CN105685766B - 微藻发酵液胞外多糖、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微藻发酵液胞外多糖、其制备方法及用途。具体而言，本发明提供一种胞外多糖组合物，以该胞外多糖的摩尔百分比计，该胞外多糖含有半乳糖73.00‑85.00％，葡萄糖5.50‑8.50％，甘露糖2.50‑8.00％，鼠李糖2.00‑6.00％，岩藻糖1.50‑3.80％和木糖1.20‑2.50％。本发明还涉及该组合物的制备方法，以及采用该方法制得的组合物。本发明的组合物具有显著的抗氧化活性，可以应用于食品抗氧化以及果蔬保鲜。因此，本发明还涉及含有所述组合物的抗氧化剂和保鲜剂，以及所述组合物在抗氧化和果蔬保鲜中的应用。

Description

微藻发酵液胞外多糖、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及提取自微藻发酵液的胞外多糖、其制备方法及用途。

背景技术

裂殖壶藻(Schizochytrium limacinum)是一类海洋真菌，属于真菌门网黏菌纲破囊壶菌科，是一种单细胞球形真菌。破囊壶菌属于嗜腐败微生物，广泛存在于有机物丰富和盐度高的环境中，这类真菌繁殖速度快，抗逆性强，易于大规模培养，由于该类细胞中所含DHA的比例可以达到细胞干重的20％左右，因此是目前进行工业化培养作为DHA来源的理想物种。这类微藻在发酵产生DHA的同时，会分泌出大量的多糖类物质，这类多糖或多糖复合物存在于细胞壁外，易与菌体分离，被称为胞外多糖(EPS)。这些胞外多糖可以使发酵液的粘度增大、最大溶氧量急剧下降，从而对发酵的进程造成一定的影响，因此，这类胞外多糖常常被作为副产物而舍弃。根据目前的研究水平，多糖类物质具有多样性、复杂性的特点，并且由于其独特的理化性质和显著的生理活性越来越受到人们的关注，因此，如果能够对这部分多糖类物质加以研究开发，则能够充分挖掘和利用这些副产物的附加值，从而创造一定的经济效益。

裂殖壶藻作为破囊壶菌科中的一种，其安全性已经得到了FDA的认可，关于对裂殖壶藻的研究，目前基本都集中在脂类方面的研究(如发酵时所产生的DHA的研究)等，而对于发酵过程中所产生的细胞外多糖和其他物质则研究甚少。汪少芸曾研究了裂殖壶藻sp.TIO1101的发酵液中胞外多糖的抗氧化和抑菌活性(福州大学学报2011,39(5)：786-791)。曹欢研究了裂殖壶藻细胞内多糖的提取分离和结构特征(中国海洋药物杂志2011,30(6)：1-5)。CN103204951A公开了一种裂殖壶藻胞外多糖的分离纯化方法。而国外对于裂殖壶藻发酵过程中所产生的胞外多糖也研究甚少，仅见US8232090B2中报道了一种裂殖壶藻突变菌株MTCC 5249及其所产生的DHA脂质和胞外多糖。因此，就目前的文献报道看，对于裂殖壶藻S-31在发酵过程中产生的细胞外多糖的研究还是空白。

发明内容

本发明首次公开了一种胞外多糖及其制备方法，并公开了该多糖的结构特征，及其生物学活性，该多糖具有显著的抗氧化活性，可以应用于食品抗氧化以及果蔬保鲜。本发明的方法制备过程操作简便。本发明的胞外多糖在发酵菌株、发酵培养条件、多糖结构特征方面，与上述文献所报道的裂殖壶藻胞外多糖均有显著的不同。

因此，本发明提供一种胞外多糖组合物，其中，以该胞外多糖的摩尔百分比计，该胞外多糖含有半乳糖73.00-85.00％，葡萄糖5.50-8.50％，甘露糖2.50-8.00％，鼠李糖2.00-6.00％，岩藻糖1.50-3.80％和木糖1.20-2.50％。

在一个具体实施例中，该胞外多糖的平均分子量为4-23kD。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有半乳糖75.00-82.00％。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有葡萄糖5.70-8.20％。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有甘露糖3.00-8.00％。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有鼠李糖2.50-5.80％。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有岩藻糖1.80-3.50％。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有木糖1.40-2.20％。

在一个具体实施例中，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有半乳糖75.00-82.00％，葡萄糖5.70-8.20％，甘露糖3.00-8.00％，鼠李糖2.50-5.80％，岩藻糖1.80-3.50％，和木糖1.40-2.20％。

在一个具体实施例中，所述胞外多糖中各单糖组成摩尔百分比为：半乳糖75.59％，葡萄糖7.20％，甘露糖7.98％，鼠李糖4.92％，岩藻糖2.75％，和木糖1.57％。

在一个具体实施例中，所述胞外多糖中各单糖组成摩尔百分比为：半乳糖73.60％，葡萄糖8.16％，甘露糖7.53％，鼠李糖5.76％，岩藻糖3.49％，和木糖1.45％。

在一个具体实施例中，所述胞外多糖中各单糖组成摩尔百分比为：半乳糖84.23％，葡萄糖5.72％，甘露糖2.97％，鼠李糖3.00％，岩藻糖1.89％，和木糖2.19％。

