CN110438027A - 产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株gutu06及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法。本发明已从传统发酵的豆豉中筛选出的天然的产纳豆激酶、蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、淀粉酶等多酶新菌株，利用该菌株来发酵黄豆制备纳豆，制备获得的纳豆具有预防心脑血管疾病、助消化和转化银杏黄酮苷等功能；同时提供了一种新的同时生产纳豆激酶、蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、淀粉酶的培养方法，且安全性高；由于黄豆来源广泛，价格适中，降低纳豆激酶、蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、淀粉酶的生产成本；另外提供了一种从豆豉中提取纳豆激酶的简单纯化方法。因此该解淀粉芽孢杆菌具有很好的应用前景。

Description

产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法。

背景技术

纳豆是一种传统的发酵豆制食品，通过用枯草芽孢杆菌发酵大豆而制备，具有独特的风味和粘性。在纳豆发酵和后熟过程中，产生了如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、糖化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶等多种酶类，这些酶类的存在和作用显著地影响着纳豆的风味和品质。其中，在蛋白酶的作用下，大豆蛋白被降解为较小的氮化合物，例如肽、氨基酸、胺和氨类物质，不仅增强其营养性，使人体更易吸收，同时这些小分子化合物含量的增加使其风味更突出。同时，淀粉酶水解大豆中的淀粉生成糊精、麦芽糖，最终生成葡萄糖，葡萄糖经发酵,又可产生多种低分子物质，如乙醇、乙醛、乙酸、乳酸等，这些物质既是形成纳豆风味的组分，又可与其他物质作用生成色素及酷类等香气成分。β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶类，它能够参与生物体的糖代谢，在纳豆发酵中，不利于人体的消化吸收的大豆异黄酮经β-葡萄糖苷酶催化水解可转化成为高活性的大豆异异黄酮苷元，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。在微生物及各种酶类的相互作用下，大豆成分被分解产生各类活性物质，使纳豆成为具有多种生理活性的功能性保健食品。

纳豆激酶-纳豆中最重要的一种活性物质，是一种丝氨酸蛋白酶。据报道，纳豆激酶已经被证明是体外和体内有效的血栓溶解酶。作为一种天然发酵产物，与临床使用的溶栓药物相比，纳豆激酶在治疗各种血栓血管疾病方面具有更优越的有效性和安全性，在胃肠道中足够稳定使得该酶成为口服溶栓治疗的有用药剂，此外，它还有治疗高血压，阿尔茨海默病和玻璃体视网膜疾病的巨大潜力。纳豆激酶是微生物代谢产物，只要生产菌株活性稳定，工艺成熟即可实现大规模生产，且具有发酵纳豆激酶的原料来源广、生产周期短、产量高、价格低廉和易于提取等优势，使其开发前景广阔。而固态发酵与液体发酵相比，成本低、酶活力高、酶系丰富、设备操作简单、易于企业扩大化生产且产率高，因此，国内外食品发酵工业化生产普遍采用这种工艺。发酵后的产品不仅可用作食品直接食用，还可以通过进一步的分离纯化，制成不同类型和纯度的纳豆激酶胶囊。

由于纳豆激酶来源于食品级微生物及其奇特功能，国内外很多学者对纳豆和含纳豆激酶的保健食品进行了深入开发。但是，因为发酵菌株及发酵工艺的问题，纳豆具有的不愉快气味及口感使得世界范围上多数人们难以接受。目前，许多研究人员将突破点放在对纳豆激酶菌株的分离筛选上，志在筛选出具有高效溶栓效果、发酵纳豆感官性能良好且功能性丰富的优秀纳豆发酵菌株，以期为预防心脑血管疾病保健品及纳豆激酶的工业化生产做出贡献。

