168, 1971)
(3) 바시디오미세테스(Basidiomycetes)강의 아우리클라리아(Auriclaria)속으로부터 생성된 β-1,3-글루캔으로 제안된 화학적 구조는 다음과 같다.
(일본 특허 공개 번호 제63012/1979참조)
(4) 디스코미세테스(Discomycetes)강의 슈도플렉타니아(Pseudoplectania)속에 속하는 균주로부터 생성된 β-1,3-글루캔으로 제안된 화학적 구조는 다음과 같다.
(한국 특허 공고 번호 87-1814 참조)
이들 공지의 β-1,3-글루캔과 본 발명의 β-1,3-글루캔은 D-글루코피라노즈 단위체의 β-(1,3)-결합 주쇄와 β-(1,6)-연결된 D-글루코피라노즈 측쇄를 일반적으로 갖는 바, 본 발명 구조식 (Ⅰ)의 물질은 (Ⅱ)-(Ⅴ)의 물질과 비교할 때 β-1,3 고리의 수와 β-1,6 축쇄고리의 수의 비율에 있어서 공지의 β-1,3-글루캔과는 상이하며 항종양 작용에 있어서 사르코마-180세포뿐만 아니라 L1210세포 및 B16세포에 대해서도 강한 효과를 나타내고 면역조절 작용으로서 항보체 작용을 갖는다.
본 발명의 β-1,3-글루캔에 대한 화학적 구조 및 성질은 다음과 같다.
(1) 화학적 구조
본 발명의 β-1,3-글루캔의 화학적 구조는 반복되는 단위체로서 구조식(Ⅰ)로 표시되며 다음 실험에 의해 확인할 수 있다.
1) 본 다당류를 하코모리법에 의해 메틸화 시킨 후 가수분해하면 2,3,4,6-테트라-O-메틸-D-글루코즈, 2,4,6-트리-O-메틸-D-글루코즈와 2, 4-디-O-메틸 -D-글루코즈를 얻는데 이들은 박층 크로마토그라피법과 가스크로마토그라피법에 의해 확인되었으며 그들의 몰비는 각각 0.33 : 1 : 0.33이다.
2) 본 다당류를 과요오드산염 산화반응(15mM의 과요오드산염에 의해)시키면 개미산 0.2물을 유리시키면서 무수 글루코즈 단위체당 0.4몰의 과요오드산염을 소비한다.
3) 상기 산화된 생성물을 스미스변화법으로 처리하면 글리세롤과 글루코즈(몰비 1 : 4)를 얻는다.
4) 상기 산화되고 환원된 생성물을 약하게 가수분해(0.03M의 황산)하면 글리세롤과 비수용성물질을 얻으며 이 비수용성 물질을 메틸화 및 가수분해하면 유일하게 2, 4, 6-트리-O-메틸-D-글루코즈를 얻는다.
5) 본 다당류를 효모로부터 유도된 엑소 -β-1,3-글루카나제로 처리하면 D-글루코즈와 겐티오비오스를 형성하며 고압 액체크로마토그라피법에 의해 그들의 몰비를 측정하면 1 : 0.33이다.
(2) 성상
회백색 내지 연갈색을 띠며 무미, 무취이다.
(3) 분자량
평균 분자량은 1.0×104정도이다.(겔여과법)
(4) 융점
명확한 융점은 없으나 220내지 240℃에서 갈변하기 시작한다.
(5) 용해성
물과 디멜틸황화물에는 용해할 수 있으나 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠 및 에틸아세테이트는 용해할 수 없다.
(6) 정색반응
몰리쉬(Molish)반응, 인돌-황산반응(디쉬반응), 안트론-황산반응, 페놀-황산반응에 양성을 나타낸다.
