具体实施方式
实施例1:
取25.5%的灵芝提取物(单位重量百分数,下同)、24.5%的刺五加提取物、5.5%的西洋参提取物、11.5%的红景天提取物、32.8%的淀粉、0.2%的硬脂酸镁分别过80目筛,并混合,以30min为宜,将混合粉装入胶囊,每粒0.45g。
实施例2:
取29.5%的灵芝提取物(单位重量百分数,下同)、20.5%的刺五加提取物、6.5%的西洋参提取物、10.5%的红景天提取物、32.6%的淀粉、0.4%的硬脂酸镁分别过80目筛,并混合,以30min为宜,将混合粉装入胶囊,每粒0.45g。
实施例3:
取33.5%的灵芝提取物(单位重量百分数,下同)、16.5%的刺五加提取物、8.5%的西洋参提取物、7.5%的红景天提取物、32.5%的淀粉、0.5%的硬脂酸镁分别过80目筛,并混合,以30min为宜,将混合粉装入胶囊,每粒0.45g。
实施例4:
取35.5%的灵芝提取物(单位重量百分数,下同)、14.5%的刺五加提取物、10.5%的西洋参提取物、6.5%的红景天提取物、32.7%的淀粉、0.3%的硬脂酸镁分别过80目筛,并混合,以30min为宜,将混合粉装入胶囊,每粒0.45g。
实施例5:
取39.5%的灵芝提取物(单位重量百分数,下同)、10.5%的刺五加提取物、11.5%的西洋参提取物、5.5%的红景天提取物、32.6%的淀粉、0.4%的硬脂酸镁分别过80目筛,并混合,以30min为宜,将混合粉装入胶囊,每粒0.45g。
实施例6:
本发明对缓解体力疲劳功能的研究
1.材料
1.1样品:由无锡天赐康生物科技有限公司提供,人体推荐量为0.45×4/人/日(30mg/kg.bw)。
1.2实验动物及饲养
SPF级雄性ICR小鼠,体重19~22g,由四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所提供(动物合格证号:SCXK(川)2004-16号)。饲养条件:屏障级动物房(四川省实验动物管理委员会许可证号:SYXK(川)2008-011)。
1.3主要仪器
SBA-生物传感分析仪,奥林巴斯AU400型自动生化分析仪,VIS-7200可见分光光度计,匀浆机,离心机,电子天平。以上器材由四川大学华西公共卫生学院分析测试中心提供。
2.实验方法
2.1剂量选择
将实验动物随机分为空白对照组和3个本发明试验组。受试物剂量分别为300mg/kg.bw、600mg/kg.bw、900mg/kg.bw(分别相当于人体推荐摄入量的10、20和30倍)。灌胃液配制:称取0.6g、1.2g和1.8g本发明样品,分别溶于40ml蒸馏水中,按20mg/kg.bw灌胃。空白对照组动物以蒸馏水灌胃,各实验组动物以相应剂量的蒸馏水溶液灌胃,每日一次,连续灌胃30天后进行实验
2.2实验步骤
2.2.1负重游泳实验:末次给予受试物30min后,将尾部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。箱中水深不少与30cm,水温25±1℃,记录小鼠自游泳开始至死亡的时间。
2.2.2血乳酸测定:末次给予受试物30min后,将动物置温度为30℃的水中不负重游泳10min,并于游泳前、游泳后立即、游泳后休息20min各采眼球血20μL测定乳酸含量。并按下述公式计算血乳酸曲线下面积,以判断运动后血乳酸变化情况。血乳酸曲线下面积=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min血乳酸值+2×游泳后休息20min血乳酸值)
2.2.3血清尿素氮测定:末次给予受试物30min后,将小鼠置温度为30℃的水中不负重游泳90min,休息60min后采眼球血0.5mL,血凝固后取血清用奥林巴斯AU400型自动生化分析仪测定血清尿素氮含量。
2.2.4肝糖原测定:于末次给予受试物30min处死动物,取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干,迅速称取肝脏100mg,测定肝糖原含量(蒽酮法)。
3.实验数据统计
实验数据用PEMS for Windows3.0统计软件包进行方差分析;方差不齐数据进行适当的变量转换;若变量转换后仍未达到方差齐者,用秩和检验统计。
4结果
4.1本发明对小鼠体重的影响
表1 本发明对小鼠体重的影响(负重游泳实验)(X±S)
表2 本发明对小鼠体重的影响(血乳酸测定)(X±S)
表3 本发明对小鼠体重的影响(尿素氮测定)(X±S)
表4 本发明对小鼠体重的影响(肝糖原测定)(X±S)