在一个具体实施例中，以组合物的总重计，所述组合物含有75.0－90.0％的所述胞外多糖。

在一个具体实施例中，所述组合物还含有糖醛酸和蛋白质。

在一个具体实施例中，所述糖醛酸和蛋白质均来自裂殖壶藻。

在一个具体实施例中，以组合物的总重计，所述组合物含有2.0－10.0％的糖醛酸。

在一个具体实施例中，以组合物的总重计，所述组合物含有8.0－15.0％的蛋白质。

在一个具体实施例中，以组合物的总重计，所述组合物含有：

(1)75.0－90.0％的所述胞外多糖；

(2)2.0－10.0％的糖醛酸；和

(3)8.0－15.0％的蛋白质。

在一个具体实施例中，以组合物的总重计，所述组合物含有：

(1)77.0－88.0％的所述胞外多糖；

(2)3.0－8.0％的糖醛酸；和

(3)9.0－14.0％的蛋白质。

在一个具体实施例中，所述胞外多糖来自裂殖壶藻sp.S-31菌株。

在一个具体实施例中，所述裂殖壶藻sp.S-31菌株在以下条件下发酵：

(a)挑选活化后的单菌落，接种到种子液培养基中，在28℃、200rpm转速下摇床培养48小时，至种子液浓度约干重15-20g/L；

(b)按10％的接种量，种子液接到7.5L的种子罐培养基中，在28℃，600rpm转速下通气培养36小时，发酵液中细胞干重达24g/L；

(c)按10％的接种量，种子液接种到50L的发酵罐培养基中，装液量18L，在28℃，300rpm-600rpm转速下，通气培养120小时，发酵过程中向发酵罐流加碳源溶液和氮源溶液。

在一个具体实施例中，所述胞外多糖组合物采用以下步骤制备得到：

(1)醇提取：将裂殖壶藻发酵液加到醇的水溶液中进行提取，离心获得上清液，减压浓缩得到浓缩液；

(2)萃取：采用有机溶剂萃取步骤(1)所得浓缩液，收集水相部分；

(3)除蛋白：将步骤(2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水层部分；

(4)透析：将步骤(3)所得的水层部分进行透析，透析后浓缩；

(5)沉淀多糖：将醇的水溶液加到步骤(4)所得的浓缩样品中，进行多糖沉淀；和

(6)洗涤、干燥：将步骤(5)中析出的多糖沉淀进行过滤、洗涤、干燥；

从而获得所述胞外多糖组合物。

在一个具体实施例中，上述制备胞外多糖的步骤还包括：

(7)纯化步骤(6)所获得的胞外多糖组合物。

在一个具体实施例中，所述纯化步骤(7)包括：

(7－1)将步骤(6)所得的含胞外多糖的组合物溶解后进行离子交换色谱(例如通过DEAE-52纤维素柱)纯化，以水洗脱，收集含有多糖的水洗脱液，获得洗脱液I；

(7－2)用0.1M-0.3M的选自氯化钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和磷酸盐缓冲液的洗脱剂洗脱步骤(7)的柱，获得洗脱液II；

(7－3)用0.5M-0.8M的选自氯化钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和磷酸盐缓冲液的洗脱剂洗脱步骤(8)的柱，获得洗脱液III；

(8)分别透析洗脱液I、洗脱液II以及洗脱液III；和

(9)对步骤(8)所获得的各透析部分进行分子排阻色谱(例如上样到Sephadex G-100凝胶柱)纯化，用去离子水洗脱，分别收集含有多糖的部分。

在一个具体实施例中，所述洗脱剂为氯化钠溶液。

在一个具体实施例中，步骤(7－2)和(7－3)使用相同或不同的洗脱剂。

在一个具体实施例中，步骤(7－2)使用0.2M的洗脱剂。

在一个具体实施例中，步骤(7－3)使用0.5M的洗脱剂。

在一具体实施例中，所述含胞外多糖的组合物采用以下步骤制备得到：

(1)取裂殖壶藻S-31的发酵液，加入3-5倍量体积的乙醇水溶液进行提取，乙醇浓度为5-60％(v/v)，提取温度为室温至80℃，搅拌提取1-3次，离心后合并上清液，减压浓缩至无乙醇残留，得提取浓缩液；

(2)将步骤(1)中所得的提取浓缩液采用有机溶剂进行萃取，有机溶剂的极性不大于乙酸乙酯，如石油醚、正己烷、氯仿等，优选进行重复萃取，优选萃取1-3次，收集水相部分，浓缩，优选减压浓缩，除去残留的有机溶剂；

(3)将步骤(2)中的水相部分进行除蛋白处理，优选以氯仿:正丁醇5:1-4:1为溶剂进行蛋白沉淀，优选反复多次至蛋白基本除完，收集水层部分，浓缩，优选减压浓缩，除去残留的有机溶剂；

(4)将步骤(3)中除蛋白后的部分进行透析，除去无机盐等小分子物质；

(5)将步骤(4)中透析完成的样品液减压浓缩，加入乙醇，使溶液中乙醇浓度达到80％以上，置于10℃以下环境中进行多糖沉淀；

(6)将步骤(5)中析出的多糖沉淀进行过滤，所得沉淀用乙醇洗涤2-5次，沉淀干燥后即得含有胞外多糖的产品。

在一具体实施例中，上述方法还包括下列步骤的纯化：

(7)取步骤(6)中得到的胞外多糖产品，加水溶解后过预先处理好的DEAE-52纤维素柱，用水洗脱，待无多糖洗下后，收集含有多糖的水洗脱液I；此时纤维素柱换用洗脱剂I洗脱，收集含有多糖的洗脱液II；纤维素柱再以洗脱剂II洗脱，收集含有多糖的洗脱液III；

(8)将步骤(7)中所得到的洗脱液I、II和III分别进行浓缩，浓缩后进行透析；

(9)将步骤(8)中透析完成后的部分分别进行Sephadex G-100凝胶柱纯化，用去离子水洗脱，分别收集含有多糖的部分，从而获得相应的胞外多糖组合物。

本发明还包括一种制备含胞外多糖的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)醇提取：将保藏编号ATCC20888的裂殖壶藻菌株的发酵液加到醇的水溶液中进行提取，离心获得上清液，减压浓缩得到浓缩液；

