CN109852558B - 一株产β-葡萄糖苷酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌GZU03及应用方法 - Google Patents

Abstract

一株产β‑葡萄糖苷酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌GZU03，该枯草芽孢杆菌的微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌GZU03，拉丁文学名：Bacillus subtilis GZU03，已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762。它采集于贵州传统发酵豆制品豆豉。应用方法是将选择的菌株GZU03用固态发酵纳豆培养基培养，发酵纳豆产β‑葡萄糖苷酶和纳豆激酶，得到富含纳豆激酶的豆豉产品。本发明的GZU03发酵纳豆不仅产水解银杏黄酮苷具高酶活的β‑葡萄糖苷酶，同时产纳豆激酶，适用于生产高值的纳豆激酶。

Description

一株产β-葡萄糖苷酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌GZU03及应 用方法

技术领域

本发明涉及微生物，还涉及酶，进一步来说涉及枯草芽孢杆菌，涉及枯草芽孢杆菌的应用方法。

背景技术

传统发酵食品体系是功能性食品微生物的重要来源。来源于食品中的微生物安全性高，具有一定的益身保健作用。

现代研究表明，发酵纳豆制品中有着丰富的生物活性物质。研究发现大发酵豆及其发酵制品中存在游离型大豆异黄酮，这可能是微生物作用于大豆后菌种在发酵过程中产生一定量的β-葡萄糖苷酶。而发酵大豆制品中可能存在产β-葡萄糖苷酶的功能微生物。此外，日本等学者研究发现纳豆食品中存在丰富的纳豆激酶。而纳豆激酶是防治心脑血管疾病的良药。

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，是一类来源广泛的水解酶类。银杏黄酮主要是由黄酮苷元与葡萄糖等糖分子以O-糖苷键连接而成的糖苷类物质。β-葡萄糖苷酶能参与水解黄酮苷类化合物的各种糖苷键，如O-糖苷以及C-糖苷，生成黄酮苷元从而被大肠直接吸收。

微生物发酵产酶是生物酶来源的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵产酶能够水解银杏黄酮苷成银杏黄酮苷元，使苷元活性明显高于银杏黄酮苷。银杏黄酮是目前已发现的最好的防治心脑血管疾病的药物，当前银杏黄酮主要是从银杏叶中提取的，不过从银杏叶中提前的银杏黄酮主要是以银杏黄酮苷的形式存在，而银杏黄酮苷的生物活性要显著小于银杏黄酮苷元，由于酶法环境友好选择性高，因此有必要利用β-葡萄糖苷酶把银杏黄酮苷转化为苷元。

目前对于β-葡萄糖苷酶研究成果虽多，但是大多微生物来源于自然界，来源于传统发酵食品中的鲜有报道。此外，传统酶类对底物选择性差，不能使苷元含量最大化，高选择性水解银杏黄酮苷为苷元的报道还很少。伍毅等采用固定商业β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷，取得了较好结果。但是，利用非商业β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷还极少报道，由于商业β-葡萄糖苷酶价格昂贵，因此，筛选产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的菌株，为银杏黄酮苷元的工业化生产奠定基础，降低转化成本就十分重要。

血栓疾病重影响着人类的健康，据统计，全世界每年至少有1200万患者因血栓性疾病而死亡，中国约有260万。因此溶栓抗栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点。目前临床上常用的溶栓抗栓药物有链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)和组织型纤溶酶原激活剂(type plasminogenactivator，t-PA)，但这些药物存在给药痛苦、副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点，相比之下，纳豆激酶(Nattokinase，NK)已被证明具有高效的溶栓作用，不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。并且纳豆激酶具有可口服、安全、廉价和纤溶性强等优势，成为近年来溶栓类产品的研究热点。

中国专利数据库中，涉及β-葡萄糖苷酶的专利和申请件很多，例如ZL2014106023384号《一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用》、ZL2015101756557号《高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用》、2017102790450号《一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌及其筛选方法》等；但未见涉及枯草芽孢杆菌GZU03的申请件。

发明内容

本发明旨在提供一株产β-葡萄糖苷酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌GZU03，该菌株具有产选择性水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶和产纳豆激酶的性能。

本发明另一目的是提供将该枯草芽孢杆菌应用于水解银杏黄酮苷生成黄酮苷元和生产富含纳豆激酶豆豉的方法。

发明人提供的一株枯草芽孢杆菌GZU03，其微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌GZU03，拉丁文学名：Bacillus subtilis GZU03，已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762，保藏单位地址是中国武汉，武汉大学，其邮编为430072，电话号码为027-68754952。

发明人提供的一株枯草芽孢杆菌GZU03是在贵州传统发酵豆制品豆豉里采集的，它具有产选择性水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶和产纳豆激酶的性能。