(7) 적외선 흡수 스펙트럼
브롬화 칼륨에 따라 측정된 본 물질의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 제 1 도에 나타낸 바와 같이 3,600-3,200㎝-1, 2,930-2,910㎝-1, 2,350㎝-1, 1,660-1,610㎝-1, 1,460㎝-1, 1,410㎝-1, 1,370㎝-1, 1,320㎝-1, 1,200-1,000㎝-1, 890㎝-1,에 흡수대가 있다. 3,600-3,200㎝-1의 흡수대는 수소 결합되어 있는 OH에 의한 것이고, 1,200-1,000㎝-1의 흡수대는 당류부분에서 피라노즈 고리내에 있는 C-O-C결합의 비대칭성 진동에 의한 것이며, 890㎝-1에서의 흡수대는 글루캔의 β-글리코시드 결합에 의한 것이다.
(8) 용액의 pH
0.5%수용액의 pH는 7.0내지 7.5이다.
(9) 구성 다당류
본 발명에 따라 얻어진 물질에 염화수소-메탄올을 가하고 100℃에서 16시간 메타놀리시스(methanolysis)를 행하여 얻어진 메타놀리시스화물을 건조한 후 피리딘에 용해하여 헥사-메틸디실란산과 트리메틸클로로실란을 가하여서 트리메틸실릴화(trimethylsilylation)한 다음, 가스크로마토그라피 시험을 한 결과 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈를 함유하며 각각의 비율은 94 : 5 : 1 이다.
상기한 바와 같이 본 발명의 β-1,3-글루캔은 구조식(Ⅰ)의 구조를 갖는 반복체로 중합된 것이고 (2)-(9)의 물리,화학적 성질을 갖는 신규의 β-1, 3-글루캔이다.
본 발명의 β-1,3-글루캔은 오리오바시디움속에 속하는 미생물 변이주를 액침배양함으로써 얻어질 수 있으며 배지조성 중에는 L-아스코르브산을 함유하면 좋고 배양온도를 15-30℃로 유지하여야 한다.
상기 조건하에서 배양 완료된 배양액으로부터 세포의 다당류를 에탄올 침전으로 회수하고 염과 저분자 물질을 제거하기 위하여 투석, 한외여과, 역삼투압, 중공 섬유장치(Hollow fiber system) 등을 사용한다.
본 발명의 β-1,3-글루캔은 항종양 작용 및 면역조절 작용을 갖는다. 신규 β-1,3-글루켄은 ICR 마우스에 이식한 사르코마-180세포에 대해 우수한 종양 저지율을 가지며 L1210세포와 B16세포를 복강내에 이식한 BDF1마우스에 있어서 생존율을 현저하게 증가시킨다. 또한 항원-항체반응에 의하지 않고 비특이적으로 보체계(Complement system)를 활성화하는 항보체 작용을 갖는다. 본 발명의 신규 β-1,3-글루캔은 시험관에서의 직접 세포독소나 종래의 약품을 사용할 때 일반적으로 나타내는 부작용(백혈구의 감소, 간 및 기타기관의 빈혈, 비장의 쇠퇴, 체중 손실 및 식욕감퇴)이 없으며 β-1,3-글루캔의 급성독성(LD50)은 복강내에 투여될 때 1,000mg/kg 이상이다.
다음의 실시예에서 본 발명 물질의 제법을 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
[공정 1]
오리오바시디움 풀루란스 KFCC 10245를 원당 10g/ℓ, 미강 2g/ℓ, L-아스코르브산 2g/ℓ를 포함한 배지(초기 pH 5.5, 115℃에서 15분간 살균)에서 배양하였다.
상기 배치 100ml를, 각각의 500ml 진탕배양용 플라스크에 넣어 5%원당, 효모추출물 0.2%, 한천 1.5 내지 1.8%를 함유하는 고체배지에서 별도로 상기 균주를 접종한 후 20±2℃에서 2일간 배양한 것을 본 배양의 종배양으로 사용하였다. 종배양된 배양액을 상기 배치 3L를 포함한 5L-발효조에 식균하여 20±2℃에서 100rpm으로 3일 내지 4일간 배양하였다.