此外，由于纳豆激酶是胞外酶，其生产都来自于微生物的发酵，因而粗酶液含有较多杂质、纳豆激酶纯度低而不能大规模生产应用，所以将纳豆激酶从粗酶液中分离提纯得到纯度较高的酶制剂就显得十分关键。目前常用来纯化纳豆激酶的方法有盐析、超滤、层析过滤或凝胶过滤，这些方法大都存在着方法繁琐、回收率低、不利于保持酶活力和无法大规模生产等问题。而采用新型的纯化方法，如膜分离法、免疫纯化、反胶束萃取、高效液相色谱和双水相萃取的方法较少。其中，反胶束萃取在分离和提纯上具有很多优点，如提取生物分子时选择性高并且它不影响生物分子活性、而且具有体系黏度低、反萃过程中分相的时间短、连续生产相对容易、节约成本(如表面活性物质可以循环再利用)等。反胶束萃取技术一般包括前萃取和反萃取(也有研究者称为后萃)两个过程，它的主要原理是液-液萃取。国内鲜有将反胶束萃取运用在纤溶酶纯化上，只有刘俊果等采用AOT/异辛烷作为反胶团萃取体系，从发酵液萃取纯化纳豆激酶，酶活力回收率达到80％，纯化因子约为2.5左右。但是，单一的方式提纯的纳豆激酶纯度有限，纳豆激酶中仍然存在其他杂质，而科学研究中及生产使用中对纳豆激酶的纯度有所要求。此外，国内目前没有将反胶束萃取与其他酶纯化技术结合来纯化纳豆激酶的报道，因此，找出一套合适的纳豆激酶纯化技术尤为重要。

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，是一类来源广泛的水解酶类。其特性是可水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶可由酵母，曲霉、木霉、细菌等产生。根据国内外的报道，该酶可广泛用于黄酮类物质的生物转化。

微生物发酵产酶是生物酶来源的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵产酶能够水解银杏黄酮苷成银杏黄酮苷元，使苷元活性明显高于银杏黄酮苷。银杏黄酮是目前已发现的最好的防治心脑血管疾病的药物，当前银杏黄酮主要是从银杏叶中提取的，不过从银杏叶中提前的银杏黄酮主要是以银杏黄酮苷的形式存在，而而银杏黄酮苷的生物活性要显著小于银杏黄酮苷元，由于酶法环境友好选择性高，因此有必要利用β-葡萄糖苷酶把银杏黄酮苷转化为苷元。

蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。在食品工业中应用广泛。此外蛋白酶也有助于人体消化可把人体摄入的蛋白质被水解成小分子肽和氨基酸。因此蛋白酶开发生产具有重要意义。

淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α

-1,4-糖苷键的酶。淀粉酶是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶也可有助于人体消化。

目前对产纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和淀粉酶的微生物有较多报道，但同时产这几种酶的单菌用来开发纳豆食品还未见报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法，。

本发明是这样实现的：产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06，其微生物学分类命名为解淀粉芽孢杆菌GUTU 06，拉丁文学名Bacillus amyloliquefaciens.GUTU 06，保藏编号为CCTCC M 2019234。

解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06的筛选方法，包括如下步骤：

1)利用酪蛋白培养基分离豆豉中的产蛋白酶的芽孢杆菌；

2)将步骤1)分离获得的芽孢杆菌进行黄豆固体发酵制备豆豉，对发酵结果进行感官鉴评，选出感官鉴评良好的菌株；

3)将步骤2)中选出的菌株划线接种到酪蛋白平板培养基上，在37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后，得到发酵种子液；按质量百分比4％的接种量接种到黄豆固态培养基中，37℃下发酵24h；将培养完成的纳豆按照质量比为1:9加入水中均质后，在4℃浸提24h后，于4℃、12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液；

然后通过外分光光度法检测纳豆激酶活力，福林法检测其蛋白酶活力，DNS法检测其淀粉酶活力，DNS法检测β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活力，选出蛋白酶、纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶的综合指数最高、且发酵纳豆感官性能良好的菌株，即为解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06。

