CN112552418A - 从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,具体的涉及一种从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法。将红曲霉发酵液抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液减压,加入乙酸乙酯萃取,然后除去乙酸乙酯层;向得到的水层中加入粉末状活性炭,磁力搅拌,然后抽滤除去;滤液经减压浓缩,然后将其透析;将浓缩液倒入乙醇溶液中,于1‑5℃下放置,使其沉淀;离心得沉淀部分,洗涤烘干,得多糖粗品;将多糖粗品配制成浓度为5‑6%的溶液,加入Sevag溶液,漩涡震荡,然后离心;将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩冷冻干燥,即得到粗多糖。本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,提取的胞外多糖的收率及纯度高,且不会破坏胞外多糖的活性。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体的涉及一种从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法。
背景技术
红曲霉作为常见的丝状真菌,广泛分布于自然环境中,其能在26-42℃温度范围内生长,32-35℃之间为最适生长温度。红曲霉所能利用的碳源与氮源也较为常见,其可以利用常见的农副产品作为发酵基质。
红曲霉菌具有产生胞外多糖的能力,并且该多糖是由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物,具有明显的生物学活性,例如:抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、免疫调节等方面,此外,还有放射保护、保肝解毒作用等。其最重要的免疫调节活性,广泛用于免疫缺陷疾病及肿瘤疾病的临床治疗及医药领域,己成为分子生物学、医药学的研究热点。红曲霉深层液体发酵的发酵液中含有大量多糖,经离心、醇沉得到的粗多糖和生物量在研究领域有着广泛意义。
目前,对红曲霉发酵液胞外多糖的提取回收研发较少,现有的提取方法工艺繁琐,回收率低,因此,有必要探索一种新型的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法。
发明内容
本发明的目的是:提供一种从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法。该提取方法得率高,设备简单,且不会破坏多糖的活性和结构。
本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,由以下步骤组成:
(1)将红曲霉发酵液抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液减压浓缩为原体积的20%-30%,加入等体积的乙酸乙酯萃取,然后除去乙酸乙酯层;
(2)向得到的水层中加入粉末状活性炭,室温下磁力搅拌,然后抽滤除去活性炭粉末;
(3)滤液经减压浓缩至原体积的5%-10%,然后将其透析,将透析完的保留液减压浓缩至原体积的5%-10%,重复透析2-3次;
(4)将浓缩液倒入乙醇溶液中,边倾倒边搅拌使其混合均匀,于1-5℃环境下放置20-24h,使其充分沉淀;
(5)离心得沉淀部分,采用无水乙醇和丙酮分别洗涤沉淀2-3次,将最终获得的沉淀烘干,得多糖粗品;
(6)将多糖粗品配制成浓度为5-6%的溶液,加入Sevag溶液,漩涡震荡,然后离心,吸取上层多糖溶液重复操作至界面无白色胨状物出现为止;
(7)将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩后冷冻干燥,即得到粗多糖。
其中:
步骤(1)中所述的红曲霉发酵液的发酵条件为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,配方组成为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克以及蒸馏水1000毫升;28℃摇床培养15天。
红曲霉采用中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 3.15547的菌种。
其中,编号为CGMCC 3.15547的菌种,其在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编:100101,菌种的拉丁文名称是:Monascus purpureus。
步骤(1)中所述的采用2-3层滤纸抽滤除去菌丝体和不溶物。
步骤(1)中所述的加入等体积的乙酸乙酯萃取1.0-2h,除去乙酸乙酯层,重复操作3-5次。
步骤(2)中所述的粉末状活性炭的加入量为体积分数1.0%-1.5%,磁力搅拌24-26h,然后采用2-3层滤纸抽滤以除去活性炭粉末。
步骤(3)中所述的于MwCO3500的透析袋中透析12-18h。
步骤(4)中所述的乙醇的浓度为95%,乙醇的体积是倒入的浓缩液体积的10-12倍。
步骤(5)中所述的洗涤沉淀2-3次用于脱水和除去部分脂溶性物质,并于50-55℃烘干12-24h。
步骤(5)中所述的离心转速为3000-4000r/min,离心时间10-15min。
步骤(6)中所述的Sevag溶液为氯仿:正丁醇=4:1的体积比混合液,Sevag溶液加入的体积为多糖溶液体积的15%-25%。