(2)萃取：采用有机溶剂萃取步骤(1)所得浓缩液，收集水相部分；

(3)除蛋白：将步骤(2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水层部分；

(4)透析：将步骤(3)所得的水层部分进行透析，透析后浓缩；

(5)沉淀多糖：将醇的水溶液加到步骤(4)所得的浓缩样品中，进行多糖沉淀；和

(6)洗涤、干燥：将步骤(5)中析出的多糖沉淀进行过滤、洗涤、干燥；

从而获得所述胞外多糖。

在一个具体实施例中，所述方法还包括：

(7)纯化步骤(6)所获得的含胞外多糖的组合物的步骤。

在一个具体实施例中，所述纯化步骤(7)包括：

(7－1)将步骤(6)所得的含胞外多糖的组合物溶解后进行离子交换色谱(例如通过DEAE-52纤维素柱)纯化，以水洗脱，收集含有多糖的水洗脱液，获得洗脱液I；

(7－2)用0.1M-0.3M的选自氯化钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和磷酸盐缓冲液的洗脱剂洗脱步骤(7)的柱，获得洗脱液II；

(7－3)用0.5M-0.8M的选自氯化钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和磷酸盐缓冲液的洗脱剂洗脱步骤(8)的柱，获得洗脱液III；

(8)分别透析洗脱液I、洗脱液II以及洗脱液III；和

(9)对步骤(8)所获得的各透析部分进行分子排阻色谱(例如上样到Sephadex G-100凝胶柱)纯化，用去离子水洗脱，分别收集含有多糖的部分。

在一个具体实施例中，所述裂殖壶藻菌株在以下条件下发酵：在28-30℃(例如28℃)，300rpm-600rpm转速下，通气培养80-150小时(例如120小时)。

在一个具体实施例中，发酵过程中向发酵罐流加碳源和氮源。

在一个具体实施例中，所述裂殖壶藻菌株在以下条件下发酵：

(a)挑选活化后的单菌落，接种到种子液培养基中，在28-30℃(例如28℃)、200-300rpm(例如200rpm)转速下摇床培养40-60小时(例如48小时)，至种子液浓度约干重15-20g/L；

(b)按5-15％(优选10％)的接种量，种子液接到种子罐培养基(例如7.5L的种子罐培养基)中，在28-30℃(例如28℃)，500-700rpm(例如600rpm)转速下通气培养30-50小时(例如36小时)，发酵液中细胞干重达20-30g/L(例如24g/L)；和

(c)按5-15％(优选10％)的接种量，种子液接种到例如50L的发酵罐培养基中，装液量达例如15-25L(例如18L)，在28-30℃(例如28℃)，300rpm-600rpm转速下，通气培养80-150小时(例如120小时)，发酵过程中向发酵罐流加碳源溶液和氮源溶液。

在一个具体实施例中，所述醇提取步骤包括：

取裂殖壶藻的发酵液，加入3-5倍量体积的乙醇水溶液进行提取，乙醇浓度为5-60％(v/v)，提取温度为室温至80℃，搅拌提取1-3次，离心后合并上清液，减压浓缩至无乙醇残留，得提取浓缩液。

在一个具体实施例中，所述萃取步骤包括：将所得的提取浓缩液采用有机溶剂进行萃取，有机溶剂的极性不大于乙酸乙酯，如石油醚、正己烷、氯仿等，重复萃取1-3次，收集水相部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。

在一个具体实施例中，所述除蛋白步骤包括：将用蛋白沉淀剂(例如氯仿:正丁醇，通常为5:1-4:1)处理萃取步骤获得的水相部分，收集水层部分。可使用蛋白沉淀剂反复多次处理，直至蛋白基本除完。还可减压浓缩除去残留的有机溶剂。

在一个具体实施例中，所述透析步骤包括将除蛋白后的水层部分进行透析。透析膜截留分子量不大于5000，透析时间不少于24小时，通常每12小时换水1次。优选地，透析过程中不时搅拌。

在一个具体实施例中，所述沉淀多糖步骤包括用醇处理经浓缩的透析获得的样品液。可使用乙醇。通常，可使溶液中醇的浓度达到80％以上，然后置于10℃以下环境中进行多糖沉淀。

在一个具体实施例中，所述洗涤、干燥步骤包括滤出沉淀多糖步骤中析出的多糖沉淀，然后用醇(优选乙醇)洗涤2-5次，沉淀干燥后即得含有胞外多糖的产品。

在一具体实施例中，上述方法还包括下列步骤的纯化：

(7)取步骤(6)中得到的胞外多糖产品，加水溶解后过预先处理好的DEAE-52纤维素柱，用水洗脱，待无多糖洗下后，收集含有多糖的水洗脱液I；此时纤维素柱换用洗脱剂I洗脱，收集含有多糖的洗脱液II；纤维素柱再以洗脱剂II洗脱，收集含有多糖的洗脱液III；

(8)将步骤(7)中所得到的洗脱液I、II和III分别进行浓缩，浓缩后进行透析；

(9)将步骤(8)中透析完成后的部分分别进行Sephadex G-100凝胶柱纯化，用去离子水洗脱，分别收集含有多糖的部分，从而获得相应的胞外多糖组合物。

本发明还包括采用上述方法制备得到的来自保藏编号为ATCC20888的裂殖壶藻菌株的含胞外多糖的组合物。

本发明还包括本发明的来自保藏编号为ATCC20888的裂殖壶藻菌株的含胞外多糖的组合物的应用，包括用于食品的抗氧化和果蔬保鲜。

因此，本发明还提供一种抗氧化剂，所述抗氧化剂含有本发明所述的胞外多糖的组合物。

本发明的抗氧化剂还可含有溶解所述组合物的溶剂，例如水。

本发明还提供一种保鲜剂，所述保鲜剂含有本发明所述的胞外多糖的组合物。

在一个具体实施例中，所述保鲜剂可以是干燥形式，在使用时用溶剂例如水加以溶解配制。

在一个具体实施例中，所述保鲜剂为溶液形式，含有所述组合物和溶剂(例如水)。

在一个具体实施例中，溶液形式的所述保鲜剂中，以保鲜剂总重计，所述组合物的含量通常为0.01－50％，当然也可以更高，但通常为0.01－2.00％即可实现保鲜目的，更优选为0.05－2.00％。

