CN102198263A

CN102198263A - 甘薯Sporamin蛋白在制备预防和治疗肿瘤药物及保健品中的应用

Info

Publication number: CN102198263A
Application number: CN2010101317415A
Authority: CN
Inventors: 木泰华; 李鹏高; 邓乐
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2010-03-23
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2030-03-23
Also published as: CN102198263B

Abstract

本发明公开了甘薯Sporamin蛋白的新用途。该新用途是甘薯Sporamin蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用以及在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。抗癌活性试验结果表明，甘薯Sporamin蛋白能抑制人结肠癌细胞株SW480细胞、HCT-8细胞、Lewis肺癌细胞的增殖和转移，抑制其对基底膜的侵袭，具有显著的抗癌作用。此外，甘薯Sporamin蛋白来源于粮食作物甘薯，其高安全性可以保证病人长期用药的需要；且甘薯Sporamin蛋白的必需氨基酸组成合理，具有改善营养的作用，可以从多角度提高癌症患者的健康状况。

Description

甘薯Sporamin蛋白在制备预防和治疗肿瘤药物及保健品中的应用

技术领域

本发明涉及甘薯Sporamin蛋白的新用途，具体涉及甘薯Sporamin蛋白在制备预防和治疗肿瘤药物及保健品中的应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas)是旋花科(Convolvulaceae)甘薯属一年生或多年生蔓生草本，又名山芋、红芋、番薯、红薯、白薯、地瓜、红苕等，因地区不同而有不同的名称。甘薯营养丰富，富含淀粉和可溶性糖，还含有蛋白质、脂肪酸、多种维生素、多酚类物质及钙、磷、铁等矿物质。其蛋白含量约为1.2-10g/100g干物质，但不同品种之间蛋白含量可有较大差异。

Sporamin蛋白是甘薯块根中一组特殊蛋白质，1985年由Maeshima等发现，它主要存在于甘薯块茎中，占甘薯可溶性蛋白的60％～80％，而其它器官中几乎没有。它是甘薯特异性的贮藏蛋白，在植株发育中为萌发的幼苗提供氮源。成熟的sporamin蛋白由sporamin A和sporamin B两种组分构成，相对分子量分别为31kD和22kD，不含糖基，不属于糖蛋白类型，在植物体内主要以单体形式存在。研究表明Sporamin蛋白具有消除DPPH自由基和羟基自由基的活性，还具有Kunitz型的胰蛋白酶抑制剂活性。但是到目前为止，还没有甘薯Sporamin蛋白在抑制肿瘤细胞生长和转移方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供甘薯Sporamin蛋白的新用途。

本发明所提供的甘薯Sporamin蛋白的用途是其在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。

所述产品具体可为药物或保健品。所述肿瘤为癌；所述癌包括身体各系统的癌症，如结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、鼻咽癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌，优选为结肠癌或肺癌。

以甘薯Sporamin蛋白为有效成分制备的预防和/或治疗肿瘤的药物或保健品，也属于本发明的保护范围。

需要的时候，在上述药物或保健品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述预防和/或治疗肿瘤药物或保健品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。根据制备的不同剂型，可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法将药物导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明提供的甘薯Sporamin蛋白的新用途还为：甘薯Sporamin蛋白在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。

本发明中所述真核生物为哺乳动物。所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞具体可为结肠癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞或直肠癌细胞；优选为结肠癌细胞(如HCT-8细胞、SW480细胞)或肺癌细胞(如Lewis肺癌细胞)。

本发明所述的甘薯Sporamin蛋白是从旋花科(Convolvulaceae)甘薯属一年生或多年生蔓生草本植物甘薯中提取的可溶性蛋白质，以sporamin蛋白为主要成分，还包括少量的糖蛋白；在非还原条件下，SDS-PAGE电泳显示其中存在着三种不同的分子形式：22kDa，31kDa及50kDa；但在还原条件下，只显示出25kDa一种蛋白分子形式。该甘薯Sporamin蛋白是通过现有的任何可行方法获得的一类蛋白质类物质。该甘薯Sporamin蛋白是一种水提物或其它形式的提取物；也包括将甘薯Sporamin蛋白经任何方法降解制得的不同分子量的产物和通过基因工程生产的sporamin蛋白质。