步骤(6)中所述的漩涡震荡10-15min,然后于7000-8000r/min转速下离心8-12min。
步骤(7)中所述的离心转速为3000-4000r/min,离心时间10-15min,冷冻干燥温度为-10℃至-50℃,干燥室真空度<0.11MPa,干燥时间24-28h。
作为一个优选的技术方案,本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,由以下步骤组成:
将红曲发酵液(发酵条件:马铃薯葡萄糖琼脂培养基,28℃摇床培养15天)经两层滤纸抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液经减压旋蒸浓缩为原体积的20%,加入等体积的乙酸乙酯萃取1.5h后,除去乙酸乙酯层,重复操作3次。
向得到的水层中加入1%-1.5%的粉末状活性炭,室温下磁力搅拌24h,然后两层滤纸抽滤以除去活性炭粉末。
将滤液经减压浓缩至原体积的10%,透析脱盐12h,重复2-3次。
将浓缩液倒入乙醇溶液中,边倾倒边搅拌使其充分混合,放置4℃冰箱中24h使其充分沉淀。
离心得沉淀部分,采用无水乙醇和丙酮洗涤沉淀各2次以脱水及除去部分脂溶性物质,将最终获得的沉淀置于50℃烘箱中烘干,得多糖粗品。
将多糖粗品配制成5%的溶液,加入约1/5其体积的Sevag溶液(氯仿:正丁醇=4:1,v/v),漩涡震荡10min,然后7000r/min转速下离心10min,小心吸取上层多糖溶液重复操作至界面无白色胨状物出现为止。
将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩后冷冻干燥,即得到粗多糖。
本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,创造性的加入了透析过程,透析除去了分子量3500以下的小分子水溶性物质比如无机盐等,降低了最终产品的杂质含量,提高了产品中多糖的纯度。经透析后产品中多糖含量普遍在95%以上,未经透析的产品多糖含量一般只有60%-70%。
本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,创造性的加入了除蛋白过程。该步骤除去了大部分游离蛋白,降低了最终产品的蛋白质含量,提高了产品中多糖的纯度。除蛋白后的产品中蛋白质含量小于5%,未除蛋白的蛋白质含量能达到10%-20%。
本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,创造性的采取乙酸乙酯萃取纯化。萃取除去了一部分脂溶性物质,最终结果也是提高了产品中多糖的纯度。由于微生物发酵液中脂溶性物质数量较少,该步骤能提高产品中多糖纯度5%。
总之,未经上述方法处理的产品中多糖含量不足50%,其中杂质中小分子水溶性物质比如无机盐能占20%-30%,蛋白质占10%-20%,脂溶性物质5%-10%。经过上述步骤处理后粗多糖纯度能达95%及以上。
本发明与现有技术相比,具有以下有益效果:
(1)本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,提取的胞外多糖的收率及纯度高,且不会破坏胞外多糖的活性。
(2)本发明所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,方法简单,易于实施,且能够带来一定的经济效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,由以下步骤组成:
(1)将红曲霉发酵液抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液减压旋蒸浓缩为原体积的20%,加入等体积的乙酸乙酯萃取,然后除去乙酸乙酯层;
(2)向得到的水层中加入粉末状活性炭,室温下磁力搅拌,然后抽滤除去活性炭粉末;
(3)将滤液经减压浓缩至原体积的10%,然后将其透析,将透析完的保留液减压浓缩至原体积的10%,重复透析3次;
(4)将浓缩液倒入乙醇溶液中,边倾倒边搅拌使其混合均匀,于4℃环境下放置20h,使其充分沉淀;
(5)离心得沉淀部分,采用无水乙醇和丙酮分别洗涤沉淀2次,将最终获得的沉淀烘干,得多糖粗品;
(6)将多糖粗品配制成浓度为5%的溶液,加入Sevag溶液,漩涡震荡,然后离心,吸取上层多糖溶液重复操作至界面无白色胨状物出现为止;
(7)将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩后冷冻干燥,即得到粗多糖。
其中:
步骤(1)中所述的红曲霉发酵液的发酵条件为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,配方组成为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15克以及蒸馏水1000毫升;28℃摇床培养15天。
红曲霉采用中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 3.15547的菌种。
其中,编号为CGMCC 3.15547的菌种,其在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编:100101,菌种的拉丁文名称是:Monascus purpureus。
步骤(1)中所述的采用2层滤纸抽滤除去菌丝体和不溶物。
步骤(1)中所述加入等体积的乙酸乙酯萃取1.5h,除去乙酸乙酯层,重复操作3次。