发明人提供的将上述枯草芽孢杆菌GZU03应用于水解银杏黄酮苷生成黄酮苷元和生产富含纳豆激酶豆豉的方法，包括以下步骤：

(1)发酵豆制品样品适当稀释取样涂布在栀子苷显色平板上，于37℃下培养，挑选蓝色菌圈较大颜色较深的单菌落进行纯化培养；经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用；

(2)用菌株发酵液转化银杏黄酮，测其水解银杏黄酮苷的酶活力，同时以糖类物质为底物检测β-葡萄糖苷酶的底物选择性；

(3)选择银杏黄酮苷的酶活力高的菌株发酵纳豆，测其纳豆激酶活力，选择转化银杏黄酮苷的酶活力高、发酵纳豆感官品质好且纳豆激酶活力高的菌株为目标菌株GZU03，经形态学、生理生化性质、16S rRNA序列分析表明该菌株属于枯草芽孢杆菌；

(4)枯草芽孢杆菌GZU03用固态发酵纳豆培养基培养，发酵纳豆产β-葡萄糖苷酶和纳豆激酶，发酵48～72h；得到富含纳豆激酶的豆豉产品。

上述方法的第(1)步中，所述平板培养的时间为36～72h。

上述方法的第(2)步中，所述酶活力单位是在测定条件下，每1min水解银杏黄酮苷以葡萄糖计产生1μmol还原糖所需酶量,定义为一个酶活力单位。

上述方法的第(2)步中，所述菌株发酵液转化银杏提取物的β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法是：取15ml具塞刻度试管，加入糖苷类物质底物1.8mL，50℃下预热3min，再加入葡萄糖苷酶酶液0.2mL，于50℃水浴中水解30min，然后用DNS法测水解生成的还原糖量。

上述方法的第(2)步中，所述糖苷类物质底物是1％银杏黄酮苷或苦杏仁苷、栀子苷、芦丁、龙胆二糖、麦芽三糖、熊果苷、昆布多糖、海藻糖中的一种。

上述方法的第(3)步中，所述菌株发酵纳豆及测纳豆激酶的方法是：将筛选得到的芽孢菌菌株转接到LB斜面培养基上37℃活化18～28h，用接种环挑选2-5环的菌苔接种到液体种子培养基中，于37℃、180r/min的条件下培养16～18h处于对数生长期，然后以4％的接种量接种到灭菌的黄豆培养基上，在37℃下培养36～48h，后熟24h即可；用琼脂糖—纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶活力。

上述方法的第(4)步中，所述培养基是如下方法制得的：将黄豆清洗干净，剔除霉烂、虫蛀、畸形的黄豆，去除杂质，用去离子水冲洗干净，然后准确称量，加入4倍体积的溶解了1％的食盐和1％的葡萄糖糖的去离子水完全浸没，常温浸泡18～24h，即得。

上述方法的第(4)步中，所述β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷具有高选择性，其水解银杏黄酮苷酶活为4.2U/g，在室温下该酶可存放2～4d，4℃下可存放7～10d，该酶转化能力保持在45％以上，发酵纳豆所产纳豆激酶酶活超过6000U/g。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：①本发明的枯草芽孢杆菌GZU03发酵纳豆不仅产水解银杏黄酮苷具高酶活的β-葡萄糖苷酶，同时产纳豆激酶，且豆豉感官特性良好；②可以解决商业β-葡糖糖苷酶、纳豆激酶价格昂贵的问题；③本发明的枯草芽孢杆菌GZU03，不仅可用来高值化转化银杏黄酮苷而且可生产高值的纳豆激酶。因此该枯草芽孢杆菌具有很好的应用前景。

附图说明

图1是葡萄糖浓度与吸光度关系的标准曲线；

图2是尿激酶溶解圈面积与酶活关系标准曲线；

图3是菌株GZU03平板菌落形态；

图4是菌株GZU03显微镜(100x)观察照。

具体实施方式

以下实施例用来进一步说明本发明：

实施例1

1.菌株的筛选、种子液的配制、固态纳豆发酵培养基原料预处理

1.1菌株GZU03的分离纯化

在栀子苷显色平板上挑选蓝色菌圈较大、颜色较深的单菌落进行纯化培养,经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用。

1.2种子液的配制

液体种子培养基(g/L)：硫酸铵2、硫酸镁0.5、氯化钠2、碳酸钙2、磷酸二氢钾0.5、银杏叶提取物5；准确称取以上实验药品，充分溶解分装后，置于高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌20min，放入无菌操作台内进行冷却；

1.3固态纳豆发酵培养基原料预处理

剔除霉烂、虫蛀、畸形的黄豆，去除杂质，用去离子水冲洗干净，然后准确称量，加入4倍体积的溶解了1％的食盐和1％的葡萄糖糖的去离子水完全浸没，常温浸泡18～24h。按照每瓶50g的量分装三角瓶，置于高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌20min，放入无菌操作台内进行冷却。