如可按照下述a)或b)的方法制备甘薯Sporamin蛋白：

a)将甘薯切碎，置于缓冲溶液A中浸泡、打浆、浆液离心、取上清液，冰浴下向所述上清液中添加硫酸铵至50％至70％的饱和度、静置、离心、收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水或Tris-HCl缓冲溶液中，冷冻干燥，即得甘薯Sporamin蛋白；其中，所述缓冲液A由NaHSO₃和50-500mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液组成，所述缓冲液A中NaHSO₃的质量浓度为0.1％至5％，所述缓冲溶液A的pH值为7.0-8.0；所述甘薯与缓冲溶液A的配比为1kg∶(1-5)L；

b)将甘薯切碎，置于亚硫酸氢钠冰水溶液中，然后将薯块打成浆状，过滤，将滤液离心，收集上清液并用盐酸调pH至4-6，再次离心，收集沉淀；将所述沉淀用1-20倍体积的质量浓度为1％至10％的氯化钠溶液稀释后，用氢氧化钠调pH至中性，经过截留分子量为8000以上的透析膜透析后冷冻干燥，即得甘薯Sporamin蛋白。

为了得到高纯度的甘薯Sporamin蛋白，可采用下述方法进行纯化：

1)将甘薯Sporamin蛋白加水溶解，离心收集上清液，所述上清液经0.22um微孔滤膜过滤后，上DEAE-52离子交换层析柱；用缓冲溶液B进行洗脱，流速为0.10-0.50ml·min^-1，收集洗脱液中280nm波长的吸光度曲线上的第二吸收峰的组分，即为初步纯化的sporamin蛋白；所述缓冲溶液B的pH值为7.5，其由EDTA、NaCl和50mmol·L^-1Tris-HCl组成，其中EDTA浓度为1mmol·L^-1，NaCl浓度为0.2mol·L^-1；

2)将步骤1)制备的初步纯化的sporamin蛋白用超滤杯浓缩后，用Sephadex G-75凝胶层析柱进一步纯化；用缓冲溶液C进行洗脱，流速为0.10-0.50ml·min^-1，收集洗脱液中280nm波长的吸光度曲线上的第一吸收峰的组分，冷冻干燥，即得到纯化的sporamin蛋白；所述缓冲溶液C的pH值为7.5，其由EDTA、NaCl和50mmol·L^-1Tris-HCl组成，其中EDTA浓度为1mmol·L^-1，NaCl浓度为0.1mol·L^-1。

所述甘薯包括各种品种的甘薯属植物，如徐薯55-2、北京553(玉丰、济薯5号、泰薯2号等)、冀薯98、徐薯18、商薯19、遗字138、冀薯4号、徐薯23、京薯6号、冀薯99、西农431、豫薯10号(商52-7)、冀薯6-8、苏薯8号、豫薯10号、徐紫薯1号、烟紫薯1号、宁紫薯1号(宁P-4)、高胡萝卜素甘薯-“维多丽”、台农71、福薯7-6、莆薯53、无糖1号、冀薯71、冀5-53、冀3-32、济薯18、冀紫7-1等甘薯品种中的一种或几种。

抗癌活性试验结果表明，甘薯Sporamin蛋白能抑制人结肠癌细胞株SW480细胞、HCT-8细胞、Lewis肺癌细胞的增殖和转移，抑制其对基底膜的侵袭，具有显著的抗癌作用。此外，甘薯Sporamin蛋白来源于粮食作物甘薯，其高安全性可以保证病人长期用药的需要；且甘薯Sporamin蛋白的必需氨基酸组成合理，具有改善营养的作用，可以从多角度提高癌症患者的健康状况。