步骤(2)中所述的粉末状活性炭的加入量为体积分数1.5%,磁力搅拌24h,然后采用2层滤纸抽滤以除去活性炭粉末。
步骤(3)中所述的于MwCO3500的透析袋中透析15h。
步骤(4)中所述的乙醇的浓度为95%,乙醇的体积是倒入的浓缩液体积的10倍。
步骤(5)中所述的洗涤沉淀2次用于脱水和除去部分脂溶性物质,并于50℃烘干24h。
步骤(5)中所述的离心转速为3500r/min,离心时间12min。
步骤(6)中所述的Sevag溶液为氯仿:正丁醇=4:1的体积比混合液,Sevag溶液加入的体积为多糖溶液体积的20%。
步骤(6)中所述的漩涡震荡10min,然后于7000r/min转速下离心10min。
步骤(7)中所述的离心转速为3500r/min,离心时间12min,冷冻干燥温度为-10℃,干燥室真空度为0.10MPa,干燥时间24h。
实施例1从1.24L红曲发酵液中分离得到多糖8.85g,多糖得率为7.14g/L,多糖纯度为96.4%。
实施例2
本实施例2所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,由以下步骤组成:
(1)将红曲霉发酵液抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液减压旋蒸浓缩为原体积的25%,加入等体积的乙酸乙酯萃取,然后除去乙酸乙酯层;
(2)向得到的水层中加入粉末状活性炭,室温下磁力搅拌,然后抽滤除去活性炭粉末;
(3)将滤液经减压浓缩至原体积的8%,然后将其透析,将透析完的保留液减压浓缩至原体积的8%,重复透析3次;
(4)将浓缩液倒入乙醇溶液中,边倾倒边搅拌使其混合均匀,于5℃环境下放置24h,使其充分沉淀;
(5)离心得沉淀部分,采用无水乙醇和丙酮分别洗涤沉淀3次,将最终获得的沉淀烘干,得多糖粗品;
(6)将多糖粗品配制成浓度为6%的溶液,加入Sevag溶液,漩涡震荡,然后离心,吸取上层多糖溶液重复操作至界面无白色胨状物出现为止;
(7)将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩后冷冻干燥,即得到粗多糖。
其中:
步骤(1)中所述的红曲霉发酵液的发酵条件为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,配方组成为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克以及蒸馏水1000毫升;28℃摇床培养15天。
红曲霉采用中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 3.15547的菌种。
其中,编号为CGMCC 3.15547的菌种,其在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编:100101,菌种的拉丁文名称是:Monascus purpureus。
步骤(1)中所述的采用3层滤纸抽滤除去菌丝体和不溶物。
步骤(1)中所述加入等体积的乙酸乙酯萃取2h,除去乙酸乙酯层,重复操作5次。
步骤(2)中所述的粉末状活性炭的加入量为体积分数1.3%,磁力搅拌26h,然后采用3层滤纸抽滤以除去活性炭粉末。
步骤(3)中所述的于MwCO3500的透析袋中透析12h。
步骤(4)中所述的乙醇的浓度为95%,乙醇的体积是倒入的浓缩液体积的12倍。
步骤(5)中所述的洗涤沉淀3次用于脱水和除去部分脂溶性物质,并于53℃烘干18h。
步骤(5)中所述的离心转速为3000r/min,离心时间15min。
步骤(6)中所述的Sevag溶液为氯仿:正丁醇=4:1的体积比混合液,Sevag溶液加入的体积为多糖溶液体积的25%。
步骤(6)中所述的漩涡震荡15min,然后于8000r/min转速下离心12min。
步骤(7)中所述的离心转速为3000r/min,离心时间15min,冷冻干燥温度为-20℃,干燥室真空度为0.09MPa,干燥时间24h。
实施例2从1.07L红曲发酵液中分离得到多糖7.34g,多糖得率为6.85g/L,多糖纯度为98.7%。
实施例3
本实施例3所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,由以下步骤组成:
(1)将红曲霉发酵液抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液减压旋蒸浓缩为原体积的30%,加入等体积的乙酸乙酯萃取,然后除去乙酸乙酯层;
(2)向得到的水层中加入粉末状活性炭,室温下磁力搅拌,然后抽滤除去活性炭粉末;
(3)将滤液经减压浓缩至原体积的5%,然后将其透析,将透析完的保留液减压浓缩至原体积的5%,重复透析3次;
(4)将浓缩液倒入乙醇溶液中,边倾倒边搅拌使其混合均匀,于1℃环境下放置22h,使其沉淀;
(5)离心得沉淀部分,采用无水乙醇和丙酮分别洗涤沉淀3次,将最终获得的沉淀烘干,得多糖粗品;
(6)将多糖粗品配制成浓度为5.5%的溶液,加入Sevag溶液,漩涡震荡,然后离心,吸取上层多糖溶液重复操作至界面无白色胨状物出现为止;
(7)将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩后冷冻干燥,即得到粗多糖。
其中:
步骤(1)中所述的红曲霉发酵液的发酵条件为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,配方组成为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克以及蒸馏水1000毫升;28℃摇床培养15天。