步骤1)中所述的酪蛋白培养基的组成为：3-10g/L酪素，1-5g/L葡萄糖，0.5-1.5g/L酵母膏，1-5g/L K2HPO4，0.5-2.5g/L KH2PO4，0.1-0.5g/L MgSO4，pH 7.0～7.2。

步骤2)中所述的制备豆豉所用的培养基的制备方法是，将黄豆洗净后，将洗净的黄豆与水按照1:3-5单位g/mL的料液比进行常温浸泡，浸泡10-12h后，沥干黄豆表面的水分，于121℃灭菌20min，获得所需发酵制备豆豉的培养基。

对获得的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06再进行形态学分析、生理生化测定及16SrRNA序列分析，确定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06产生的纳豆激酶的纯化方法，包括如下步骤：

1)初酶液制备

将解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06划线接种到酪蛋白平板培养基上37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后既得发酵种子液；挑选颗粒饱满、无畸形、色泽淡黄的市售有机黄豆，用去离子水冲洗，直至无杂物，将黄豆按照量比1∶4加入水中浸泡18h后，沥干水；将湿豆在0.1MPa下蒸汽灭菌蒸煮15-30min，然后在无菌条件下自然冷却至室温；将发酵种子液按质量百分比4％的接种量接种到冷却好的黄豆上，37℃培养36h，每12h摇晃一次，培养获得纳豆；将培养完成的纳豆与水按照1:9的料液比单位g/ml均质后，在4℃下提取24h，后于4℃、12000r/min离心10min，获得粗酶液；

2)丙酮沉淀纳豆激酶

在冰浴和磁力搅拌下，将5倍体积的丙酮缓慢注入粗酶液中，在0℃下沉淀6h，获得含纳豆激酶的蛋白沉淀；

3)前萃取纳豆激酶

将丙酮沉淀的纳豆激酶沉淀溶于水相中，得到含纳豆激酶的水相，将水相与有机相等体积混合，萃取离心后，得到含有纳豆激酶的有机相；

4)反胶束反萃取纳豆激酶

将前萃取得到的含有纳豆激酶的有机相与反萃水相等体积混合，进行反应萃取，使纳豆激酶从有机相转移到反萃水相；

5)纯化后纳豆激酶的浓缩及脱盐

将反胶束萃取完成后的酶液用丙酮沉淀两次，收集得到纳豆激酶沉淀，将纳豆激酶沉淀加入TEAB中，冰浴超声后离心，弃上清得到浓缩脱盐后的纳豆激酶纯酶。

本发明的解淀粉芽孢杆菌GUTU06(Bacillus amyloliquefaciens.GUTU06)已于2019年4月4日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019234，地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)。

本发明公开了一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法。本发明已从传统发酵的豆豉中筛选出的天然的产纳豆激酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶等多酶新菌株，利用该菌株来发酵黄豆制备纳豆，制备获得的纳豆具有预防心脑血管疾病、助消化和转化银杏黄酮苷等功能；同时提供了一种新的同时生产纳豆激酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶的培养方法，且安全性高；由于黄豆来源广泛，价格适中，降低纳豆激酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶的生产成本；另外提供了一种从豆豉中提取纳豆激酶的简单纯化方法。因此该解淀粉芽孢杆菌具有很好的应用前景。

附图说明

图1为L-酪氨酸标准曲线；

图2为麦芽糖标准曲线；

图3为葡萄糖标准曲线；

图4为系统发育树；

图5为蛋白质标准曲线

图6 SDS-PAGE图。

具体实施方式

实施例1：一种解淀粉芽孢杆菌GUTU06，其筛选过程如下：

(1)初筛

从贵州各地采集20余种豆豉样品，各取2g置于100mL的已灭菌的具塞三角瓶中，加无菌生理盐水稀释10倍，振荡30s后，于37℃，180r/min的条件下培养24h。将菌悬液适度稀释，涂布于酪蛋白平板上，37℃倒置培养24h，挑取水解圈与菌落直径比值大的菌落进行革兰氏染色及镜检，并接种到LB平板上进行划线分离纯化，将获得的单一菌株接种到LB斜面培养上，37℃培养24h，于4℃冰箱保存备用。经初筛培养基初筛，筛选出360株疑是产蛋白酶酶酶活较高的菌株。