附图说明

图1为实施例1中甘薯Sporamin蛋白DEAE-52离子交换层析的洗脱曲线图。

图2为实施例1中DEAE-52离子交换层析组分的SDS-PAGE图谱，图2-a为添加β-巯基乙醇的图谱，图2-b为未添加β-巯基乙醇的图谱；其中，条带1为第24管洗脱液，条带2为第25管洗脱液，条带3为第32管洗脱液，条带4为第35管洗脱液，条带5为第40管洗脱液。

图3为实施例1中离子交换层析组分2的Sephadex G-75凝胶层析的洗脱曲线图。

图4为实施例1中Sephadex G-75凝胶层析组分的SDS-PAGE图谱，其中，条带1为第30管洗脱液，条带2为第38管洗脱液，条带3为第43管洗脱液，条带4为第46管洗脱液，条带5为第74管洗脱液。

图5为甘薯Sporamin蛋白对裸鼠腹膜弥散型人结肠瘤HCT-8细胞移植瘤的抑制作用。

图6为甘薯Sporamin蛋白对Lewis肺癌细胞在C57小黑鼠体内自发性肺转移的抑制作用。

图7为甘薯Sporamin蛋白在体外对人结肠癌SW480细胞的增殖的抑制作用。

图8为甘薯Sporamin蛋白在体外对人结肠癌SW480细胞的迁移能力以及对人工基底膜的侵袭能力的抑制作用。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步地说明。下述实施例仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公认知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、从55-2甘薯制备并纯化甘薯Sporamin蛋白

甘薯粗蛋白的制备：

将鲜薯(品种：55-2，蛋白含量0.5～3.0g/100g鲜重)清洗、称重、切碎，在含0.1％NaHSO₃的50mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中浸泡(1L·kg^-1鲜重)、打浆、浆液离心(3000g离心10min)、取上清液，冰浴下向上清液中添加硫酸铵至60％的饱和度、静置、离心(3000g离心30min)、沉淀回溶于蒸馏水或50mmol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液中、冷冻干燥，得甘薯Sporamin蛋白粗蛋白粉，蛋白含量为40％～60％。

甘薯sporamin蛋白的纯化：

称取适量的甘薯粗蛋白粉，加入100ml蒸馏水使其溶解，10000g离心40min。上清液经孔径为0.22um微孔滤膜过滤后，上DEAE-52离子交换层析柱(柱规格1.5cm×30cm)。用含1mmol·L^-1 EDTA和0.2mol·L^-1 NaCl的50mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗脱，流速0.30ml·min^-1，将洗脱液(每管3ml)在280nm波长下测吸光值并绘制洗脱曲线(见图1)。

如图1所示，甘薯粗蛋白经DEAE-52层析纯化后得到2种组分(图1中峰1和峰2)。分别对其进行了电泳分析(见图2)。在未添加β-巯基乙醇的条件下(图2-b)，峰1(图2中的1、2、3)主要有小于66kD和大于20kD等多条染色带被检出，而峰2(图2中的4、5)主要有22kD和31kD这2条染色带。当添加β-巯基乙醇时(图2-a)，峰2主要检出1条约25kD的染色带，这与甘薯sporamin蛋白的分子量是一致的，因此收集峰2组分(洗脱液第35至40管)作为初步纯化的sporamin蛋白组分，进行下一步的纯化。

然后，将初步纯化后的sporamin蛋白用超滤杯浓缩后，用Sephadex G-75凝胶层析柱(柱规格5cm×100cm)进一步纯化；用含0.1mol·L^-1 NaCl和1mmol·L^-1 EDTA的50mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗脱，流速0.45ml·min^-1，4℃操作。洗脱液(每管5ml)在280nm波长下测吸光值绘制洗脱曲线(见图3)。

如图3所示，DEAE-52层析后回收到的峰2溶液用SephadexG-75凝胶进一步纯化后得到1、2两峰，分别对其进行了电泳分析(见图4)。从图4可见，第30管(泳道1)以及峰2中的第74管(泳道5)未检出任何染色条带；而峰1中分别有22kD和31kD的染色带被检出(泳道2、3、4)，说明经过凝胶过滤层析进一步纯化处理后，可以得到近似100％纯度的sporamin蛋白，且全部集中于峰1。因此，回收峰1溶液(洗脱液第31至54管)，冻干后，-20℃保存。