本发明还包括一种使果蔬保鲜的方法，该方法包括将本发明的溶液形式的保鲜剂喷洒在果蔬上。

适用于本发明的保鲜方法保鲜的果蔬包括但不限于人们日常使用的各种新鲜水果和蔬菜，例如苹果、梨、枣、黄瓜、青菜、白菜等等。

在本发明的一个具体实施方案中，胞外多糖的组合物源于裂殖壶藻，优选为源于保藏编号为ATCC20888的裂殖壶藻菌株。

与现有的多糖研究相比，本发明的优势在于：

(1)本发明首次研究并公开了一种从裂殖壶藻S-31菌株发酵液中提取纯化得到的细胞外多糖及其制备方法，并公开了该多糖的结构特征，及其生物学活性。

(2)本发明中的胞外多糖来源于裂殖壶藻S-31发酵产生DHA时的副产物，为原先的废弃物提供了开发利用的研究基础，增加了产品的附加值。

(3)本发明中的胞外多糖具有显著的抗氧化活性，可以用于食品的抗氧化和果蔬保鲜领域。壳聚糖是一种具有抗氧化活性的多糖类物质，目前常用作果蔬保鲜剂，与之相比，本发明的胞外多糖在果蔬保鲜作用上与壳聚糖的效果基本相当。而在清除自由基、还原能力、抗氧化能力方面均显著优于壳聚糖。因此，本发明在提高裂殖壶藻S-31发酵过程中副产物利用的同时，也为食品抗氧化和保鲜领域提供了一种新的物质。

具体实施方式

本发明的裂殖壶藻S-31购自于美国典型菌种保藏中心(ATCC)，编号为ATCC20888。

本发明的组合物来自保藏编号为ATCC20888的裂殖壶藻。可采用包括以下步骤的方法获得所述组合物：醇提取、萃取、除蛋白、透析、沉淀、洗涤以及干燥。还可进一步纯化所获得的胞外多糖样品。

醇提取通常将保藏编号ATCC20888的裂殖壶藻菌株的发酵液加到醇的水溶液中进行提取。通常使用浓度为5－60％(v/v)的乙醇。提取温度通常为室温(25℃)-90℃，例如大约80℃。可根据具体情况提取1－3次，提取时搅拌。提取完成后离心，获得上清。可减压浓缩至无乙醇残留，获得提取浓缩液。

通常采用有机溶剂进行萃取。可用的有机溶剂的极性不大于乙酸乙酯，如石油醚、正己烷、氯仿等。萃取可重复1-3次，收集水相部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。

可用蛋白沉淀试剂除去萃取后获得的水相部分。可用的蛋白沉淀试剂包括但不限于4:1的氯仿:正丁醇。可进行萃取多次，直至蛋白基本除完，收集水层部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。

可对除蛋白后的部分进行透析，以除去无机盐等小分子物质。透析膜截留分子量不大于5000，透析时间不少于24小时，通常每12小时换水1次并不时搅拌。

可将步骤透析完成的样品液减压浓缩至一定体积后，加入醇，使多糖沉淀。通常使用乙醇，且通常使溶液中乙醇浓度达到80％以上，置于5-15℃以下(通常为10℃以下)环境中进行多糖沉淀。

然后，可用醇洗涤多糖沉淀物数次，例如2-5次。然后，可干燥沉淀物，由此即可获得本发明的含有胞外多糖的产品(组合物)。

当然，还可进一步纯化所述含有胞外多糖的产品。例如，可将含胞外多糖的组合物溶解后进行离子交换色谱纯化(例如通过DEAE-52纤维素柱)，以水洗脱，收集含有多糖的水洗脱液I；接着用洗脱剂I洗脱柱，获得洗脱液II；接着再用洗脱剂II洗脱柱，获得洗脱液III。

洗脱剂可选自氯化钠溶液、碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和磷酸盐缓冲液。通常选用氯化钠溶液。洗脱剂I的浓度通常为0.1M-0.3M，洗脱剂II的浓度通常为0.5M-0.8M。

在本发明的具体实施例中，使用0.2M的氯化钠溶液作为洗脱剂I，使用0.5M的氯化钠溶液作为洗脱剂II。当然，洗脱剂I和II可以相同或不同。

然后，可分别透析所获得的洗脱液I、II和III。透析膜截留分子量不大于5000，透析时间不少于24小时，通常每12小时换水1次并不时搅拌。

透析结束后，可对各透析部分进行分子排阻色谱(例如上样到SephadexG-100凝胶柱)纯化，用去离子水洗脱，分别收集含有多糖的部分，得到纯化的含有胞外多糖的产品。

可采用采用本领域周知的苯酚-硫酸法检测上述各步所获得的含胞外多糖的产品中多糖的含量(以半乳糖为对照品)，采用采用本领域周知的硫酸-咔唑法测定糖醛酸的含量(以半乳糖醛酸为对照品)，采用采用本领域周知的凯氏定氮法检测蛋白的含量。