由表1-4可见,本发明三个剂量组合空白对照组间小鼠初始体重、实验中期体重和实验结束时体重无显著性差异(P>0.05)。表明本发明对小鼠体重无影响。
4.2本发明对小鼠负重游泳时间的影响
表5 本发明对小鼠负重游泳时间的影响(X±S)
★与空白对照组比较,P<0.05
由表5可见,本发明中剂量组和高剂量组小鼠负重游泳时间显著长于空白对照组(P<0.05)。
4.3本发明对小鼠血乳酸含量的影响
表6 本发明对小鼠血乳酸含量的影响(X±S)
由表6可见,本发明各剂量组游泳后三个时点血乳酸曲线下面积与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。
4.4本发明对小鼠血清尿素氮含量的影响
表7 本发明对小鼠血清尿素氮含量的影响(X±S)
○:与空白对照组比较,P<0.05;●:与空白对照组比较,P<0.01。
由表7可见,本发明3个剂量组血清尿素氮含量显著低于空白对照组(P<0.05,P<0.01)。
4.5本发明对小鼠肝糖原含量的影响
表8 本发明对小鼠肝糖原含量的影响(X±S)
★与空白对照组比较,P<0.05
由表8可见,本发明低剂量组肝糖原含量显著高于空白对照组(P<0.05)。
5.总结
本发明中、高剂量组小鼠负重游泳时间显著长于空白对照组(P<0.05);低、中、高三个剂量组血清尿素氮含量显著低于空白对照组(P<0.05,P<0.01);低剂量组肝糖原含量显著高于空白对照组(P<0.05)。依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版可以判定,本发明具有缓解体力疲劳的功能。
实施例7:
本发明对辐射危害有辅助保护功能的研究
1.材料
1.1样品:由无锡天赐康生物科技有限公司提供。推荐成人服用量为1.8g/60kg/日,实验时采用蒸馏水配制和稀释。
1.2实验动物及饲养
ICR种雌性小白鼠,体重18~22g,由四川省医科院实验动物研究所提供,合格证号:SCXK(川)2004-16号。实验前检疫一周,整个实验过程中,动物饲养于屏障级动物房(许可证号:四川省实验动物管理委员会第011号),动物自由摄食和饮水,动物房温度21~24℃,相对湿度60~65%。
1.3主要仪器与试剂
1.3.1主要仪器:60Coγ射线治疗仪(THERATRON PHOENIX,加拿大产),光学显微镜,电子天平,721P可见分光光度计。以上器材由四川大学华西公共卫生学院分析测试中心提供。
1.3.2主要试剂:超氧化物岐化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所制备)。
2.实验方法
2.1剂量选择
ICR种雌性小白鼠240只,随机分组,按一下4项试验,每项试验分别设3个本发明试验组,1个空白对照组合1个辐射对照组,共计20个组,每组12只小鼠。试验组动物分别按人体推荐量1.8g/人/日(30mg/kg.bw)的10倍、20倍、30倍即300mg/kg.bw、600mg/kg.bw、900mg/kg.bw(配制方法:分别称取3g、6g和9g样品,各加蒸馏水至200ml),于辐照前、后按2ml/100g.bw连续灌胃给予受试物(每天一次),共30天;空白对照组、辐射对照组动物每天用蒸馏水灌胃。
2.2实验步骤
2.2.1外周血白细胞技术试验:给予受试物16天后,将辐射对照组及三个受试物试验组小鼠进行一次性全身辐照,辐照吸收剂量为4Gy,并分别于照射前1周、照射后第3天、第14天三次采尾静脉血进行白细胞计数。
2.2.2骨髓有核细胞计数、骨髓微核试验:给予受试物28天后,将辐射对照组及三个受试物试验组小鼠进行一次性全身辐照,辐照吸收剂量为4Gy,于辐照后3天处死动物,取一侧股骨,用1ml注射器吸去1mlHank’s液冲出股骨骨髓中全部骨髓细胞,然后让细胞悬液通过4号针头的注射器,混匀后取20μl细胞悬液加入0.38ml白细胞稀释液中,再经混匀后进行有核细胞技术,计算每ml骨髓细胞混悬液(原液)中的有核细胞数。取胸骨骨髓按规定方法制片、染色、镜检,每只小鼠技术1000个嗜多染红细胞(PCE),观察含有微核的嗜多染红细胞数,计算微核率(‰)。
2.2.3血中超氧化物歧化酶(SOD)活性试验:给予受试物24天后,将辐射对照组及三个受试物试验组小鼠进行一次性全身照射,辐射吸收剂量为6Gy。于辐照后第7天处死小鼠,取静脉血案超氧化物歧化酶测定试剂盒规定方法(黄嘌呤氧化酶法)测定超氧化物岐化酶(SOD)活性。
2.2.4血清溶血素试验:给予受试物25天后,将辐射对照组及三个受试物试验组小鼠进行一次性全身辐照,辐射吸收剂量为3Gy,于照射后一周内采用血凝法测定血清溶血素。