实施例2从红冬甘薯制备甘薯Sporamin蛋白

甘薯粗蛋白的制备：

将洗净的甘薯(品种：55-2，蛋白含量0.5～3.0g/100g鲜重)切成2cm见方的小块，放入浓度0.5g/Kg的亚硫酸氢钠冰水溶液中以防止其褐变。然后将薯块用粉碎机打成浆状，过滤。将滤液在3000g、室温离心30min沉淀其中的淀粉。取上清液用2M盐酸调pH至4，在3000g，室温离心30min；将沉淀用10倍的5％氯化钠溶液稀释后，用2M氢氧化钠调pH至中性；经过透析膜(截留分子量8000以上，在还原条件下甘薯蛋白分子量为25000)透析后冷冻干燥，获得干燥的甘薯Sporamin蛋白粉末，蛋白含量58.9％～69.0％。

按照实施例1中的纯化方法对粗蛋白粉进行纯化。得到了纯度为99％以上的甘薯sporamin蛋白。收集sporamin蛋白纯品冻干，-20℃保存。

实施例3、甘薯Sporamin蛋白冲剂的制备

在干燥的甘薯Sporamin粗蛋白粉末(Sporamin含量为55％)中加入0.2倍质量的乳糖，0.1倍质量的微晶纤维素，每1000g加入3～5g天然果品香精添加剂，5～6g甜味剂，混匀后，用90％乙醇润湿、加压成型，再经整粒机整粒得到颗粒剂。采用复合铝箔袋进行包装。

实施例4、甘薯Sporamin蛋白片剂的制备

在干燥的甘薯Sporamin粗蛋白粉末中加入0.2倍质量的乳糖，0.1倍质量的微晶纤维素，每1000g加入3～5g天然果品香精添加剂，5～6g甜味剂，混匀后，用90％乙醇润湿、制粒，干燥、再经压片机压片、包衣既得到甘薯Sporamin蛋白片剂。

实施例5甘薯Sporamin蛋白对裸鼠腹膜弥散型人结肠癌HCT-8细胞移植瘤生长的抑制作用

该实施例通过人结肠癌HCT-8细胞裸鼠腹膜扩散性转移模型，以腹腔内生长的HCT-8移植瘤数量、重量、腹水量、和血清癌胚抗原水平为指标，研究甘薯Sporamin蛋白对人结肠癌HCT-8细胞移植瘤生长的抑制作用。

1、试验材料

本试验所用甘薯Sporamin蛋白是按照实施例1的方法从收获约1周的“55-2”种甘薯(蛋白含量8g/100g干重)中提取得到的。非还原的SDS-PAGE显示其由分子量分别为31-kDa和22-kDa的两条带构成，分别对应于Sporamin A和Sporamin B。

本试验灌胃用蛋白纯度为65％(其它成分：淀粉15％，脂肪8％，灰分6％，其它6％)，腹腔注射用蛋白纯度为89％(其它成分：脂肪3％，灰分5％，其它3％)，文中所示剂量均为换算成纯Sporamin蛋白后的剂量。

2、试验方法

将15只雌性C57BL/6nu/nu裸鼠(5周龄，14±2g/只)随机分为对照组、灌胃给药(i.g.)组和腹腔注射(i.p.)组，每组5只。无菌条件下，将HCT-8荷瘤鼠瘤体取下、剪碎，加生理盐水(瘤重∶生理盐水＝1∶3)于匀浆器中匀浆，过80目筛，细胞计数，用生理盐水调节细胞浓度至1×10⁶/ml；用1ml注射器以0.2ml/只的量将癌细胞接种到裸鼠腹腔；从第二天开始给予甘薯Sporamin蛋白生理盐水溶液(i.g.，2000mgSporamin蛋白/kg体重·天；i.p.，50mg/kg体重·天)，对照组以同体积生理盐水腹腔注射。9天后，摘除裸鼠眼球采血，离心分离血清于-20℃冰箱保存以备测量癌胚抗原(CEA)含量；然后处死裸鼠，解剖，观察腹腔内肿瘤结节生长情况并拍照；切下、收集所有肿瘤结节并称重，甲醛固定并切片HE染色观察。