酪蛋白培养基：5g/L酪蛋白，1g/L葡萄糖，1g/L酵母膏，1g/L K2HPO4，0.5g/LKH2PO4，0.1g/L MgSO4，20g/L琼脂，pH 7.0～7.5，121℃，0.1MPa湿热灭菌20min。

LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g酵母提取物5g NaCl 10g，121℃，0.1MPa湿热灭菌20min。

(2)一次复筛

通过黄豆固体发酵复筛和感官评价的分析，筛选出96株感官良好的菌株。

制备豆豉所用的培养基的制备方法是，将黄豆洗净后，将洗净的黄豆与水按照1:3-5单位g/mL的料液比进行常温浸泡，浸泡10-12h后，沥干黄豆表面的水分，于121℃灭菌20min，获得所需发酵制备豆豉的培养基。

豆豉感官评分标准见表1。菌株GUTU06的感官评分为4.5分。

表1发酵产品的感官评分标准

(3)二次复筛

1)一次复筛的96株芽孢杆菌固态发酵制备纳豆及粗酶提取液

液体种子培养基：10g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，10g/L牛肉膏，5g/L NaCl，pH7.0～7.5，121℃，0.1MPa湿热灭菌20min。

将所述芽孢杆菌菌株划线接种到酪蛋白平板培养基上37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后既得发酵种子液。挑选颗粒饱满、无畸形、色泽淡黄的市售有机黄豆，用去离子水冲洗，直至无杂物，豆水质量比1∶4浸泡18h后，沥干水。称取50g湿豆分装入三角瓶，混合均匀，放在高压蒸汽灭菌锅中蒸煮20min，随即放入超净工作台内冷却至室温。然后将活化后的种子液按4％的接种量接种到冷却好的固态发酵培养(黄豆)上，37℃培养36h，每12h摇晃一次。将培养完成的纳豆以豆水比1:9单位g/ml均质后，4℃提取24h，后于4℃、12 000r/min离心10min，即得粗酶液。

2)紫外分光光度法测定纳豆激酶酶活力

向试管中加入1.4mL Tris-HCl(50mmol/L，pH 7.8)缓冲液0.4mL纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL)，37℃温育5min后加入0.1mL凝血酶(20U/mL)，再37℃温育10min形成人工血栓，加入0.1mL的粗酶液，37℃温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2moL/L)溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm波长处测定吸光度。酶活定义：每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力。粗酶液中纳豆激酶酶活力为14.9FU/mL，所测GUTU06纳豆的纳豆激酶酶活力为149.7±1.55FU/g。

3)福林法测定蛋白酶活力

L-酪氨酸标准曲线的制作：在试管中分别加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、90ml的L-酪氨酸标准溶液(100μg/ml)，补水至10ml，再加入0.4mol/L的碳酸钠溶液5mL，福林溶液(一份福林试剂溶于两份水)1mL，震荡均匀，于40℃水浴显色20min，取出后于波长680nm测定吸光度值。以酪氨酸浓度(x，μg/ml)为横坐标，吸光度值(y，A₆₈₀)为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为：y＝0.0101x+0.0184，R²＝0.9992。(如附图1所示)

样品测定：将待测酶液与含有1％酪蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 7)等体积混合并在40℃下孵育10分钟，加入2mL 0.4mol/L三氯乙酸，取出静置10min以终止反应，然后，10000r/min离心10min，取1ml上清液加入5mL 0.4mol/L碳酸钠和1mL福林溶液(一份福林试剂溶于两份水)混合，震荡均匀后，于40℃水浴显色20min，取出后用紫外分光光度仪于波长680nm测定其吸光度值。酶活定义：40℃，pH 7.5条件下，1mL酶液在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为一个酶活力单位，单位是U/mL。所测GUTU06粗酶液的蛋白酶活力为13.9U/mL，所测GUTU06纳豆的蛋白酶活力为139.3531±3.74U/g。

