CN1771984B - 嗜盐隐杆藻胞外多糖在制药中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了嗜盐隐杆藻胞外多糖的新用途。本发明发明人的研究表明，嗜盐隐杆藻胞外多糖具有调节机体免疫力的作用，可以制备为免疫调节药物。同时，本发明发明人通过动物实验结果表明，嗜盐隐杆藻胞外多糖也能够制备为抗肿瘤药物，以及制备预防和/或治疗肺炎药物。有效剂量为6-8mg/公斤体重·天，3个月为一个疗程。本发明药物原料来源广泛，可通过收集嗜盐隐杆藻胞外产物得到，制备方法简单，成本低廉，具有广泛的临床实用价值和经济价值。

Description

嗜盐隐杆藻胞外多糖在制药中的用途

技术领域

本发明涉及嗜盐隐杆藻胞外多糖的新用途，特别是涉及嗜盐隐杆藻胞外多糖的医药用途。

背景技术

嗜盐隐杆藻(Aphanothece halophytica Fremy)为一种生长在高盐环境中的原核藻类-蓝藻，系统分类上属于色球藻科色球藻属。该藻在细胞生长的同时向生长基质中分泌大量的单种胞外多糖。研究表明，该种多糖由阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸组成。其中阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖的摩尔比为1∶2.08：1.57∶2.87，而葡萄糖醛酸占整个多糖分子的15.78％(Drews G，Weckesser J Function，structure and composition of cell walls and external layers.In Carr NG，Whitton BA(eds)，The Biology of Cyanobacteria.Blackwell，Oxford，1982：333-57)。阿拉伯糖的连接方式为1，3糖苷键，岩藻糖的连接方式为1，4或1，3糖苷键，甘露糖连接方式为1，2，4糖苷键，葡萄糖连接方式为1，3糖苷键，葡萄糖醛酸的连接方式为1，3糖苷键。盐生隐杆藻的胞外多糖还是一种高度硫酸化的多糖硫酸酯，其中硫酸根的含量占整个分子的34.46％。同时，嗜盐隐杆藻胞外多糖还结合了Ca、Na、Mg和K离子。

发明内容

本发明的目的是提供嗜盐隐杆藻胞外多糖的新用途。

本发明发明人的研究表明，嗜盐隐杆藻胞外多糖具有调节机体免疫力的作用，可以制备为免疫调节药物。

同时，本发明发明人通过动物实验结果表明，嗜盐隐杆藻胞外多糖也能够制备为抗肿瘤药物，以及制备预防和/或治疗肺炎药物。

在应用时，上述药物需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。常用剂型有片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、注射液、冻干粉针、口服液、分散片等，均可以按照药学领域的常规方法制备。使用剂量为6-8mg/公斤体重·天，3个月为一个疗程。

本发明通过实验证实，嗜盐隐杆藻胞外多糖能有效调节机体免疫力，且没有毒副作用；该药物的动物实验和临床实验证实该药物对免疫低下导致的病毒性疾病如肺炎和肿瘤有显著的疗效。本发明药物原料来源广泛，可通过收集嗜盐隐杆藻胞外产物得到，制备方法简单，成本低廉，具有广泛的临床实用价值和经济价值。

具体实施方式

实施例1、本发明药物的制备

1、培养基配制

按下述配方配制嗜盐隐杆藻的培养液：NaCl 29.25g，KCl 2.0g，MgCl₂·6H₂O 10.5g，MgSO₄·7H₂O 10.0g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1.0g，NaNO₃ 0.5g，KH₂PO₄ 0.05g，FeCl₃·6H₂O 0.003g，Na₂EDTA·2H₂O 0.0023g，蒸馏水998ml，土壤浸出液2ml。

用1N NaOH将培养液pH调至8。

2、嗜盐隐杆藻的发酵培养

将嗜盐隐杆藻(Aphanothece halophytica Fremy)接种于培养基中，接种量为2.6×10⁴个藻细胞，在光照4000Lux，温度26～32℃，每天光周期为光/暗(10h/14h)条件下通气培养，通气量为0.5m³/min·L。通气培养至藻细胞生长的对数期时，按20ml蒸馏水/L培养基的量向培养体系中加入蒸馏水以刺激该藻胞外多糖的分泌。