3、试验结果

结果见图5；其中，A.为裸鼠腹腔内肿瘤结节的生长情况；B.为肠系膜上的肿瘤结节；C.为裸鼠腹腔内肿瘤结节的总重量；D.为裸鼠腹腔内的腹水量；E.为裸鼠血清癌胚抗原(CEA)含量；F.为裸鼠处死前的体重。i.p.代表腹腔注射；i.g.代表灌胃给药.n＝5，^*，P＜0.05，^**，P＜0.01。

如图5-A显示，将人直肠结肠癌HCT-8细胞株接种到裸鼠腹腔后若不进行任何干预，9天后对照组裸鼠腹腔内脏器表面、腹腔内膜、肠系膜(图5-B)等各部位将会形成肉眼可见的、密集的、大小不等的肿瘤结节，伴有血性腹水。但是灌胃或者腹腔注射甘薯Sporamin蛋白后，肉眼即可见肿瘤结节数明显减少。

剥离、收集各组裸鼠腹腔内壁、内脏表面及肠系膜等上面的肿瘤结节并称重，可发现i.g.或者i.p.给予甘薯Sporamin蛋白后瘤体总重明显降低，从对照组的1.31±0.17g/只降低到i.g.组的0.76±0.10g/只(下降41.98％，P＜0.01)和i.p.组的0.57±0.12g/只(下降56.49％，P＜0.01)(图5-C)。

对照组5只裸鼠均出现血性腹水(0.17±0.04ml/只)，但i.g.给予甘薯Sporamin蛋白后腹水量减少为0.07±0.04ml/只；而i.p.组裸鼠未观察到出现腹水(图5-D)。

对照组裸鼠血清CEA水平为1.39±0.11ng/ml，i.g.组为1.40±0.10ng/ml，i.p.组为0.85±0.02ng/ml，与对照组相比显著下降38.85％(P＜0.05)(图5-E)。此外，给与甘薯Sporamin蛋白对裸鼠的体重并无显著影响(图5-F)。这些结果都说明甘薯Sporamin蛋白能抑制腹腔内移植瘤的生长，且与i.g.相比，i.p.的效果更明显。

实施例6甘薯Sporamin蛋白对Lewis肺癌细胞向肺部自发性转移的抑制作用。

该实施例通过Lewis肺癌细胞自发性肺转移动物模型，以后退皮下原发瘤重量及肺转移灶数量为主要指标，研究甘薯Sporamin蛋白在模型动物体内对Lewis肺癌细胞侵袭和转移能力的抑制作用。

1、试验材料

2试验方法

将18只雌性C57小黑鼠(5周龄，14±2g/只)随机分成对照组、i.g.和i.p.组，每组6只。无菌条件下取Lewis肺癌荷瘤鼠的瘤体，剪碎，加生理盐水(瘤重∶生理盐水＝1∶3)于匀浆器中匀浆，过80目筛，细胞计数，用生理盐水调细胞浓度为1×10⁶/ml，以0.1ml/只的量接种于C57小黑鼠右后腿根部皮下。从接种后第二天开始给予Sporamin蛋白生理盐水溶液(i.g.，3000mg/kg体重·天；i.p.，50mg/kg体重·天)，对照组以同体积生理盐水腹腔注射。治疗25天后断颈法处死小鼠，剥离腿部瘤体并称重、固定和切片；同时取肺脏用多聚甲醛固定后在体式显微镜(SZX16，日本Olympus公司)(×10)下计数肺表面转移灶数，并切片观察。