可采用气相色谱法(GC)测定所述含胞外多糖的组合物中单糖的组成。方法如下：取多糖样品20mg，加入2M的三氟乙酸(TFA)溶液20毫升后充氮气封管，120℃下水解2-4小时，水解后的样品减压蒸馏除去三氟乙酸，再加入适量甲醇后再进行减压蒸馏，反复多次至三氟乙酸完全除尽。加入盐酸羟胺20mg，再加入吡啶1ml，90℃加热反应30min，再加入乙酸酐1ml，90℃加热反应30min，氮气吹干，加1ml氯仿萃取，萃取液过0.45um滤膜，然后进行气相色谱检测。

可采用本领域周知的分子排阻凝胶色谱法(GPC)测定多糖的平均分子量范围。

因此，本发明包括上述方法各步所获得的包含来自保藏编号ATCC20888的裂殖壶藻的胞外多糖的产品(组合物)，尤其是除蛋白步骤后各步所获得的产品(组合物)。该产品或组合物的组成如前文所述。

应理解的是，本发明含来自保藏编号ATCC20888的裂殖壶藻的胞外多糖的产品(组合物)以所述胞外多糖为主，可含有在制备过程中未完全分离的糖醛酸、蛋白质等物质。上述方法也可省去透析步骤。因此，本发明的组合物中也可能会含有无机盐等小分子物质。本领域技术人员不难测定含有上述物质的本发明组合物的抗氧化能力及保鲜效果。所有这些产品都在本发明的保护范围之内。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，本发明并不限于这些具体实施例，本发明的范围由权利要求书限定。实施例中所采用的方法、试剂，除非另有说明，否则按本领域周知的方法实施所述方法和使用所述试剂。

实施例1：

按以下方法发酵裂殖壶藻ATCC20888菌株：

(1)挑选活化后的单菌落，接种到种子液培养基中，在28℃、200rpm转速下摇床培养48小时，至种子液浓度约干重15-20g/L；

(2)按10％的接种量，种子液接到7.5L的种子罐培养基中，在28℃，600rpm转速下通气培养36小时，发酵液中细胞干重达24g/L；

(3)按10％的接种量，种子液接种到50L的发酵罐培养基中，装液量18L，在28℃，300rpm-600rpm转速下，通气培养120小时，发酵过程中向发酵罐流加碳源溶液和氮源溶液。

取裂殖壶藻S-31发酵液5升，加入20升60％乙醇溶液(v/v)，60℃下搅拌提取2小时，离心后取上清液，剩余沉淀按照上述方法再提取1次，合并两次提取后的上清液，减压浓缩至5升。在提取浓缩液中加入1升石油醚进行萃取，连续萃取3次，收集水层部分。萃取完后的提取液加入1升氯仿:正丁醇4:1(v/v)混合液进行除蛋白，连续5次，直至加入混合液后不再产生明显的蛋白沉淀为止，收集水层部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。将除蛋白后的提取液装入透析袋中进行透析，透析膜截留分子量为5000D，透析时间72小时，每12小时换水1次并不时搅拌。透析完成后的提取液从透析袋中倒出，减压浓缩，加入无水乙醇至溶液中的乙醇浓度为80％，置于4℃环境下24小时，析出白色沉淀。将析出的沉淀进行过滤，以无水乙醇清洗沉淀3次，沉淀洗涤后冷冻干燥，得胞外多糖(EPS)共16克。

实施例2：

按实施例1所述的方法发酵裂殖壶藻S-31。

取裂殖壶藻S-31发酵液1升，加入5升水，80℃下搅拌提取2小时，离心后取上清液，减压浓缩至1升。在提取浓缩液中加入300毫升氯仿进行萃取，连续萃取3次，收集水层部分。萃取完后的提取液加入300毫升氯仿:正丁醇4:1(v/v)混合液进行除蛋白，连续6次，直至加入混合液后不再产生明显的蛋白沉淀为止，收集水层部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。将除蛋白后的提取液装入透析袋中进行透析，透析膜截留分子量为5000D，透析时间30小时，每12小时换水1次并不时搅拌。透析完成后的提取液从透析袋中倒出，减压浓缩，加入无水乙醇至溶液中的乙醇浓度为85％，置于10℃环境下48小时，析出淡黄色沉淀。将析出的沉淀进行抽滤，以无水乙醇清洗沉淀5次，沉淀洗涤后在60℃下烘干，得胞外多糖(EPS)共3.5克。

实施例3：

按实施例1所述的方法发酵裂殖壶藻S-31。

取裂殖壶藻S-31发酵液2升，加入6升40％乙醇溶液(v/v)，室温下搅拌提取2小时，离心后取上清液，剩余沉淀按照上述方法再提取2次，合并三次提取后的上清液，减压浓缩至2升。在提取浓缩液中加入700毫升正己烷进行萃取，连续萃取3次，收集水层部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。萃取完后的提取液加入500毫升氯仿:正丁醇4:1(v/v)混合液进行除蛋白，连续5次，直至加入混合液后不再产生明显的蛋白沉淀为止，收集水层部分，减压浓缩除去残留的有机溶剂。将除蛋白后的提取液装入透析袋中进行透析，透析膜截留分子量为5000D，透析时间48小时，每12小时换水1次并不时搅拌。透析完成后的提取液从透析袋中倒出，减压浓缩，加入无水乙醇至溶液中的乙醇浓度为90％，置于4℃环境下24小时，析出白色沉淀。将析出的沉淀进行过滤，以无水乙醇清洗沉淀3次，沉淀洗涤后50℃下真空干燥，得胞外多糖(EPS)共6.3克。