3、药物制备

将对数后期的嗜盐隐杆藻培养物静置24h，使藻体缓慢沉淀，上清液虹吸于大型蒸发皿中让水分室温蒸发或置阳光下浓缩培养液。然后，将浓缩的培养液置透析袋在流动的自来水(100ml/h)中透析24h。透析袋内容物重新置蒸发皿中浓缩，加2倍体积的乙醇溶液沉淀多糖，冷冻干燥得白色粉末，即为嗜盐隐杆藻胞外多糖，产率为2.9g/L培养液。经用PMP柱前衍生和HPLC方法检测，得到的嗜盐隐杆藻胞外多糖的组成与现有报道中的相同。将嗜盐隐杆藻胞外多糖按常规方法制成片剂，每片20mg。

实施例2、本发明药物对小鼠迟发性超敏反应(DTH)的调节作用

取6-8周龄健康KM小鼠130只(20±2g，

/♀兼用)，随机分为13组，自由取食、饮水。其中6组腹腔注射环磷酰胺(CP)80mg·kg^-1，3天后以50％二硝基氯苯(DNCB)致敏，形成免疫增强模型。另外6组50％DNCB致敏后立即腹腔注射CP 250mg·kg^-1，形成免疫低下模型。另设1组空白对照组，仅以50％DNCB致敏。本发明药物按表1所示的剂量对免疫增强组和免疫低下组中的5个组连续灌胃12天，对照组灌胃等体积的生理氯化钠溶液。第13天，以2.5％的DNCB涂抹实验小鼠右耳，2小时后，称重，脱颈椎处伤，以直径8mm打孔器取左右耳片，取脾脏、胸腺于分析天平称重，计算左右耳片差值，并计算脾脏系数和胸腺系数，结果如表1所示。

结果表明，免疫增强模型小鼠和免疫低下模型小鼠的DTH反应与正常小鼠相比均有显著差异(P＜0.05)。免疫增强组中，本发明药物在40-100mg·kg^-1·d^-1范围内能下调小鼠左右耳片差值、脾脏指数及胸腺指数，其中左右耳差值的下调作用在40～80mg·kg^-1·d^-1剂量范围内呈明显的量效关系，其中剂量为80mg·kg^-1·d^-1时下调作用最为显著。免疫低下组中，本发明药物在20～100mg·kg^-1·d^-1的剂量都能显著地上调小鼠左右耳片差值及胸腺指数，其上调作用在20～80mg·kg^-1·d^-1内呈剂量依赖性的量效关系。脾脏指数随剂量增加而呈上升的趋势。由此可见，本发明药物可以下调免疫增强小鼠的DTH，亦可上调免疫下降小鼠的DTH，具有免疫调节功能。

表1.本发明药物对KM小鼠的DTH反应的调节作用(n＝10，

)

注：与空白对照组相比：^aP＜0.01；^bP＜0.01。与CP80mg/kg相比：^*P＜0.05；^**P＜0.01；与CP250mg/kg相比：^☆P＜0.05；^☆☆P＜0.01。

实施例3、对小鼠腹腔巨噬细胞生成IL-1的影响

取小鼠6只(20±2g，♀各半)于实验的前3天腹腔注射0.6％巯基乙醇酸钠2ml/只。实验时脱颈椎处伤，腹腔注射8ml Hank’s液，按文献(郑维发等.芫花根总黄酮对小鼠细胞免疫功能的调节作用.解放军药学学报2004，20(4)：241-245)在24孔板中无菌制备和培养单层巨噬细胞。本发明药物以无血清的RPMI-1640液配制成32、63、125、250和500μg/ml，分别加入单层巨噬细胞1ml/孔。阳性对照为2.0μg/ml脂多糖(LPS)的无血清RPMI-1640液，空白对照为无血清RPMI-1640液。按文献(Zheng Wei-fa et al.Effects on cell immunity in mice by water extract of Dunaliella sallina.中成药2004，26(12)：1000-1005)制备巨噬细胞培养上清液，储存于-20℃备用。