3、试验结果

结果见图6；其中，A为C57小黑鼠肺部自发性肿瘤转移灶的形成情况。体式显微镜(×10)下观察并拍照，左侧为肺正面，右侧为肺背面；B为C57小黑鼠肺表面Lewis肺癌细胞自发性转移灶的数量；C为C57小黑鼠后腿根部皮下移植瘤(原发灶)的重量；D为C57小黑鼠处死前的体重。

由结果可知，Sporamin蛋白抑制了Lewis肺癌细胞在C57小黑鼠体内自发性的肺转移，在C57小黑鼠后腿根部皮下接种Lewis肺癌细胞7天后，所有小鼠后腿根部均明显隆起，形成实体移植瘤(原发灶)。给予Sporamin蛋白生理盐水溶液25天后将小黑鼠处死并取肺脏并在体式显微镜(×10)下观察发现所有肺表面均出现明显囊状转移灶，正反面均可见(图6-A)。但与对照组转移灶数量(42.5±4.5个/只)相比，i.g.组(21.0±12.3g/只)和i.p.组(27.3±12.7个/只)均明显减少，分别较对照组减少50.59％和35.76％(P＜0.05)，且i.g.组效果更佳(图6-B)。

对照组部移植瘤(原发灶)的重量为8.2±1.3g/只，i.p.给药使其明显降低到6.1±1.4g/只，降低了25.61％(P＜0.05)；灌胃组为7.1±1.5g/只，虽然比对照组略轻，但并无显著性差异(P＞0.05)，说明i.g.给药不如i.p.给药对腿局部移植瘤(原发灶)的抑制作用强(图6-C)。

除此之外。与腹腔接种试验的结果类似，给与Sporamin蛋白25天后各组小黑鼠的体重并无显著性差异(图6-D，i.g.组和i.p.组的P值分别为0.53和0.57)，说明本实施了所用剂量的Sporamin蛋白对荷瘤小黑鼠的生长没有显著影响。

实施例7甘薯Sporamin蛋白在体外对人结肠癌SW480细胞增殖和侵袭能力的抑制作用。

本实施例通过在体外细胞培养体系中用不同浓度甘薯Sporamin蛋白处理人结肠癌SW480细胞，并于不同时间后观察细胞的增殖情况，及对人工基底膜的侵袭穿透情况，在体外研究甘薯Sporamin蛋白对恶性肿瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。

1、试验材料

本实施例所用甘薯Sporamin蛋白是按照实施例1的方法从收获约1周的“55-2”种甘薯(蛋白含量8g/100g干重)中提取得到的，纯度在99％以上；人结肠癌SW480细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(目录号：TCHu172)；胰蛋白酶、四氮甲基偶氮唑盐(MTT)、DMSO及台盼蓝购自Sigma公司；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程和材料研究所，插入式细胞培养小室(Isopore^TM聚碳酸酯膜)和

细胞侵袭试剂盒(ECM550)购自Millipore公司。高速离心机(上海兴亚净化材料厂)，微孔滤膜(孔径0.22μm，上海兴亚净化材料厂)，冷冻干燥机(LGJ-10型，北京四环科学仪器厂)，酶标仪(Multiscan MK3，芬兰Thermo)，倒置显微镜(XDS-1B，重庆麦克光电仪器有限公司)。

2、试验方法

用不同浓度的甘薯sporamin蛋白处理SW480细胞不同时间(24、48、72小时)后，采用血球计数法和MTT(四甲基氮唑盐)法测量细胞数量；采用插入式细胞培养小室观察sw480细胞侵袭破坏穿过ECMatrix^TM人工基底膜的能力及sporamin的作用。试验数据采用均数±标准差(Mean±SD)表示，用DPS7.55统计软件进行方差分析，以P＜0.05为具有显著性意义。

3、试验结果

结果见图7和图8。图7中，A为血球计数法测定的1mg/ml Sporamin蛋白对人结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用；B为MTT法测定的1mg/ml Sporamin蛋白对人结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用(以OD₄₉₂表示)；C为MTT法测定的不同浓度Sporamin蛋白处理48h后SW480细胞的活力，并以对照组的OD值为100％进行比较。n＝8，^*号表示与对照组相比P＜0.05，不同字母表示组间相比P＜0.05。