实施例4：

采用苯酚-硫酸法对实施例1～3中得到的胞外多糖样品进行糖含量的测定。取胞外多糖样品(EPS)适量，加水溶解配制成约1mg/ml的溶液，精密移取2.0ml置于试管中，分别加入6％苯酚溶液1.0ml，混匀，然后沿试管壁缓慢加入浓硫酸5.0ml，混匀，然后沸水浴加热20min，冷却混匀，在490nm波长测定吸光度。以半乳糖为对照品，按照上述方法进行测定，以半乳糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，将样品测定所得吸光度值代入标准曲线，计算样品中的糖含量。经上述方法测定，实施例1～3中制得的胞外多糖样品中糖含量(重量百分比)分别为：88.0％，77.0％和81.4％。

实施例5：

采用硫酸-咔唑法对实施例1～3中得到的胞外多糖样品进行糖醛酸含量的测定。取胞外多糖样品(EPS)适量，加水溶解配制成约0.5mg/ml的溶液，精密移取配制好的多糖溶液1ml，加6ml浓硫酸，摇匀，沸水浴加热30min，取出冷却至室温，加入0.1％咔唑标准溶液0.2ml，摇匀，于沸水浴加热10min，冷却至室温后加浓硫酸至10ml，摇匀，同时做空白对照，于522nm测定吸光度。以半乳糖醛酸为对照品，按照上述方法进行测定，以半乳糖醛酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，将样品测定所得吸光度值代入标准曲线，计算样品中的糖醛酸含量。经上述方法测定，实施例1～3中制得的胞外多糖样品中糖醛酸的含量(重量百分比)分别为：3.0％，6.0％和4.2％。

实施例6：

采用凯氏定氮法对实施例1～3中得到的胞外多糖样品进行蛋白质含量测定，转换系数为6.25，经测定，实施例1-3中制得的胞外多糖样品中蛋白质的含量(重量百分比)分别为：9.0％，12.6％和13.7％。

实施例7：

为进一步测定胞外多糖的分子量范围，必须将胞外多糖样品进一步纯化，纯化采取以下步骤：

(1)取纤维素DEAE-52填料适量，加水浸泡24小时，再以5％盐酸和5％氢氧化钠交替冲洗，之后以水平衡。

(2)取实施例1中制备得到的胞外多糖样品(EPS)5克，加水溶解后通过预先处理好的纤维素DEAE-52色谱柱，以水洗脱，以苯酚-硫酸法对流出液进行检测，收集含有多糖的部分。

(3)水洗脱完毕后，换用0.2M氯化钠溶液洗脱，以苯酚-硫酸法对流出液进行检测，收集含有多糖的部分。

(4)待0.2M氯化钠溶液洗脱完毕后，换用0.5M氯化钠溶液洗脱，以苯酚-硫酸法对流出液进行检测，收集含有多糖的部分。

(5)分别将水、0.2M氯化钠和0.5M氯化钠溶液洗脱下的含有多糖的部分减压浓缩后，进行透析，透析膜截留分子量为5000D，透析时间72小时，每12小时换水一次，并时常搅拌。

(6)将透析后的样品分别过sephadex G-100凝胶柱，以水洗脱，以苯酚-硫酸法对流出液进行检测，分别收集含有多糖的部分，减压浓缩后冷冻干燥，得三个多糖组分，分别标记为EPS-1(水洗脱部分)、EPS-2(0.2M氯化钠洗脱部分)、EPS-3(0.5M氯化钠洗脱部分)。

实施例8：

为检测胞外多糖EPS的分子量范围，将纯化得到的3个多糖组分EPS-1、EPS-2和EPS-3分别采用分子排阻凝胶色谱法(GPC)测定多糖的平均分子量范围。采用Agilent1100高效液相色谱仪，示差检测器；色谱柱为TSK-3000凝胶色谱柱，进样量20μL，柱温40℃，流速0.5ml/min。各多糖样品以水溶解，配制成0.5-5％浓度的待测液，以不同分子量的聚乙二醇为对照品，根据洗脱体积与分子量的大小进行回归，得标准曲线。将各多糖组分上样洗脱后的洗脱液体积代入标准曲线，计算各多糖组分的平均分子量，其中EPS-1组分的平均分子量为22.3KD，EPS-2组分的平均分子量为11.4KD，EPS-3组分的平均分子量为4.93KD。综合以上检测结果，得胞外多糖EPS的平均分子量范围为4-23KD。

实施例9：

取实施例1中所制备得到的胞外多糖(EPS)20mg，加入20ml 2M三氟乙酸(TFA)溶液，充氮后密闭，120℃下水解2h，水解液减压浓缩至干，加入少量甲醇，再减压浓缩至干，反复多次以除尽TFA，备用。另分别取葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖的对照品各20mg，以及除尽TFA的多糖水解后样品，分别加入盐酸羟胺20mg，再加入吡啶1ml，90℃加热反应30min，再加入乙酸酐1ml，90℃加热反应30min，氮气吹干，加1ml氯仿萃取，萃取液过0.45um滤膜，然后进行GC检测。所用GC仪器为GC-2010PLUS(SHIMADZU)；FID检测器；色谱柱：Rtx-5，30m×0.25mm，0.25μm；检测器温度280℃，尾吹30ml/min，氢气40ml/min，空气400ml/min；进样1μl，进样口温度250℃，总流量39.1ml/min，柱流量1.17ml/min，线速度31.4cm/s，吹扫3.0ml/min，分流比60:1，升温程序如表1所示：

表1：GC检测升温程序

经检测，实施例1所得胞外多糖样品中各单糖组成摩尔百分比为：半乳糖75.59％，葡萄糖7.20％，甘露糖7.98％，鼠李糖4.92％，岩藻糖2.75％，木糖1.57％。

