CN101195033A - 一种胰蛋白酶抑制剂的灭菌方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胰蛋白酶抑制剂制品的灭菌方法。该方法是将胰蛋白酶抑制剂置于200－800MPa条件下进行灭菌。其中，灭菌压力优选为200－600MPa，更优选为600MPa，灭菌温度为25－50℃，灭菌时间为5－60分钟，优选20－60分钟。本发明提供的灭菌方法，不仅可以保持样品溶液中胰蛋白酶抑制剂的活性不发生显著性变化，而且能够起到很好的灭菌作用，使样品溶液中的微生物含量符合保健食品通用卫生要求，其中的菌落总数，大肠菌群、霉菌和酵母菌的检测结果均达到卫生要求，且无致病菌检出。该方法在食品加工领域具有广阔的应用前景，具有很高的经济价值。

Description

一种胰蛋白酶抑制剂的灭菌方法

技术领域

本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂制品的灭菌方法，特别是一种利用超高压灭菌的方法。

背景技术

胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)普遍存在于动物、植物及微生物体内，如抑肽酶(aprotinin)、人尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsin inhibitor，UTI)、大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor，SBTI)、南瓜胰蛋白酶抑制剂(Cucurbitamaxima trypsin inhibitor，CMTI)等。

目前多数已开发的TI来源于人和动物，如人尿胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶等，但由于其分子量较大，结构复杂，难以对其提取分离、研究合成并进一步开发；且在发挥治疗作用的同时存在诸多缺点，如易受到病原微生物如病毒等的污染，且可引起过敏反应等。为了克服动物来源TI的缺点，人们将目光转向了品种繁多的植物，并已从多种植物组织中发现并提取了各类TI。植物来源的TI具有分子量较小、在自然界的含量丰富、活性明确的优点。研究证明，这些TI对胰蛋白酶、血浆激肽释放酶、凝血酶、血纤维溶解酶、凝血因子Xa、凝血因子XIIa等都具有较强的抑制作用(Otlewski J，Jaskolski M，Buczek O，et al，Structure-function relation-ship of serineprotease-proteininhibitor interaction，Acta Biochim Pol，2001，48(2)：419-28)。

Sporamin就是一种胰蛋白酶抑制剂(Y.H.Lin.Trypsin inhibitors of sweet potato：reviewand prospect，in：Y.I.Hsing，C.H.Chou(Eds)，Recent Advances in Botany，Academia SinicaMonograph Series No.13，Taipei，1993：179-185)，是甘薯特有的一种储藏性蛋白质，占块根可溶性蛋白质的60％-80％(Maeshima.M.；Sasaki，T.；Asahi，T.Characterization of majorproteins in sweet potato tuberous roots，Phytochemistry，1985，24：1 899-1902)。与Sporamin具有同源性的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制剂，具有抗肿瘤的功效。此外，Sporamin还具有在抗虫性(K.-W.Yeh，M.-I.Lin，S.-J.Tuan.Sweet potato(Ipomoea batatas)trypsin inhibitorexpressed in transgenic tobacco plants confer resistance against Spodoptera litura，Plant CellReports，1997，16：696-699)，以及抗氧化活性(Wen-Chi Hou.et al.Glutathione peroxidase-likeactivity of 33 kDa trypsin inhibitor from roots of sweet potato(Ipomoea batatas L. Lam‘Tainong57’).Plant Science，2004，166：1541-1546；Wen-Chi Hou，Yaw-Huei Lin.Polyamine-bound trypsininhibitors in sweet potato storage roots，sprouted roots and sprouts.Plant Science.1997.126：11-19)，且Sporamin的分子量比人血清中广泛存在的间α胰蛋白酶抑制剂(分子量45000-55000，正常人血清中含量约为0.4g/L)小，因此，Sporamin作为一种新型的抑制肿瘤转移的药品或保健食品，在未来医疗及保健食品领域中具有良好的应用前景。