4)DNS法测定淀粉酶活力

麦芽糖标准曲线制作：在试管中分别加入浓度为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml麦芽糖标准溶液(1mg/mL)，补水至2ml，再加入DNS试剂2ml，混匀，沸水浴10min，取出后自来水冲刷冷却，加去离子水定容至20ml，在520nm下测定吸光度值。以麦芽糖含量(x，mg)为横坐标，吸光度值(y，A₅₂₀)为纵坐标，绘制麦芽糖标准曲线。线性回归方程为：y＝0.5638x-0.0335，R²＝0.9997。(如附图2所示)

样品测定：取6支试管，3支测定管3支对照管，分别加入待测粗酶液1ml，对照管加入4ml 4mol/L NaOH灭活，40℃水浴预热15min，然后再分别加入2ml预热5min的2％的可溶性淀粉，混匀，40℃水浴保温反应10min，反应结束后迅速在测定管加入4ml 4mol/L NaOH灭活。取6支20ml刻度管，分别加入试管中反应后的液体2ml，再迅速加入2ml 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，冰浴冷却，加蒸馏水定容至20ml，摇匀，测定各管的OD520取其平均值。酶活定义：以麦芽糖计，每分钟水解可溶性淀粉产生1mg麦芽糖所需酶量定义为一个酶活力单位。所测GUTU06粗酶液的淀粉酶活力为0.546U/mL，所测纳豆的淀粉酶活力为5.46±0.102U/g。

5)：3,5-二硝基水杨酸法测定β-葡萄糖苷酶

葡萄糖标准曲线的绘制：吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0～1.0mL于具塞刻度试管中，每个梯度为0.2mL。每只试管加水到2mL，加DNS溶液3mL，摇匀于沸水中水浴10分钟,冷却后补水至15mL，于540nm波长下测定吸光度值。以吸光度值(y，A540)为纵坐标，葡萄糖质量浓度(x，mg)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线：y＝0.4643x-0.0151，R²＝0.9961。(如附图3所示)

β-葡萄糖苷酶酶活力测定：取制备好的粗酶液。取15ml刻度具塞试管加入底物(含银杏黄酮苷溶液)1.8mL，50℃预热3分钟，加入酶液0.2mL，50℃水浴30分钟，加入DNS溶液3mL，混匀后于水浴锅沸水浴10min，冷却补水定容至15mL。将灭活的酶溶液用作空白对照，并在540nm处测量吸光度。酶活力单位定义：以葡萄糖计，每分钟水解银杏黄酮苷产生1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位。所测GUTU06粗酶液的水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶活力为0.17U/mL，所测纳豆的水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶活力为1.70±0.15U/g。

综合确定GUTU06为目标菌株，其发酵纳豆感官性能优良，其所产纳豆激酶、蛋白酶、淀粉酶、水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶活力都较高。

(2)GUTU06菌落形态鉴定、生理生化鉴定及16SrRNA分子生物学鉴定

菌株于筛选培养基平板上培养48h，观察并记录菌落形态、颜色。

革兰氏染色：挑取平板上的菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、媒染、脱色、水洗、番红复染、干燥、镜检。表明此菌为革兰氏阳性芽孢杆菌。

对所述芽孢杆菌GUTU06进行生理生化特征鉴定，所述芽孢杆菌的生理生化特征—碳源利用如表2所示，所述芽孢杆菌的生理生化特性—酶活、碳源同化如表3所示。

所述枯草芽孢杆菌GZU05的系统发育树图如4所示。

表2菌株生理生化特性--碳源同化

表3菌株生理生化特性-酶活、碳源同化

+：阳性反应；-：阴性反应；

形态生理生化鉴定初步表明GUTU06菌为解淀粉芽孢杆菌，进一步的基于16S rRNA基因的系统发育树(附图4)表明此菌即为解淀粉芽孢杆菌.