红曲霉采用中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 3.15547的菌种。
其中,编号为CGMCC 3.15547的菌种,其在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编:100101,菌种的拉丁文名称是:Monascus purpureus。
步骤(1)中所述的采用3层滤纸抽滤除去菌丝体和不溶物。
步骤(1)中所述加入等体积的乙酸乙酯萃取1.0h,除去乙酸乙酯层,重复操作4次。
步骤(2)中所述的粉末状活性炭的加入量为体积分数1.0%,磁力搅拌25h,然后采用3层滤纸抽滤以除去活性炭粉末。
步骤(3)中所述的于MwCO3500的透析袋中透析18h。
步骤(4)中所述的乙醇的浓度为95%,乙醇的体积是倒入的浓缩液体积的11倍。
步骤(5)中所述的洗涤沉淀3次用于脱水和除去部分脂溶性物质,并于55℃烘干15h。
步骤(5)中所述的离心转速为4000r/min,离心时间10min。
步骤(6)中所述的Sevag溶液为氯仿:正丁醇=4:1的体积比混合液,Sevag溶液加入的体积为多糖溶液体积的15%。
步骤(6)中所述的漩涡震荡12min,然后于7500r/min转速下离心10min。
步骤(7)中所述的离心转速为4000r/min,离心时间10min,冷冻干燥温度为-20℃,干燥室真空度为0.09MPa,干燥时间24h。
实施例3从1.13L红曲发酵液中分离得到多糖8.14g,多糖得率为7.20g/L,多糖纯度为96.9%。
Claims (10)
1.一种从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:由以下步骤组成:
(1)将红曲霉发酵液抽滤除去菌丝体和不溶物,得到的滤液减压浓缩为原体积的20%-30%,加入等体积的乙酸乙酯萃取,然后除去乙酸乙酯层;
(2)向得到的水层中加入粉末状活性炭,室温下磁力搅拌,然后抽滤除去活性炭粉末;
(3)滤液经减压浓缩至原体积的5%-10%,然后将其透析,将透析完的保留液减压浓缩至原体积的5%-10%,重复透析2-3次;
(4)将浓缩液倒入乙醇溶液中,边倾倒边搅拌使其混合均匀,于1-5℃环境下放置20-24h,使其充分沉淀;
(5)离心得沉淀部分,采用无水乙醇和丙酮分别洗涤沉淀2-3次,将最终获得的沉淀烘干,得多糖粗品;
(6)将多糖粗品配制成浓度为5-6%的溶液,加入Sevag溶液,漩涡震荡,然后离心,吸取上层多糖溶液重复操作至界面无白色胨状物出现为止;
(7)将上层多糖溶液离心除去不溶物,减压浓缩后冷冻干燥,即得到粗多糖。
2.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的红曲霉发酵液的发酵条件为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,配方组成为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克以及蒸馏水1000毫升;28℃摇床培养15天。
3.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的采用2-3层滤纸抽滤除去菌丝体和不溶物;所述加入等体积的乙酸乙酯萃取1.0-2h,除去乙酸乙酯层,重复操作3-5次。
4.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(2)中所述的粉末状活性炭的加入量为体积分数1.0%-1.5%,磁力搅拌24-26h,然后采用2-3层滤纸抽滤以除去活性炭粉末。
5.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的于MwCO3500的透析袋中透析12-18h。
6.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(4)中所述的乙醇的浓度为95%,乙醇的体积是倒入的浓缩液体积的10-12倍。
7.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(5)中所述的离心转速为3000-4000r/min,离心时间10-15min;所述的洗涤沉淀2-3次,并于50-55℃烘干12-24h。
8.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(6)中所述的Sevag溶液为氯仿:正丁醇=4:1的体积比混合液,Sevag溶液加入的体积为多糖溶液体积的15%-25%。
9.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(6)中所述的漩涡震荡10-15min,然后于7000-8000r/min转速下离心8-12min。
10.根据权利要求1所述的从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法,其特征在于:步骤(7)中所述的离心转速为3000-4000r/min,离心时间10-15min,冷冻干燥温度为-10℃至-50℃,干燥室真空度<0.11MPa,干燥时间24-28h。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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