另取小鼠6只(20±2g，♀/

各半)，脱颈椎处伤后，无菌制备小鼠胸腺细胞并加入96孔板中，0.1ml/孔，每孔含胸腺细胞1×10⁶个。将所得培养上清液(含IL-1)用RPMI-1640培养液按1∶40、1∶60和1∶80稀释，分别加入上述培养孔中，每孔50μl，然后每孔加入刀豆蛋白(Con A)，使其终浓度为1μg/ml，另设Con A对照孔。按文献(郑维发，石枫，王莉等.金铁锁总甙对小鼠细胞免疫功能的影响[J].武警医学2003，14(10)：598)所述的方法测定每孔的放射量，IL-1的活性以摄入淋巴细胞³HTdR的放射量表示，结果如表2所示。

结果表明，本发明药物在32-125μg/ml浓度范围内，随浓度的上升，对巨噬细胞分泌IL-1的促进作用加强。浓度进一步上升，对巨噬细胞分泌IL-1的促进作用则减弱，呈现出下调作用。

表2.本发明药物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1的影响(n＝5，cpm，

)

注：与Con A和稀释度为1∶40的空白对照比：^ap＜0.05，^bp＜0.01 ^cp＜0.01，与Con A和稀释度为1∶60的空白对照比：^cp＜0.01，^dp＜0.001；与Con A和稀释度为1∶80的空白对照比：^dp＜0.05，^fp＜0.01.

实施例4、本发明药物对小鼠T淋巴细胞增殖的调节作用

取6～8周龄健康小鼠72只，分为6组(每组12只，

/♀各半，自由取食、饮水)，1～5组分别灌胃20、40、60、80、100mg·kg^-1·d^-1剂量的本发明药物，另设空白对照组，每天灌胃等体积的生理氯化钠溶液。给药后的第5、10、15天分别取上述6组中的4只小鼠摘眼球放血，脱颈椎处伤，无菌取脾，培养、收集脾淋巴细胞，在液体闪烁计数仪中测定每个孔的放射量，结果如表3所示。

结果表明，本发明药物给药的第5天便显示出对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用，并随给药时间增加而越来越显著。不同剂量的本发明药物对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用表现出不同的调节作用，在20-60mg·kg^-1·d^-1范围内对淋巴细胞增殖作用随剂量的增加而加强，80mg·kg^-1·d^-1以上对淋巴细胞增殖作用随剂量的增加而减弱。

表3.对小鼠淋巴细胞增殖的调节作用(n＝5，cpm，)

注：与空白对照组相比：^ap＜0.05，^bp＜0.01，^cp＜0.001

实施例5、本发明药物对小鼠脾淋巴细胞产生IL-2的调节作用。

取6～8周龄健康小鼠72只，分为6组(每组12只，

/♀各半，自由取食、饮水)，1～5组分别灌胃20、40、60、80、100mg·kg^-1·d^-1剂量的本发明药物，另设空白对照组，每天灌胃等体积的生理氯化钠溶液。给药后的第5、10、15天分别取上述6组中的4只小鼠摘眼球放血，脱颈椎处伤，无菌取脾，按文献(郑维发，石枫，王莉等.金铁锁总甙对小鼠细胞免疫功能的影响[J].武警医学2003，14(10)：598)所述的方法，培养、收集淋巴细胞培养上清液于-20℃保存。

另取小鼠6只(20±2g，♀/

各半)，脱颈椎处伤后，无菌制备小鼠胸腺细胞并加入96孔板中，0.1ml/孔，含胸腺细胞1×10⁶个。将所得小鼠脾细胞培养上清液(含IL-2)用RPMI-1640培养液作1∶1、1∶2和1∶4稀释，分别加入上述培养孔中，每孔50μl，然后每孔加入刀豆蛋白(Con A)，使其终浓度为1μg/ml，另设Con A对照孔。在液体闪烁计数仪中测定每个孔的放射量，结果如表4所示。