3实验数据统计
采用各实验组与对照组均数比较的方差分析以及两样本均数比较对数据进行处理。方差不齐采用秩和检验。所用软件为PEMS3.1《中国医学百科全书医学统计学》统计软件包(第三版)。
4.结果
4.1本发明对小鼠体重的影响
表9 本发明对小鼠体重的影响(WBC试验组)(X±S)
表10 本发明对小鼠体重的影响(微核、有核细胞试验组)(X±S)
表11 本发明对小鼠体重的影响(SOD试验组)(X±S)
表12 本发明对小鼠体重的影响(溶血素试验)(X±S)
由表1-4可见,辐照对照组及本发明三个剂量试验组小鼠的初始体重、中期体重及试验结束时体重与空白对照组比较,差异均无显著性(P>0.05),本发明对小鼠的体重无影响。
4.2本发明对小鼠白细胞数的影响
表13 本发明对小鼠白细胞数的影响(X±S)
○:P<0.01(与空白对照组比较),●P<0.05(与辐射前比较),★P<0.05(与辐照对照组比较)
由表13可见,辐照前各实验组的外周白细胞计数,各剂量组合辐射模型对照组与空白对照组相比较,差异无显著性(P>0.05)。辐照后第3天,辐射对照组、本发明各剂量组小鼠白细胞数明显降低,辐射对照组与空白对照组,及照射前自身比较差异有显著性(P<0.01),说明辐射损伤模型成立。辐照后第3天,受试物低剂量组与辐射对照组比较白细胞数明显升高(P<0.05),辐照后第14天,受试物各剂量组的外周白细胞计数与辐射对照组比较均无显著性差异(P>0.05),即本检品可增加受辐射小鼠白细胞数。
4.3本发明对小鼠骨髓有核细胞数的影响
表14 本发明对小鼠骨髓有核细胞数的影响(X±S)
○:P<0.01(与空白对照组比较),●:P<0.01、★:P<0.05(与辐射对照组比较)
由表14可见,辐照后,辐射对照组小鼠有核细胞数降低,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01),受试物各剂量组的小鼠骨髓有核细胞计数明显升高,与辐射对照组比较具有统计学意义(P<0.05及P<0.01),即本发明可增加受辐照小鼠骨髓有核细胞数。
4.4本发明对小鼠嗜多染红细胞微核发生率的影响
表15 本发明对小鼠嗜多染红细胞微核发生率的影响(X±S)
★P<0.01(与空白对照组比较)
由表15可见,辐照后,辐射对照组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核数明显增加,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01),受试物各剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核数与辐射对照组比较均无显著性差异(P>0.05),即本发明对受辐照小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率无明显影响。
4.5本发明对小鼠血清超氧化物岐化酶(SOD)活性的影响
表16 本发明对小鼠血清超氧化物岐化酶(SOD)活性的影响(X±S)
○:P<0.01(与空白对照组比较),●:P<0.01(与辐照对照组比较)
由表16可见,辐照后,辐射对照组小鼠血清超氧化物岐化酶活力降低,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01);受试物低、中剂量组小鼠血清超氧化物岐化酶活力与辐射对照组比较,均明显升高,差异具有显著性(P<0.01),即本发明可增加受辐照小鼠血清超氧化物岐化酶活力。
4.6本发明对小鼠血清溶血素的影响
表17 本发明对小鼠血清溶血素的影响(X±S)
★:P<0.01(与空白对照组比较)
由表17可见,辐照后辐射对照组小鼠血清溶血素降低,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01);受试物三个剂量组小鼠血清溶血素与辐射对照组比较,差异均无显著性(P>0.05),即本发明对受辐照小鼠血清溶血素无明显作用。
5.总结
试验结果表明:本发明能使受辐照小鼠骨髓有核细胞数增加(P<0.01),外周血白细胞数升高(P<0.05),血清超氧化物歧化酶(SOD)活性增加(P<0.01),对小鼠骨髓微核数和血清溶血素均无明显作用(P>0.05)。依据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版可以判定,本发明对辐射危害有辅助保护功能。