图8中，A为从插入式细胞培养小室的上室穿过聚碳酸酯膜(孔径8μm)迁移到膜下表面的SW480细胞。显微镜下(×200)拍照，图中空心透亮的点为聚碳酸酯膜上的小孔，深色污点为被染色的细胞。B为从插入式细胞培养小室的上室穿过聚碳酸酯膜迁移到膜下表面被染色的的SW480细胞数。显微镜下(×200)计数膜下表面被染色的细胞数，随机计数5个视野，每个标本重复计3次，试验重复2次，计算平均值。C为从ECM550侵袭检测试剂盒的插入式细胞培养小室的上室穿过人工基底膜(ECMatrix^TM)和聚碳酸酯膜(孔径8μm)迁移到膜下表面的SW480细胞。显微镜下(×200)拍照，图中空心透亮的点为聚碳酸酯膜上的小孔，深色污点为被染色的细胞。D为从ECM550侵袭检测试剂盒的插入式细胞培养小室的上室穿过人工基底膜(ECMatrix^TM)和聚碳酸酯膜(孔径8μm)迁移到膜下表面的SW480细胞数。显微镜下(×200)计数膜下表面被染色的细胞数，随机计数5个视野，每个标本重复计3次，试验重复2次，计算平均值。^*表示与对照组相比P＜0.05。

结果：Sporamin抑制了SW480细胞的增殖，血球计数法(hemacytometry)(图7-A)和MTT法(图7-B)的结果均显示：1mg/ml的Sporamin蛋白能明显抑制SW480细胞的增殖，处理时间越长，效果越明显。

图7-C显示，0.05mg/ml的Sporamin处理SW480细胞48h使细胞数降低为对照组的88.09％；0.1mg/ml的Sporamin使细胞数降为80.18％；0.25mg/ml的Sporamin使细胞数降为69.13％；0.5mg/ml的Sporamin使细胞数降为65.81％；1mg/ml的Sporamin使细胞数降为50.92％，2.5mg/ml的Sporamin使细胞量降为16.63％；均具有统计学显著性意义(P＜0.05)，说明Sporamin对SW480细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性。对试验数据进行线性回归，计算出其半抑制浓度(IC50)为0.97mg/ml。

图8显示Sporamin抑制了SW480细胞的迁移和对人工基底膜的侵袭能力。图8-A，8-B显示，与Sporamin共培养后，SW480细胞的迁移能力下降，穿过8μm聚碳酸酯膜的细胞数减少，0.2mg/ml的Sporamin即可显著抑制其迁移能力(P＜0.05)，且Sporamin浓度越高，抑制效果越明显，具有浓度依赖性。

图8-C，8-D显示，与Sporamin共培养后，SW480细胞对人工基底膜的侵袭能力下降，穿过ECMatrix^TM人工基底膜和8μm聚碳酸酯膜到膜下表面的细胞数减少，对照组穿过的细胞数为35±6个；0.02mg/ml的Sporamin即可显著抑制其迁移能力(P＜0.05)，使侵袭过人工基底膜的细胞数下降到26±6个；且Sporamin浓度越高，抑制效果越明显，当Sporamin浓度为0.2mg/ml和1mg/ml时，侵袭细胞数分别下降为20±5个和13±6个，具有浓度依赖性。

Claims

1.甘薯Sporamin蛋白在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或保健品。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为癌；所述癌为结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、鼻咽癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌，优选为结肠癌或肺癌。

4.甘薯Sporamin蛋白在制备真核生物癌细胞增殖抑制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为结肠癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞或直肠癌细胞；优选为结肠癌细胞或肺癌细胞。