结果表明，实验小鼠对IL-2的生成随不同的给药剂量和不同的时间而呈现明显的变化。40～80mg·kg^-1剂量的本发明药物在给药后的第5天，20～60mg·kg^-1的第10天均显示出对小鼠淋巴细胞生成IL-2的促进作用，并呈剂量依赖性和给药时间依赖性的效应关系；剂量为80mg·kg^-1以上的本发明药物对小鼠淋巴细胞生成IL-2的促进作用减弱。不同稀释比的的淋巴细胞培养上清IL-2的活力有所不同，稀释比为1∶4的淋巴细胞培养上清IL-2具有较强的活性。

表4.本发明药物对小鼠淋巴细胞分泌IL-2的调节作用(n＝5，cpm，

)

注：与生理盐水1∶1的稀释度相比：^ap＜0.01，^bp＜0.001 ^Cp＜0.05；与生理盐水1∶2的稀释度相比：^dp＜0.01；与生理盐水1∶4的稀释度相比：^ep＜0.05，^fp＜0.01。

实施例6、本发明药物对小鼠NK细胞杀伤活性的调节作用

取KM小鼠70只，分为7组，其中的6组以40mg·kg^-1的剂量腹腔注射环磷酰胺，造成NK细胞杀伤活力下降，另一组为正常对照小鼠。6组腹腔注射环磷酰胺小鼠中的5组分别灌胃20、40、60、80和100mg·kg^-1·d^-1剂量的本发明药物10天；另1组为空白对照组，每天灌胃等体积的生理盐水；末次给药24小时后无菌取脾脏，制成脾细胞悬液，作为效应细胞；以Hela细胞作为靶细胞，用RPMI-1640完全培养基分别将效应细胞、靶细胞调至1×10⁷/ml、2×10⁵/ml，加入96孔板中，每孔100μl，使效应细胞∶靶细胞＝50∶1，另设效应细胞和靶细胞对照，每份标本设5个平行孔。置于37℃，5％CO₂条件下杀伤4小时，加入MTT(5mg/ml)15μl，继续孵育3小时，每孔加100μl酸化异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解，于酶标仪570nm处测光密度(A值)。NK细胞活性按下式公式计算：NK细胞活性百分比＝[靶细胞A值-(实验组A值-效应细胞A值)]/靶细胞A值×100％，结果如表5所示。

由表5可见，腹腔注射CP小鼠的NK细胞杀伤活力比正常小鼠下降10％左右，而口服本发明药物对NK细胞的杀伤活力有明显的提升作用。其中，药物剂量在40mg·k^-1可恢复NK细胞杀伤活力到正常水平，60mg·kg^-1将使NK细胞杀伤活力超出正常水平8％左右，这种提升作用在剂量80mg·kg^-1以上时有所下降。

NK细胞是细胞免疫中的非特异性细胞，是机体免疫监视功能的重要执行者，先于T细胞发挥作用，它能非特异性杀伤肿瘤细胞，其杀伤作用毋须抗原预先致敏，也不需要抗体参加，不受MHC限制，为机体抵抗微生物侵入的第一道防线。结果表明，不同剂量的本发明药物对小鼠NK细胞的杀伤活力有着双向调节作用。

表5.本发明药物对小鼠NK细胞的杀伤活力的影响(n＝10，

)

注：与CP对照相比^ap＜0.01，^bp＜0.001；与正常对照相比^cp＜0.05，^dp＜0.01

实施例7、本发明药物对网状内皮系统(RES)吞噬活力的调节作用

取KM小鼠(18±2g)70只，分为七组，空白对照组灌以生理盐水，阴性对照组以20mg·kg^-1·d^-1灌以环磷酰胺，另五组实验组分别以20、40、60、80和100mg·kg^-1·d^-1剂量连续给药。七天后，各组动物在末次给药后一小时分别用肝素钠处理，从眼眶后静脉丛取血50μl，立即放入5.0ml蒸馏水中使之完全溶血作为对照管；随即从尾静末注入10g.L^-1刚果红生理盐水溶液，每10g小鼠给0.1ml，至注射后30秒，同法再取血50μl放入5.0ml蒸馏水中溶血，作为实验管。在510nm波长下以蒸馏水调零，测试对照管和实验管光密度，根据两者之差，从刚果红标准曲线查出每毫升小鼠血中刚果红的含量(μg)，含量越低，表明RES吞噬功能越强，结果如表6所示。