实施例10：

取实施例2中所制备得到的胞外多糖(EPS)20mg，按照实施例9的方法检测各单糖组成比例，结果显示，实施例2所得胞外多糖样品中各单糖组成摩尔百分比为：半乳糖73.60％，葡萄糖8.16％，甘露糖7.53％，鼠李糖5.76％，岩藻糖3.49％，木糖1.45％。

实施例11：

取实施例3中所制备得到的胞外多糖(EPS)20mg，按照实施例9的方法检测各单糖组成比例，结果显示，实施例3所得胞外多糖样品中各单糖组成摩尔百分比为：半乳糖84.23％，葡萄糖5.72％，甘露糖2.97％，鼠李糖3.00％，岩藻糖1.89％，木糖2.19％。

壳聚糖是一种常用的多糖类物质，具有抗氧化活性，广泛的应用于食品的抗氧化领域和果蔬保鲜领域。以下对比实施例分别从抗氧化和果蔬保鲜两个方面对本发明中的胞外多糖和壳聚糖进行了对比实验。

应用实施例1：

分别取实施例1中制得的胞外多糖EPS和实施例7中制得的胞外多糖组分EPS-1、EPS-2、EPS-3适量，加水溶解并分别配制成浓度为6mg/ml的溶液，进行ABTS自由基清除实验。另取壳聚糖样品适量，加水溶解并配制成浓度为6mg/ml的溶液，同时进行ABTS自由基清除实验。分别取上述配制的样品溶液20μL加至96孔板中，再加入预先配制的ABTS试液180μL，暗中放置30min，在734nm下测定吸光度。计算其清除率，同时以Trolox为对照，根据标准曲线换算其抗氧化当量值。结果显示，本发明中制得的胞外多糖在清除ABTS自由基方面的效果远好于壳聚糖，抗氧化当量值显著高于壳聚糖，表明其抗氧化活性优于壳聚糖。结果见表2所示：

表2.多糖样品ABTS抗氧化活性实验结果

应用实施例2：

分别取实施例1中制得的胞外多糖EPS和实施例7中制得的胞外多糖组分EPS-1、EPS-2、EPS-3适量，加水溶解并分别配制成浓度为12mg/ml的溶液，进行还原能力测定FRAP实验。另取壳聚糖样品适量，加水溶解并配制成浓度为12mg/ml的溶液，同时进行FRAP实验。分别取上述配制的样品溶液50μL加至96孔板中，再加入FRAP试液150μL，在37℃下反应10min，在593nm下测定吸光度。以FeSO₄为对照品，按照同样操作绘制标准曲线，求算各多糖还原能力相当于Fe²⁺的浓度。结果显示，本发明中制得的胞外多糖的还原能力显著高于壳聚糖，其中EPS-2的还原能力最强。结果见表3所示：

表3.多糖样品FRAP实验结果

样品名称	EPS	EPS-1	EPS-2	EPS-3	壳聚糖
						FRAP(μmol Fe<sup>2+</sup>/g)	3.72	1.71	9.39	3.86	0.25

应用实施例3：

分别取实施例1中制得的胞外多糖EPS和实施例7中制得的胞外多糖组分EPS-1、EPS-2、EPS-3适量，加水溶解并分别配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，进行ORAC抗氧化能力实验测定。另取壳聚糖样品适量，加水溶解并配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，同时进行ORAC实验。分别取上述配制的样品溶液和PBS缓冲液20μL加至96孔板中，由酶标仪自动加入38℃下预热的1μM的荧光素溶液200μL，再加入AAPH溶液20μL，于37.5℃下测定体系的荧光强度变化。其中激发光波长为485nm，发射光波长为520nm，进行60个循环测定，每个循环45秒。以Trolox为对照，计算样品、对照品及空白的曲线下面积AUC，并计算其ORAC值。结果显示，本发明中制得的胞外多糖的抗氧化能力显著高于壳聚糖，结果见表4所示：

表4.多糖样品ORAC实验结果

样品名称	EPS	EPS-1	EPS-2	EPS-3	壳聚糖
						ORAC(μmol TE/g)	39.92	22.97	93.51	61.78	0.004

应用实施例4：

对实施例1中制得的胞外多糖EPS进行果蔬保鲜作用实验。以青苹果和大枣为实验材料，以壳聚糖为阳性对照，取实施例1中的胞外多糖样品(EPS)适量，加水溶解后配制成0.5％、1.0％的溶液，阳性对照壳聚糖加水配制成1.0％的溶液，分别涂膜于青苹果和大枣表面，分别在第2、5、8天观察样品的失水率。结果显示：不同浓度的胞外多糖溶液对于青苹果和大枣都具有一定的保鲜作用，样品失水率均低于空白对照组，其中，1.0％的胞外多糖溶液对果蔬的保鲜作用与1.0％壳聚糖溶液相当，实验结果见下表5。

表5.样品失水率变化结果(％)

此实验表明本发明中制备的胞外多糖对于果蔬的保鲜具有积极的作用，可以用于果蔬的保鲜。

Claims (26)

1.一种胞外多糖组合物，其中，以该胞外多糖的摩尔百分比计，该胞外多糖含有半乳糖73.00-85.00％，葡萄糖5.50-8.50％，甘露糖2.50-8.00％，鼠李糖2.00-6.00％，岩藻糖1.50-3.80％和木糖1.20-2.50％；其中，所述胞外多糖组合物采用以下步骤制备得到：