实施例2：丙酮沉淀结合反胶束法纯化纳豆激酶

(1)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

蛋白质含量标准曲线制作：取5支干净的试管，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液(1mg/mL)，补水使试管中溶液的总体积为1mL，然后向每个管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇晃试管使其混合均匀，然后于波长595nm处，测定各管的吸光度。标准曲线的绘制是将标准蛋白质浓度(x，mg/mL)作为横坐标，吸光度(y，A₅₉₅)作为纵坐标。线性回归方程为：y＝5.67x+0.089 2，R²＝0.9992(如附图5所示)。

样品测定：取待测酶液1ml，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇晃试管使其混合均匀，然后于波长595nm处，测定各管的吸光度。

(2)丙酮沉淀纳豆激酶

在利用丙酮沉淀法提取和纯化纳豆激酶的过程中，发酵液与丙酮的体积比为1:5，在0℃温度下沉淀6h时，测定蛋白质含量及纳豆激酶活力。在此条件下，纳豆激酶酶活力回收率为66.1±1.3％，纯化倍数为1.78±0.05。

(3)反胶束前萃取

向丙酮沉淀后的粗酶溶液加入一定量的NaCl使其终浓度为0.05mol/L，调节溶液的pH为8.5，得到反胶束萃取前萃的水相溶液。将表面活性剂CTAB溶于异辛烷(75％)/正己醇(10％)/正丁醇(15％)有机溶剂体系中，其中表面活性剂的浓度为225mM。水相和有机相等体积混合并在30℃，200r/min的振荡器中振荡反应25min，反应后的混合物在4 000r/min，4℃下离心15min，离心得到反胶束前萃取后的含有纳豆激酶的有机相，测定蛋白质含量及纳豆激酶活力，此时前萃效率为75.58±1.6％。

(4)反胶束反萃取

将一定量的KCl溶于缓冲液中，使KCl的浓度为1.5mol/L并调节缓冲液的pH为6.0，得反萃取水相溶液。以前萃取离心后得到的含纳豆激酶的有机相作为反萃取的有机相，水相等体积混合，在30℃，200r/min的振荡器中振荡反应75min，反应后4 000r/min，4℃下离心15min，取下层水相即反胶束萃取后的纳豆激酶溶液，测定蛋白质含量及纳豆激酶活力。此时反萃效率为82.35±2.6％，纯化倍数达到2.46±0.08。

(5)纯化后纳豆激酶的浓缩及脱盐

反胶束萃取完成后的酶液，将3倍体积的预冷丙酮加入其中，在-18℃下静置2h，随后在13 000r/min，4℃下离心20min，收集沉淀，晾干后用缓冲液溶解，将上述方法重复两次，之后加入200μL TEAB，冰浴超声5min，接下来13 000r/min，4℃，离心20分钟，弃上清得到浓缩脱盐后的纳豆激酶纯酶。

(6)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，我们使用的是5％的浓缩胶、15％的分离胶，起始电压调为80V，开始反应，当所有的条带都已经进入分离胶时，把电压调到120V的位置，最后当条带到了距离玻璃板底部5mm时，终止电泳。将该胶片放入装有染色液的玻璃皿中，在60r/min的振荡器振荡染色4h，取出胶片，将其用蒸馏水洗干净，后放入脱色液中开始脱色，每隔1h换一次脱色液，一般脱色4～6次，直到凝胶片可以看到清晰的条带和背景透明为止。电极缓冲液为甘氨酸28.8g，Tris 6g，SDS 1g，加三蒸水1 000mL。加入10μL 4×蛋白上样缓冲液加入到30μL酶溶液样品中，沸水浴3-5min，然后冷却至室温，放置备用。考染样品一般上样10μg，浓度至少为1.3μg/μL，Marker一般上样5μg。所得电泳条带显示该纳豆激酶的分子量在24～31KDa之间，更接近于31Kda，约为28Kda，与其他报道相符合(如附图6所示)。