结果表明，灌胃20mg·kg^-1·d^-1环磷酰胺导致RES的吞噬能力大大下降(P＜0.05)；而口服本发明药物60mg·kg^-1·d^-1可使RES的吞噬能力大大上升，药物剂量在20～60mg·kg^-1·d^-1范围内，小鼠对刚果红的清除能力呈剂量依赖性的量效关系，并大大高于正常小鼠对异物的清除能力；药物剂量在80mg·kg^-1·d^-1以上时，小鼠对刚果红的清除能力有所下降。由此可见，适当剂量的本发明药物对RES吞噬活力有显著的提升作用。

表6.本发明药物对小鼠RES吞噬活性的调节作用(n＝10，)

注：与空白对照比较：^aP＜0.05；^bP＜0.05；^cP＜0.001

实施例8、本发明药物对小鼠抗体生成的调节作用

取KM小鼠40只，分为4组，其中的3组分别以50、75和100mg·kg^-1·d^-1的本发明药物灌胃；另设空白对照组，每天分别灌胃等体积的生理盐水。5天后腹腔注射0.2ml 20％绵羊红细胞(约2×10⁹/ml)，无菌取脾脏，用PBS配成3.5×10⁶/ml脾细胞悬液，于干净试管中依次加入1×10⁷/ml绵羊红细胞、1∶10稀释的豚鼠血清、脾细胞悬液各1ml，37℃水浴1小时，2000转离心5分钟，取上清于413nm处测定吸光度，抗体生成率＝[标准管吸光度-样品管的吸光度」/标准管吸光度×100％，结果如表7所示。

结果表明，本发明药物能显著提高小鼠抗体生成能力，其中，75mg·kg^-1·d^-1剂量的本发明药物对小鼠抗体生成能力的提升作用最为显著，剂量上升到100mg·kg^-1·d^-1时，提升作用减弱。

表7.本发明药物对小鼠抗体生成能力的提升作用

注：与空白对照比较：*P＜0.05

实施例9、本发明药物对S-180肿瘤的抑制作用

取KM小鼠100只，分为10组，其中的3组分别按50、75、100mg·kg^-1·d^-1灌胃给药5天后，分别皮下接种S-180肉瘤(5×10⁶个S-180肿瘤细胞)，继续给药10天(造模前5天给药组)；另取3组小鼠于皮下接种S-180的当天按100，250和500mg·kg^-1·d^-1的剂量灌胃15天(造模同时给药组)；另取3组于接种S-180的5天后按100，250和500mg·kg^-1·d^-1的剂量灌胃15天(造模5天后给药组)；1组为环磷酰胺对照组，于接种的当天按剂量为20mg·kg^-1·d^-1灌胃给药。末次给药24小时后处死小鼠，取肉瘤称重，按如下公式计算：抑瘤率＝(模型组瘤重-给药组瘤重)÷模型组瘤重×100％，结果如表8所示。

结果显示，提前5天给药的本发明药物对S-180肉瘤的抑制率在57％以上，其中75mg·kg^-1·d^-1的本发明药物抑瘤率达66.79％；而同时给药的本发明药物对S-180肉瘤的抑制率在38％以上，其中75mg·kg^-1·d^-1的本发明药物抑瘤率达47.93％；接种肉瘤5天后给药，本发明药物对S-180肉瘤的抑制率在17％左右。上述结果进一步说明本发明药物可以有效地提高机体免疫力，预防肿瘤的形成，抑制肿瘤的生长。

表8.本发明药物对S-180肿瘤的抑制作用(n＝10，

)

实施例10、本发明药物对荷瘤小鼠免疫器官及免疫细胞数量的影响

取KM小鼠120只，分为12组，其中的3组分别按50、75、100mg·kg^-1·d^-1灌胃给药5天后，分别皮下接种S-180肉瘤(5×10⁶个S-180肿瘤细胞)，继续给药10天(造模前5天给药组)；另取3组小鼠于皮下接种S-180的当天按100，250和500mg·kg^-1·d^-1的剂量灌胃15天(造模同时给药组)；另取3组于接种S-180的5天后按100，250和500mg·kg^-1·d^-1的剂量灌胃15天(造模5天后给药组)；1组为环磷酰胺对照组，于接种的当天按剂量为20mg·kg^-1·d^-1灌胃给药；1组为空白对照组，只接种S-180肿瘤细胞，每天灌胃等同体积的蒸馏水；1组为正常对照组。末次给药24小时后称重，摘眼球放血，收集血液并处死小鼠，以淋巴细胞分离液分离其中的淋巴细胞，计算胸腺指数和脾指数，结果如表9所示。