尽管甘薯中的胰蛋白酶抑制剂在70℃下具有活性稳定性，但在130℃条件下保持30min即可完全破坏TI的活性(Chein，S.L. and P.K.Lee.The effect ofphysical treatment onthe available lysine and trypsin inhibitor of sweet potato.Taiwan Livestock，1980，13：75-84)。因此，若采用高温灭菌的方法，会使胰蛋白酶抑制剂制品的活性被钝化；而采用膜滤除菌技术则存在着设备昂贵、处理量小和膜不易于清洗等问题。为此，亟待开发出一种既能有效地抑制制品微生物指标，又能有效地保持其活性的灭菌新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰蛋白酶抑制剂的灭菌方法。

本发明提供的方法是将胰蛋白酶抑制剂置于200-800MPa条件下进行灭菌。

上述灭菌方法中，灭菌压力优选为200-600MPa，更优选为600MPa。

本发明提供的灭菌方法对温度没有限制，常温下即可操作，在25-50℃下进行灭菌即可达到本发明的目的，该灭菌温度优选25℃。该灭菌方法中，瞬时灭菌即可达到灭菌效果，但将灭菌时间控制在1个小时以内可达到更好的灭菌效果，且不会引起胰蛋白酶抑制剂失活。该灭菌时间优选5-60分钟，更优选为20-60分钟。

在实际灭菌处理过程中，一般可将上述胰蛋白酶抑制剂用pH值为6.0-8.0的缓冲液配制成浓度为10-100mg/ml的溶液。该缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。

本方法适用于各种具有胰蛋白酶抑制剂活性的动植物制品，比较常用的有甘薯蛋白Sporamin胰蛋白酶抑制剂制品、大豆胰蛋白酶抑制剂制品等。

本发明提供的灭菌方法，不仅可以保持样品溶液中胰蛋白酶抑制剂的活性不发生显著性变化，而且能够起到很好的灭菌作用，使样品溶液中的微生物含量符合保健食品通用卫生要求(1996年7月18日卫生部文件卫监发[1996]第38号发布)，即菌落总数(cfu/g.mL)≤1000、大肠菌MPN(100g.mL)≤40、霉菌(cfu/g.mL)≤10、酵母(cfu/g.mL)≤10、无致病菌。该方法还具有工艺简便、生产成本较低、处理量大的优点。

附图说明

图1为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图2为加压(600MPa，25℃，20min)与未加压处理条件下浓度对Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性的影响。

图3为灭菌压强对胰蛋白酶抑制剂活性的影响；加压条件：200-600MPa，20min，25℃，溶液浓度：0.6mg/ml；0.1MPa表示未加压状态。

图4为灭菌时间对胰蛋白酶抑制剂活性的影响；加压条件：600MPa，25℃，溶液浓度：0.6mg/ml。

图5为加热温度对胰蛋白酶抑制剂活性的影响；加热条件：70-100℃，20min，溶液浓度：0.6mg/ml；0表示未加热状态。

具体实施方式

本发明灭菌方法是将胰蛋白酶抑制剂在高压下进行灭菌，即能达到良好的灭菌效果，并能够很好地保持其活性。整个灭菌过程，只需将所处理样品放入介质中，在一定的压力下保持一段时间，就能产生与加热处理一样使酶、蛋白质、淀粉等生物高分子物质失活、变性及糊化，同时杀死微生物。由于高压处理仅会引发生物高分子中氢键之类弱结合键的变化，不会破坏其中的共价键。因而与其他方法相比，能达到很好的灭菌效果，并能保持样品的生物活性。

下面结合具体实施例对本发明所提供的灭菌方法作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。

以甘薯胰蛋白酶抑制剂Sporamin为例，在利用本发明提供的高压灭菌方法对其进行处理之前，需要将其从甘薯中进行分离纯化，其具体方法如下：

1、制备甘薯粗蛋白

将甘薯洗净、去皮、切成条，再将其与含有0.1M NaCl的0.05M Tris-HCl(pH值为7.5)缓冲液以1.5∶1(v/g)比例混合，均质后，以3,000g速度离心(LXJ-IIB低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂)30min，离心两次，取其上清液，在冰浴条件下一边搅拌一边加入固体(NH₄)₂SO₄至60％的饱和度，静置至少1h后，在10,000g(TGL-16M型低温高速离心机，湘仪仪器厂)条件下离心30min，得到的沉淀即为甘薯粗蛋白。