(1)醇提取：将裂殖壶藻发酵液加到醇的水溶液中进行提取，固液分离，将获得的溶液浓缩，得到浓缩液；

(2)萃取：采用有机溶剂萃取步骤(1)所得浓缩液，收集水相部分；

(3)除蛋白：将步骤(2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水层部分；

(4)透析：将步骤(3)所得的水层部分进行透析，透析后浓缩；

(5)沉淀多糖：将醇的水溶液加到步骤(4)所得的浓缩样品中，进行多糖沉淀；

(6)洗涤、干燥：将步骤(5)中析出的多糖沉淀进行过滤、洗涤、干燥；

(7)将步骤(6)所得的含胞外多糖的组合物溶解后进行离子交换色谱纯化，以水洗脱；

(8)用0.1M-0.3M的氯化钠溶液洗脱步骤(7)经水洗脱的柱，获得洗脱液II；

(9)用0.5M-0.8M的氯化钠溶液洗脱步骤(8)的柱，获得洗脱液III；

(10)分别透析洗脱液II和洗脱液III；和

(11)对步骤(10)所获得的各透析部分进行分子排阻色谱纯化，用去离子水洗脱，分别收集得到含有多糖的部分，即为所述胞外多糖组合物。

2.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，该胞外多糖的平均分子量为4.93-11.4kD。

3.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，所述胞外多糖组合物来源于裂殖壶藻。

4.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，所述胞外多糖组合物来源于保藏编号为ATCC20888的裂殖壶藻。

5.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，所述胞外多糖含有半乳糖75.00-82.00％，葡萄糖5.70-8.20％，甘露糖3.00-8.00％，鼠李糖2.50-5.80％，岩藻糖1.80-3.50％和木糖1.40-2.20％。

6.如权利要求5所述的胞外多糖组合物，其特征在于，

所述胞外多糖中各单糖的摩尔百分比为：半乳糖84.23％，葡萄糖5.72％，甘露糖2.97％，鼠李糖3.00％，岩藻糖1.89％，和木糖2.19％。

7.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，以胞外多糖组合物的总重计，所述胞外多糖组合物含有75.0－90.0％的所述胞外多糖。

8.如权利要求1-7中任一项所述的胞外多糖组合物，其特征在于，所述胞外多糖组合物还含有糖醛酸和蛋白质。

9.如权利要求8所述的胞外多糖组合物，其特征在于，以胞外多糖组合物的总重计，所述胞外多糖组合物含有2.0－10.0％的糖醛酸。

10.如权利要求8所述的胞外多糖组合物，其特征在于，所述胞外多糖组合物含有8.0－15.0％的蛋白质。

11.如权利要求1-6中任一项所述的胞外多糖组合物，其特征在于，以胞外多糖组合物的总重计，所述胞外多糖组合物含有：

(i)75.0－90.0％的所述胞外多糖；

(ii)2.0－10.0％的糖醛酸；和

(iii)8.0－15.0％的蛋白质。

12.如权利要求11所述的胞外多糖组合物，其特征在于，以胞外多糖组合物的总重计，所述胞外多糖组合物含有：

(a)77.0－88.0％的所述胞外多糖；

(b)3.0－8.0％的糖醛酸；和

(c)9.0－14.0％的蛋白质。

13.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，所述胞外多糖的平均分子量为11.4kD或4.93kD。

14.如权利要求1所述的胞外多糖组合物，其特征在于，步骤(1)所述浓缩为减压浓缩。

15.一种制备权利要求1-13中任一项所述的胞外多糖组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)醇提取：将裂殖壶藻的发酵液加到醇的水溶液中进行提取，离心获得上清液，减压浓缩得到浓缩液；

(2)萃取：采用有机溶剂萃取步骤(1)所得浓缩液，收集水相部分；

(3)除蛋白：将步骤(2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水层部分；

(4)透析：将步骤(3)所得的水层部分进行透析，透析后浓缩；

(5)沉淀多糖：将醇的水溶液加到步骤(4)所得的浓缩样品中，进行多糖沉淀；和

(6)洗涤、干燥：将步骤(5)中析出的多糖沉淀进行过滤、洗涤、干燥；

(7)将步骤(6)所得的含胞外多糖的组合物溶解后进行离子交换色谱纯化，以水洗脱；

(8)用0.1M-0.3M的氯化钠溶液洗脱步骤(7)经水洗脱的柱，获得洗脱液II；

(9)用0.5M-0.8M的氯化钠溶液洗脱步骤(8)的柱，获得洗脱液III；

(10)分别透析洗脱液II以及洗脱液III；和

(11)对步骤(10)所获得的各透析部分进行分子排阻色谱纯化，用去离子水洗脱，分别收集含有多糖的部分；从而获得所述胞外多糖组合物。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述裂殖壶藻为裂殖壶藻ATCC20888。

17.一种用于降低失水率的保鲜剂，其特征在于，所述保鲜剂含有权利要求1-13中任一项所述的胞外多糖组合物。

18.如权利要求17所述的保鲜剂，其特征在于，所述保鲜剂为干燥形式。

19.如权利要求17所述的保鲜剂，其特征在于，所述保鲜剂为溶液形式，以保鲜剂总重计，所述胞外多糖组合物的含量为0.01-50％。

20.如权利要求19所述的保鲜剂，其特征在于，以保鲜剂总重计，所述胞外多糖组合物的含量为0.01-2.00％。

21.如权利要求20所述的保鲜剂，其特征在于，以保鲜剂总重计，所述胞外多糖组合物的含量为0.05-2.00％。

22.权利要求1-13中任一项所述的胞外多糖组合物在降低失水率以使果蔬保鲜中的应用，或在制备用于降低失水率的保鲜剂中的应用。

23.权利要求1-13中任一项所述的胞外多糖组合物在抗氧化中的应用，或在制备抗氧化剂中的应用。

24.一种使果蔬保鲜以降低失水率的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求17-21中任一项所述的保鲜剂以溶液形式喷洒在果蔬上。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述果蔬选自苹果、梨、枣、黄瓜、青菜和白菜。

26.一种抗氧化剂，其特征在于，所述抗氧化剂含有权利要求1-13中任一项所述的胞外多糖组合物。