结果表明，荷瘤小鼠的胸腺与脾指数以及血液淋巴细胞数量大大减少，而每日灌胃环磷酰胺的实验小鼠的脾脏和胸腺指数以及血液淋巴细胞数量则进一步减少；提前5天给药的3个剂量的本发明药物均能明显提高荷瘤小鼠的胸腺荷脾脏指数，增加血液淋巴细胞的数量，其中，75mg·kg^-1·d^-1的本发明药物可使这三个指标恢复到正常水平；与造模同时给药或于造模后5天给药的本发明药物也能使荷瘤小鼠的这三个指标有所提升，其中以75mg·kg^-1·d^-1剂量的本发明药物较为显著。

表9.本发明药物对荷瘤小鼠免疫器官的影响(n＝10，

)

注：与正常对照比较：^aP＜0.01；与空白对照比较：^bP＜0.01；^cP＜0.05

实施例11、本发明药物对病毒性肺炎的预防和治疗作用

本实施例所用的病毒为流感病毒小鼠肺炎适应株(Nakamura et al.，Enhanced resistancy of thioredoxin-transgenic mice against influenza virus-induced pneumonia.Immunology Letters 2002；82：165-170)选择滴度为640∶1的含该病毒的鸡胚鸟囊液，每只小鼠接种50μl。取体重为14～16g的KM小鼠按下列三种方案进行给药：1.病毒感染前4天开始灌胃给药，共给药7天；2.病毒感染前1天开始给药，共给药7天；3.病毒感染前4天给药，共给药10天。每种给药方案为4个剂量组，分别为20、40、60、80mg·kg^-1·d^-1，另设正常组、模型组(接种病毒，灌胃等同体积的蒸馏水)和阳性对照组(利巴韦琳，剂量为40mg·kg^-1·d^-1)。每个给药方案结束后，小鼠称重，摘眼球放血，处死，取肺，按下列公式计算肺指数和肺指数抑制率：肺指数＝肺重/体重；肺指数抑制率＝[(模型组肺指数-实验组肺指数)/模型组肺指数]×100％，结果如表10所示。

结果表明，经给药方案3处理的小鼠肺部炎症轻微，只有很小的局部充血，肺指数比模型组相比显著减小，与同等剂量的给药方案1、2相比，也有较低的肺指数和较高的肺指数抑制率。给药方案1中，本发明药物在60mg·kg^-1·d^-1时抑制率最大(18.69％)，而给药方案2、3中，本发明药物在40mg·kg^-1·d^-1时抑制率最大，分别为26.7％和30.40％。由此可见，本发明药物对流感病毒引起的肺炎既有很好的预防作用，也有一定的治疗作用。

表10.本发明药物三种给药方案的体内抗病毒活性(n＝10，)

注：与模型组比较：^ap＜0.05，^bp＜0.01；与给药方案1比较：^cp＜0.01；与给药方案2比较：^dp＜0.05。

Claims (1)

1.嗜盐隐杆藻胞外多糖在制备抗肿瘤药物中的应用；

其中，所述嗜盐隐杆藻胞外多糖是采用以下方法制备方法：将对数后期的嗜盐隐杆藻培养物静置24h，使藻体缓慢沉淀；上清液虹吸于大型蒸发皿中让水分室温蒸发或置阳光下浓缩培养液；然后，将浓缩的培养液置透析袋在流动的自来水中透析24h；透析袋内容物重新置蒸发皿中浓缩，加2倍体积的乙醇溶液沉淀多糖，冷冻干燥得白色粉末，即为嗜盐隐杆藻胞外多糖；

所述抗肿瘤药物中，嗜盐隐杆藻胞外多糖的使用剂量为6-8mg/公斤体重·天；

所述肿瘤为S-180肿瘤。