2、制备甘薯胰蛋白酶抑制剂Sporamin

将甘薯粗蛋白用一定量含有0.1M NaCl、1mM EDTA的0.05M pH值为7.5的Tris-HCL缓冲液溶解后，透析过夜，然后在10,000g条件下离心30min，再用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液用DEAE-纤维素(DEAE-52，2.6×20cm)离子交换柱和SephadexG-75凝胶柱纯化，制备Sporamin。

DEAE-52柱先用含有0.1M NaCl和1mM EDTA的0.05M pH值为7.5的Tris-HCL缓冲液平衡3个柱体积，上样后先用平衡液洗脱，在280nm波长紫外检测仪(HD-3，上海沪西分析仪器厂)下检测，待有蛋白检出后，将NaCl的浓度增加至0.2mM，并用电脑全自动部分收集器(DBS-100，上海沪西分析仪器厂)收集，用电泳(AE-6450，日本ATTO公司)检测各部分的蛋白情况，合并含有Sporamin的洗脱峰。取一定量该溶液再上样到凝胶过滤层析(SephadexG-75，25mm×600mm)柱中，上样前用含有0.1M NaCl和1mM EDTA的0.05M pH值为7.5的Tris-HCL缓冲液平衡3个柱体积，洗脱溶液与平衡溶液相同，收集洗脱液，并用电泳分析各部分吸收峰的蛋白构成情况，合并含有Sporamin的洗脱液，置于-40℃冰箱(BD-255LTA，青岛海尔特种电冰柜有限公司)中保存备用。

其中，对胰蛋白酶抑制剂活性染色的方法如下：

对纯化后的Sporamin胰蛋白酶抑制剂进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳(AE-6450，日本ATTO公司)完成后，胶片浸于0.1M pH值为7.5的磷酸缓冲液中震荡1h。然后将胶片在37℃下浸于胰蛋白酶溶液中1h(8mg胰蛋白酶/100ml磷酸缓冲液，0.1M、pH值为7.5)。用去离子水漂洗后胶片浸入新配的160ml底层染液中37℃在黑暗中静置30min。(底层染液：40mg APNE溶于16ml二甲基甲酰胺中，加入含有80mg固兰B盐的144ml 0.1M磷酸缓冲液至160ml)。染色后用蒸馏水漂洗胶片。

该电泳结果如图1所示，其中，图1a为考马斯亮兰染色，图1b为胰蛋白酶抑制剂活性染色；其中“1”为β-乳球蛋白，“2”为大豆胰蛋白酶抑制剂，“3”为Sporamin，“4”为加热处理的Sporamin(100℃；20min)，“5”为加压处理的Sporamin(600MPa；20min)，“6”为甘薯粗蛋白粉。由图1可知，与甘薯中的其他蛋白相比，Sporamin具有的胰蛋白酶抑制剂活性较强。

本发明中对胰蛋白酶抑制剂活性进行测定的方法如下：

a、标样分析

在装有1.0ml含有1％酪蛋白(35℃，5min)、pH值为7.6的磷酸缓冲液的试管中加入0.5ml双蒸水，1.0ml胰蛋白酶溶液；其中，该胰蛋白酶溶液是将8mg胰蛋白酶溶解在100ml 0.25mM HCl中得到的。在37℃条件下水解反应20min，然后加入3.0ml10％的TCA终止反应，离心后，取上清液于25℃条件下放置至少1小时，用紫外分光光度计(U-3010紫外分光光度计，日本HITACHI)在280nm波长下测定其吸光值。