[공정 2]
상기 공정 1에서 배양 완료된 배양액으로부터 생성된 세포의 다당류를 회수하고 정제하였다. 즉 배양액 10L를 원심분리하거나 30분간 초음파처리한 후 원심분리하여, 상등액을 취하고 클로로포름 : 부탄올(9 : 1)을 균체분리액의 10% 부피로 가하여 2-3시간 흔들면서 섞어준 후, 원심분리하여 유리 단백질을 제거하였다(세박처리).
상기 세박처리를 2회 반복하였으며 그 처리액을 수욕상에서 감압 농축하고 농축액에 3배 부피의 4℃에탄올을 가하여 침전을 형성시키며 침전물을 회수하여 4℃에탄올로 2회 세척하였다. 침전물을 증류수에 용해시켜 투석막(스펙트럼사, 분자량 분리크기 3,000)을 사용하여 3일간 투석하였다. 이 액을 농축한 후 중공섬유장치(아미콘사, 카트리지 분자량 크기 100,000)를 사용하여 투석여과하고 여과된 액을 농축, 동결건조하여 회백색 내지 연갈색분말 1g을 얻었다.
[실시예 2]
오리오바시디움 플루란스를 실시예 1과 동일한 배지조성에서 배양온도를 각각 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃로 하여 배양한 후 상기 실시예 1과 동일하게 정제하여 동결건조하였을 때 최종적으로 얻은 분말의 양은 각각 다음 표 1과 같았다.
[표 1] 배양온도에 따른 β-1,3-글루캔의 생성량
상기 각 실시예에서 제조한 물질을 0.5% 수용액으로 하였을 때 pH는 7.0 내지 7.5이었으며 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠 및 에틸 아세테이트에 불용성이었다. 몇가지 정색반응 결과 몰리쉬반응, 인돌-황산반응(디쉬반응), 안트론-황산반응, 페놀-황산반응에 양성을 나타내었으며, 브롬화 갈륨에 따라 측정된 본 물질의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 제 1도에 나타낸 바와 같다.
전술한 방법에 따라 가스크로마토그라피에 의하여 구성 단당류를 분석한 결과는 표 2와 같다.
[표 2] 본 발명에서의 β-1,3-글루캔의 구성 단당류
상기 물질의 화학적 구조는 전술한 1)-5)의 방법에 따라 분석하였다. 하코모리법에 의해 메틸화시킨 후 가수분해하여 형성된 메틸화물을 가스크로마토그라피로 분석한 결과는 표 3과 같으며 과요오드산염 산화반응 시켰을 때 생성된 개미산과 소비된 과요오드산염의 비율을 측정한 결과 글루코즈 단위체당 몰비는 0.2 : 0.4이었다.
[표 3] 하코모리법에 의한 본 발명의 β-1,3-글루캔의 분석결과
상기 산화된 생성물을 스미스변화법으로 처리하면 글리세롤과 글루코즈가 생성되며 몰비는 1 : 4이었다. 산가수분해법에 의해 상기 산화되고 환원된 생성물을 0.03M 황산으로 약하게 가수분해하여 생성된 비수용성 물질을 메틸화 및 가수분해하면 유일하게 2, 4, 6-트리-O-메틸-D-글루코즈를 얻었다.
본 물질을 효모에서 유래된 엑소-β-1, 3-글루카나제로 처리한 후 생성된 물질을 고압 액체크로마토그라피로 분석한 결과는 표 4와 같다.
[표 4] 본 발명에서의 β-1,3-글루캔을 엑소-β-1,3-글루카나제로 가수분해한 결과
상기의 분석 결과들로 부터 본 물질의 화학구조는 구조식(Ⅰ)의 글루코피라노즈 단위체가 중합된 β-1, 3-글루캔임을 확인할 수 있다.
상기 각 실시예에서 제조된β-1, 3-글루캔은 사르코마-180세포, L1210세포 및 B16세포에 대해 다음과 같은 항종양 작용이 있었다.