Claims (6)

1.一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06，其特征在于：其微生物学分类命名为解淀粉芽孢杆菌GUTU 06，拉丁文学名Bacillus amyloliquefaciens.GUTU 06，保藏编号为CCTCC M 2019234。

2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用酪蛋白培养基分离豆豉中的产蛋白酶的芽孢杆菌；

2)将步骤1)分离获得的芽孢杆菌进行黄豆固体发酵制备豆豉，对发酵结果进行感官鉴评，选出感官鉴评良好的菌株；

3)将步骤2)中选出的菌株划线接种到酪蛋白平板培养基上，在37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后，得到发酵种子液；按质量百分比4％的接种量接种到黄豆固态培养基中，37℃下发酵24h；将培养完成的纳豆按照质量比为1:9加入水中均质后，在4℃浸提24h后，于4℃、12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液；

然后通过外分光光度法检测纳豆激酶活力，福林法检测其蛋白酶活力，DNS法检测其淀粉酶活力，DNS法检测β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活力，选出蛋白酶、纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶的综合指数最高、且发酵纳豆感官性能良好的菌株，即为解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：步骤1)中所述的酪蛋白培养基的组成为：3-10g/L酪素，1-5g/L葡萄糖，0.5-1.5g/L酵母膏，1-5g/L K2HPO4，0.5-2.5g/L KH2PO4，0.1-0.5g/L MgSO4，pH 7.0～7.2。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：步骤2)中所述的制备豆豉所用的培养基的制备方法是，将黄豆洗净后，将洗净的黄豆与水按照1:3-5单位g/mL的料液比进行常温浸泡，浸泡10-12h后，沥干黄豆表面的水分，于121℃灭菌20min，获得所需发酵制备豆豉的培养基。

5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：对获得的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06再进行形态学分析、生理生化测定及16S rRNA序列分析，确定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌。

6.一种利用如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06产生的纳豆激酶的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)初酶液制备

将解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06划线接种到酪蛋白平板培养基上37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后既得发酵种子液；挑选颗粒饱满、无畸形、色泽淡黄的市售有机黄豆，用去离子水冲洗，直至无杂物，将黄豆按照量比1∶4加入水中浸泡18h后，沥干水；将湿豆在0.1MPa下蒸汽灭菌蒸煮15-30min，然后在无菌条件下自然冷却至室温；将发酵种子液按质量百分比4％的接种量接种到冷却好的黄豆上，37℃培养36h，每12h摇晃一次，培养获得纳豆；将培养完成的纳豆与水按照1:9的料液比单位g/ml均质后，在4℃下提取24h，后于4℃、12000r/min离心10min，获得粗酶液；

2)丙酮沉淀纳豆激酶

在冰浴和磁力搅拌下，将5倍体积的丙酮缓慢注入粗酶液中，在0℃下沉淀6h，获得含纳豆激酶的蛋白沉淀；

3)前萃取纳豆激酶

将丙酮沉淀的纳豆激酶沉淀溶于水相中，得到含纳豆激酶的水相，将水相与有机相等体积混合，萃取离心后，得到含有纳豆激酶的有机相；

4)反胶束反萃取纳豆激酶

将前萃取得到的含有纳豆激酶的有机相与反萃水相等体积混合，进行反应萃取，使纳豆激酶从有机相转移到反萃水相；

5)纯化后纳豆激酶的浓缩及脱盐

将反胶束萃取完成后的酶液用丙酮沉淀两次，收集得到纳豆激酶沉淀，将纳豆激酶沉淀加入TEAB中，冰浴超声后离心，弃上清得到浓缩脱盐后的纳豆激酶纯酶。