b、对照分析

将0.3ml胰蛋白酶抑制剂和0.2ml双蒸水、1.0ml1％的酪蛋白在37℃保温15min，然后再加入1.0ml双蒸水，混匀后再在37℃条件下水解反应20min，终止反应和检测分析方法同标样分析。

c、样品分析

将0.3ml胰蛋白酶抑制剂和0.2ml双蒸水、1.0ml 1％的酪蛋白在37℃保温15min，然后再加入1.0ml胰蛋白酶溶液，水解反应按照标样分析的方法进行。

胰蛋白酶的抑制活性可用抑制百分率来表示，其计算公式如下：

抑制百分率＝(A280标样+A280对照-A280样品)/A280标样×100％。

本发明实施例中所用超高压设备的型号为UHPF/320ml/0-800MPa，由包头科发新型高技术食品机械有限责任公司制造。

实施例1、胰蛋白酶抑制剂的加压灭菌及其微生物检测

将几种不同的蛋白粉配成50mg/ml的溶液后，在1000×g，5℃下离心30min，取上清液分成两份，一份用于测定胰蛋白酶活性和微生物指标。另一份在600MPa、25℃条件下，加压60min后，测定胰蛋白酶抑制剂活性和微生物指标。其中，菌落总数参照GB/T 4789.2-2003检测方法进行；大肠菌群的总数参照GB/T 4789.3-2003检测方法进行；霉菌和酵母菌参照GB/T 4789.1 5-2003检测方法进行。检测结果如表1所示。

表1中，甘薯粗蛋白为按上述方法制备的甘薯粗蛋白，其中蛋白含量约70％、水分含量约6％、灰分约3％、粗纤维4％。大豆分离蛋白粉购自郑州金海博源食品有限公司，其中蛋白含量约84％、水分含量约7％、灰分约6％、粗纤维约5％。

表1、加压与未加压处理的胰蛋白酶抑制剂的活性和微生物检验结果

	胰蛋白酶抑制剂活性	菌落总数	大肠菌群	霉菌和酵母菌
					未加压甘薯粗蛋白溶液	96.45％±3.46	2.29×105	＜30	＜10
加压甘薯粗蛋白溶液	94.63％±3.13	＜10	＜30	＜10
					未加压大豆分离蛋白溶液	87.4 1％±0.72	2.2×104	＜30	＜10
加压大豆分离蛋白溶液	86.39％±0.67	＜30	＜30	＜10
					卫生标准GB 16740-1997		1.0×104	＜30	＜10

已有的研究表明，甘薯可溶性蛋白就是一种胰蛋白酶抑制剂并具有抑制剂活性，而甘薯粗蛋白中大部分是由可溶性蛋白所构成，因此，甘薯粗蛋白溶液也具有胰蛋白酶抑制剂活性。此外，大豆蛋白酶抑制剂是一类小分子量的蛋白质或多肽构成，研究表明，占大豆分离蛋白约15％的2S成分由Bowman-Birk型和Kunitz型胰蛋白酶抑制剂构成，并具有胰蛋白酶抑制剂活性。由表1可知，加压处理不仅能极显著降低样品中的菌落总数，使其微生物的含量符合国家保健(功能)食品通用标准GB 16740-1997，而且能够保持胰蛋白酶抑制剂活性不发生显著性的变化。并且，这种处理方法不仅对于纯度高的胰蛋白酶抑制剂适用，同样也适用于一些纯度较低的胰蛋白酶抑制剂制品。由此可见，加压处理是一种保持胰蛋白酶抑制剂活性的、安全有效的灭菌方法。

实施例2、灭菌过程中胰蛋白酶抑制剂浓度对其活性的影响

将纯化后的甘薯蛋白Sporamin分别稀释为3、2、1、0.6、0.3、0.2、0.15、0.1mg/ml不同浓度的溶液，在600MPa、25℃的条件下保持20min，测定Sporamin胰蛋白酶剂的活性。