6.根据权利要求1-5所述的应用，其特征在于：所述甘薯Sporamin蛋白是按照包括下述a)或b)步骤的方法制备得到的：

a)将甘薯切碎，置于缓冲溶液A中浸泡、打浆、浆液离心、取上清液，冰浴下向所述上清液中添加硫酸铵至50％至70％的饱和度、静置、离心、收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水或Tris-HCl缓冲溶液中，冷冻干燥，即得甘薯Sporamin蛋白；其中，所述缓冲液A由NaHSO₃和50-500mmol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液组成，所述缓冲液A中NaHSO₃的质量浓度为0.1％至5％，所述缓冲溶液A的pH值为7.0-8.0；所述甘薯与缓冲溶液A的配比为1kg∶(1-5)L；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述甘薯Sporamin蛋白是按照包括下述a)或b)步骤的方法制备得到的：

a)将甘薯切碎，置于缓冲溶液A中浸泡、打浆、浆液以3000g转速离心10min、取上清液，冰浴下向所述上清液中添加硫酸铵至60％的饱和度、静置、以3000g转速离心10min，收集沉淀，并将沉淀溶于蒸馏水或Tris-HCl缓冲溶液中，冷冻干燥，即得甘薯Sporamin蛋白；其中，所述缓冲液A由NaHSO₃和50mmol·L^-1Tris-HCl缓冲溶液组成，所述缓冲液A中NaHSO₃的质量浓度为0.1％，所述缓冲溶液A的pH值为7.5；所述甘薯与缓冲溶液A的配比为1kg∶1L；

b)将甘薯切碎，置于亚硫酸氢钠冰水溶液中，然后将薯块打成浆状，过滤，将滤液以3000g室温离心30min，收集上清液并用盐酸调pH至4，再次以3000g室温离心30min，收集沉淀；将所述沉淀用10倍体积的质量浓度为5％的氯化钠溶液稀释后，用氢氧化钠调pH至中性，经过截留分子量为8000以上的透析膜透析后冷冻干燥，即得甘薯Sporamin蛋白。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述方法还包括对所述步骤a)或步骤b)得到的甘薯Sporamin蛋白进行纯化的步骤：

2)将步骤1)制备的初步纯化的sporamin蛋白用超滤杯浓缩后，用SephadexG-75凝胶层析柱进一步纯化；用缓冲溶液C进行洗脱，流速为0.10-0.50ml·min^-1，收集洗脱液中280nm波长的吸光度曲线上的第一吸收峰的组分，冷冻干燥，即得到纯化的sporamin蛋白；所述缓冲溶液C的pH值为7.5，其由EDTA、NaCl和50mmol·L^-1Tris-HCl组成，其中EDTA浓度为1mmol·L^-1，NaCl浓度为0.1mol·L^-1。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述方法还包括对所述步骤a)或步骤b)得到的甘薯Sporamin蛋白进行纯化的步骤：

1)将甘薯Sporamin蛋白加水溶解，离心收集上清液，所述上清液经0.22um微孔滤膜过滤后，上规格为1.5cm×30cm的DEAE-52离子交换层析柱；用缓冲溶液B进行洗脱，流速为0.3ml·min^-1，收集洗脱液每管3ml，绘制洗脱液在280nm波长的吸光度曲线，收集吸光度曲线上的第二吸收峰组分即第35至40管洗脱液，得到初步纯化的sporamin蛋白；所述缓冲溶液B的pH值为7.5，其由EDTA、NaCl和50mmol·L^-1Tris-HCl组成，其中EDTA浓度为1mmol·L^-1，NaCl浓度为0.2mol·L^-1；

2)将步骤1)制备的初步纯化的sporamin蛋白用超滤杯浓缩后，用规格5cm×100cm的Sephadex G-75凝胶层析柱进一步纯化；用缓冲溶液C进行洗脱，流速为0.45ml·min^-1，收集洗脱液每管5ml，绘制洗脱液在280nm波长的吸光度曲线，收集吸光度曲线上的第一吸收峰组分即第31至54管洗脱液，冷冻干燥，即得到纯化的sporamin蛋白；所述缓冲溶液C的pH值为7.5，其由EDTA、NaCl和50mmol·L^-1Tris-HCl组成，其中EDTA浓度为1mmol·L^-1，NaCl浓度为0.1mol·L^-1。