实施例2

粗酶液制备：用接种环挑选2～3环1.1中斜面上的菌苔接种到1.3中液体种子培养基上，于37℃、180r/min的条件下培养18h。之后接种到发酵产酶培养基上培养72h，每12h摇晃一次。称取10g发酵完成的纳豆溶于40mL无菌的生理盐水中，4℃条件下浸提24h，后用打浆机捣碎并经离心机以12000r/min离心10min，上清液即为固态发酵粗酶液。

实施例3

β-葡萄糖苷酶酶、纳豆激酶酶活力测定

3.1葡萄糖标准曲线绘制:吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL于具塞刻度试管中，补水至2mL，加DNS试剂3mL，混合后于沸水中煮10min,冷却后加水定容至15mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y＝0.4657x-0.038，R²＝0.992(图1)。

3.2β-葡萄糖苷酶酶酶活力测定：取15ml具塞刻度试管加入底物(1％银杏黄酮苷)1.8mL，50℃预热3min，加入2中酶液0.2mL，50℃水浴30min，加入DNS试剂3mL，沸水浴10min，冷却定容至15mL。以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值。每1min水解糖苷产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位。GZU03发酵豆豉所产β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活为4.2U/g，高于水解其它底物的酶活，表现出对银杏黄酮苷的高选择性。

3.3尿激酶标准曲线的制作：将尿激酶标准品分别配制为248IU/mL、496IU/mL、744IU/mL、992IU/mL和1240IU/mL，各取10μL点样于新配制的纤维蛋白原平板孔中(四孔为一组平行)，放置10min，37℃培养16h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积。以溶解圈的面积(x，mm²)为横坐标，以尿激酶酶活(y，IU/mL)为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线(图2)。

3.4纳豆激酶酶活力测定：取2中纳豆激酶固态发酵粗酶液10μL点样于纤维蛋白平板上(四孔为一组平行)，放置10min，移入37℃培养箱，保温16h后取出，用游标卡尺测定溶解圈的直径并计算各溶解圈面积，根据尿激酶标准曲线回归方程计算样品纳豆激酶酶活。GZU03的纳豆激酶活力为6340.5U/g。GZU03发酵豆豉所产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶酶活和纳豆激酶的酶活都最高，且发酵的纳豆风味良好，因此此菌株为筛选的目标菌株。

实施例4

菌落形态鉴定、生理生化鉴定及16SrRNA分子生物学鉴定。

4.1菌株于筛选培养基平板上培养48h，观察并记录菌落形态、颜色。

4.2革兰氏染色：挑取平板上的菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、媒染、脱色、水洗、番红复染、干燥、镜检。

观察菌株的菌落形态特征，结果如图3，在平板上形成圆形、低凹起、有粘性的小菌落，其颜色呈乳白色，边缘规则，无光泽，稍隆起，不透明，菌落直径2.0mm～2.9mm。该菌株革兰氏染色菌体为紫色，为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，单个、成对或链状排列，芽孢中生或近中生，初步判断为芽孢杆菌属。革兰氏染色后，于光学显微镜油镜下观察细胞形态特征，结果如图4。

4.3生理生化特征

GZU03的生理生化特征如表1和表2所示

表1菌株GZU03生理生化特性——碳源利用

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性

表2 GZU03生理生化特性—酶活、产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

4.4分子生物学鉴定

对菌株GZU03进行16SrRNA基因序列测定，测定结果在NCBI上比对鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

所述枯草芽孢杆菌GZU03的全部16S rRNA的基因序列如序列表所示。

实施例5：

菌株GZU03在制备纳豆的中的应用，其步骤如下：

将枯草芽孢杆菌GZU03菌株转接到LB斜面培养基上37℃活化24h，用接种环挑选2-3环的菌苔接种到液体种子培养基中(装液量为50mL/250mL)，于37℃，180r/min的条件下培养16h至对数生长期，然后按4％(v/w)的接种量接种到灭菌的黄豆上，在37℃培养36h，每12h搅拌一次。发酵的纳豆颜色为黄色，拨动黄豆有长长拉丝的现象，带有淡淡的香味物质，感官良好，纳豆激酶激酶的活力高于6000U/g(湿黄豆)。

所述的液体种子培养基的成分是：10g/L葡糖糖，5g/L酵母提取物，10g/L牛肉膏，5g/L NaCl，pH 7.4～7.6。

<110> 贵州大学

何腊平

<120> 一株高产β-葡萄糖苷酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌GZU03及应用方法

<130> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1432

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<220>

<221> 16S

<222> (1)..(1432)

<400> 1

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Claims (1)

1.一株产β-葡萄糖苷酶和纳豆激酶的枯草芽孢杆菌(拉丁文学名：Bacillussubtilis)GZU03，其特征在于，该枯草芽孢杆菌已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018762；保藏单位地址是中国武汉，武汉大学，其邮编为430072，电话号码为027-68754952。

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