(Ⅰ) 사르코마-180세포를 이식한 ICR마우스에 대한 항종양 작용 마우스 복강내에 사르코마-180세포 현탁액 0.1ml(1×107cell/ml)를 이식하여 일주일간 계대배양하였다. 이 마우스를 해부하여 복수액중의 사르코마-180세포를 분리해낸 후 그 세포액 0.1ml(1×107cell/ml)씩을 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 주사하여 고형암을 유발시켰다. 이 마우스를 대조군과 처치군으로 나누어 대조군에는 생리식염수를 처치군에는 생리식염수에 녹인 상기의 β-1,3-글루캔을 여러 농도로 조제하여 복강내에 각각 주사하였다. 암을 이식한 후 1일 후 부터 β-1,3-글루캔을 격일간으로 1회씩 10회 주사하고 최종 투여후 5일째에 마우스를 모두 치사시키고 고형종양을 적출해 내어 종양의 무게를 측정하였다. 항종양 작용의 지표로서 종양의 저지율을 다음과 같은 식에 의해 구하였을때 표 5와 같은 결과를 얻었다.
Cw: 대조군의 평균종양무게
Tw: 처치군의 평균종양무게
[표 5] β-1,3-글루캔의 사르코마-180세포에 대한 항종양 작용
(2) L1210세포 또는 B16세포를 복강 투여한 BDF1마우스에 대한 항종양 작용
L1210세포 또는 B16세포액을 0.1ml씩 BDF1마우스 복강내에 이식하고 대조군과 처치군으로 나누어 대조군에는 생리식염수를 처치군에는 생리식염수에 상기 각 실시예에서 제조한 β-1,3-글루캔을 여러 농도로 조제하여 복강내에 각각 주사하였다. 암세포를 이식한 후 1일 후 부터 β-1,3-글루캔을 매일 1회씩 10회 주사하고 마우스의 평균 생존일수를 측정하였다. 항종양 작용은 다음식에 의해 계산된 생존연장율로 표시하였으며 그 결과는 표 6, 표 7과 같다.
[표 6] β-1,3-글루캔의 L1210세포에 대한 항종양 작용
[표 7] β-1,3-글루캔의 B16세포에 대한 항종양 작용
(3) 면역조절 작용으로서 항보체 작용
일반적으로 항종양성 다당류는 면역계를 비특이적으로 활성화하여 작용을 갖는 것으로 알려져 있으며, 상기 각 실시예에서 제조한 β-1,3-글루캔은 항원-항체반응에 의하지 않고 보체계를 활성화시키는 항보체작용이 있는 것을 알 수 있었다. 상기 각 실시예에서 제조한 β-1,3-글루캔을 여러 농도로 조제하여 보체(Gibco, 기네아 피그 보체)와 섞은 후 37℃에서 30분간 반응시켜 남아있는 총 혈액분해 보체의 양(Total Hemolytie Complement, TCH50)을 헤모리신(Antisheep-hemolysin)으로 감작시킨 양의 적혈구(1×109cell/ml)를 사용하여 측정하였다. 대조군은 β-1,3-글루캔이 없이 진행한 것을 사용하였고 항보체 작용은 다음고 같이 계산하였으며 그 결과는 표 8과 같다.
[표 8] β-1,3-글루캔의 항보체 작용
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KR1019890012824A KR910004367B1 (ko) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | 항종양성 고분자 글루캔 및 그의 제조방법 |
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KR910006494A KR910006494A (ko) | 1991-04-29 |
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---|---|---|---|---|
KR100666055B1 (ko) * | 2005-01-19 | 2007-01-09 | 한국효소 주식회사 | 수용성 베타글루칸의 제조방법 |
-
1989
- 1989-09-05 KR KR1019890012824A patent/KR910004367B1/ko not_active IP Right Cessation
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KR910006494A (ko) | 1991-04-29 |
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