图2即为Sporamin的浓度与胰蛋白酶抑制百分率的关系图。由该图可知，Sporamin浓度不同，其对胰蛋白酶抑制剂活性的影响程度也有差异。在0.1mg/ml时，Sporamin对于胰蛋白酶(80μg/ml)的抑制率可以达到50％；Sporamin浓度在0.1-0.3mg/ml之间时，提高Sporamin的浓度，其对胰蛋白酶的抑制率明显增加；在0.6mg/ml时其抑制率可达到90％。但在0.6-3mg/ml浓度之间时，Sporamin对于胰蛋白酶的抑制率变化不明显。

采用与Sporamin完全相同的实验条件，测定大豆胰蛋白酶抑制剂的活性，其变化趋势与Sporamin相同。

实施例3、灭菌压强对胰蛋白酶抑制剂活性的影响

在温度为25℃的条件下，分别在200MPa、300MPa、400MPa、500MPa和600MPa压力下，对浓度为0.6mg/ml的甘薯蛋白Sporamin胰蛋白酶抑制剂溶液加压20min，测定不同压强对该胰蛋白酶抑制活性的影响。

采用与Sporamin完全相同的实验条件，测定大豆胰蛋白酶抑制剂的活性。

图3即为不同压强对甘薯蛋白Sporamin和大豆蛋白胰蛋白酶抑制剂活性影响的关系图。由图3可知，在200～600MPa的压力条件下加压20min，对Sporamin和大豆的胰蛋白酶抑制剂活性没有显著性影响。

实施例4、灭菌时间对胰蛋白酶抑制剂活性的影响

在600MPa下，分别对浓度为0.6mg/ml的Sporamin胰蛋白酶抑制剂溶液加压20min、30min、40min、50min、60min，测定该加压灭菌时间对Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性的影响。

采用与Sporamin完全相同的实验条件，测定大豆胰蛋白酶抑制剂的活性。

图4即为灭菌时间对Sporamin和大豆蛋白胰蛋白酶抑制剂活性影响的关系图。由图4可知，在600MPa的压力条件下，连续灭菌20min、40min和60min，同不加压的样品相比，Sporamin和大豆胰蛋白酶抑制剂的活性也均没有显著性变化。由此可推断，600MPa的压力仍没有达到导致胰蛋白酶抑制剂变性的临界压力，在此压力范围内，提高加压强度或延长加压灭菌时间不会改变胰蛋白酶抑制剂活性。

对比例1、加热温度对胰蛋白酶抑制剂活性的影响

分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下对浓度为0.6mg/ml的Sporamin溶液加热20min，测定加热温度对胰蛋白酶抑制剂活性的影响。

采用与Sporamin完全相同的实验条件，测定大豆胰蛋白酶抑制剂的活性。

图5即为不同加热温度对Sporamin和大豆蛋白胰蛋白酶抑制剂活性影响的关系图。由图5可知，加热温度对胰蛋白酶抑制剂活性的影响较大。与不加热的样品相比，在70℃的条件下灭菌20min，Sporamin和大豆胰蛋白酶抑制剂活性没有发生显著性变化；但在80℃的条件下灭菌20min，二者胰蛋白酶抑制剂的活性均极显著下降；并且随着温度的升高，胰蛋白酶抑制剂活性呈继续下降的趋势。说明，温度过高会造成甘薯蛋白Sporamin和大豆胰蛋白酶抑制剂活性的钝化。

Claims (10)

1.一种胰蛋白酶抑制剂的灭菌方法，是将所述胰蛋白酶抑制剂置于200-800MPa条件下进行灭菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭菌压力为200-600MPa。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述灭菌压力为600MPa。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述灭菌温度为25-50℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述灭菌温度为25℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭菌时间为1个小时之内。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述灭菌时间为5-60分钟。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述灭菌时间为20-60分钟。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在灭菌过程中，可先将所述胰蛋白酶抑制剂用pH值为6.0-8.0的缓冲液配制成浓度为10-100mg/ml的溶液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。

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