CN103243040B - 一种枯草芽孢杆菌lsse-22及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌LSSE-22及其应用。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏编号为：CGMCC No.4970。本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌LSSE-22的应用。本发明提供了一种纳豆食品，由豆类底物经上述枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵制得。本发明的枯草芽孢杆菌LSSE-22具有较高的纳豆激酶生产活性，以鹰嘴豆为底物，纳豆激酶最高活性达到356.25FU/g(鹰嘴豆干重)；本发明通过乙醇分离法同时分离制备纳豆激酶和抗氧化活性物质总酚，纳豆激酶活性高达2852.62FU/g(干重)，总酚含量达14.78mg没食子酸/g(干重)，该方法简单高效。

Description

一种枯草芽孢杆菌LSSE-22及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌LSSE-22及其应用。

背景技术

血栓疾病是危害人类健康的重要疾病，每年约有300万患者死亡。因此，溶栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点问题。传统的溶栓酶如尿激酶、纤溶酶原激活剂(t-PA)和链激酶等，这类酶半衰期短，副作用大，价格昂贵，且口服利用度低，纳豆激酶因其具有可口服、安全、高效、持久和廉价等优势，成为近年来溶栓类产品的开发热点(Peng Y，Yang X，Zhang Y.Appl Microbiol Biotechnol，2005，69：126-132)。

目前的纳豆激酶产品主要包括纳豆食品和纳豆激酶保健品。纳豆食品经枯草芽孢杆菌发酵豆类而成，富含多种营养元素和多种生理活性物质，如纳豆激酶、纳豆菌、聚谷氨酸、总酚等多种生理活性物质，具有溶解血栓、调节肠道菌群、抗癌、促进营养吸收、抗氧化等保健作用。纳豆在日本历史悠久，90％的人习惯食用纳豆食品，是日本人健康长寿的“秘诀”。纳豆在韩国、美国也很受欢迎，已有适合本地人口味的产品上市。我国对纳豆的开发起步比较晚，目前所报道的纳豆激酶产生菌多分离于日本纳豆，有一种不愉快的纳豆臭味，目前我国人民对纳豆食品的接受程度还比较低。同时，国内纳豆激酶保健品市场混乱，纳豆激酶活性比较低，筛选高活性纳豆激酶生产菌有望改善国内纳豆激酶产品现状，提高我国纳豆激酶类产品的竞争力。

黄豆酱作为我国人民长期食用的一种大豆发酵制品，符合国人的口味，且其富含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等多种益生菌。黄豆和鹰嘴豆是世界上最重要的豆类作物，其中鹰嘴豆在我国新疆地区被作为维吾尔族习用药材，对糖尿病、高血脂、高血压病、心脑血管疾病、肺病、消化不良等均有良好的食疗作用(全智慧，徐暾海.时珍国医国药，2009，20：3111-3112)。鹰嘴豆含有丰富的抗氧化活性成分，如酚类成分和黄酮类成分，这些抗氧化成分可降低癌症、老年痴呆、心血管疾病的发病概率(Xu BJ，Yuan SH，Chang SK et al.J Food Sci，2007，72：S167-177)。因此，本发明希望从我国传统发酵黄豆酱中分离高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌，并以鹰嘴豆和黄豆为发酵底物，希望得到纳豆激酶的高产工艺，制备高活性纳豆激酶食品和纳豆激酶冻干粉。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌LSSE-22。

本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌LSSE-22的应用。

本发明的再一目的是提供一种纳豆食品，其由上述枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵制得。

本发明的再一目的是提供上述纳豆食品的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种纳豆激酶水提物冻干粉。

本发明的再一目的是提供制备上述纳豆激酶水提物冻干粉的方法。

本发明的再一目的是提供一种同时制备纳豆激酶冻干粉和总酚冻干粉的方法。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌LSSE-22。本发明的发明人在黄豆酱制品中，分离筛选出一种纳豆激酶生产菌株，适宜生长温度28-40℃，适宜pH6.5-7.5。经形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为LSSE-22(Bacillus subtilis)。该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4970，保藏日期：2011年6月22日。

本发明菌种的分离方法在纤溶酶活性分离法的基础上，采取独特的纳豆激酶基因PCR扩增法，可快速准确的筛选到纳豆激酶生产菌株。加无菌水于黄豆酱制品中，80℃加热10min，吸取上清液稀释涂布筛选培养基平板(纤维蛋白12g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2)，37℃培养48h，挑选透明圈较大的单菌落，转接LB固体培养基平皿(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2)，培养后保存于4℃冰箱中。通过菌种活化，转接至灭菌的鹰嘴豆中，37℃，培养48h。挑选纤溶活性较高的菌株，通过PCR反应扩增纳豆激酶基因。在扩增出基因产物的菌株中，收集纤溶活性最高菌株的PCR反应产物进行测序，比对基因序列相似性鉴定该菌为纳豆激酶产生菌。纳豆激酶活性检测通过纤维蛋白溶解法进行：向试管中依次加入0.4mL纤维蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.4mL Tris-HCl(50mM，pH 7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.1mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃温浴10min，再加入0.1mL的稀释酶样品，37℃温浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.2M)静止20min终止反应，4000g离心15min，取上清于275nm比色测定吸光度，1个单位的纤维蛋白降解酶活(FU)相当于每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量。将筛选到的菌株按照规定方法进行菌种鉴定。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌在LB固体培养基上菌落边缘粗糙，菌苔表面褶皱。适宜生长温度28-40℃，适宜pH 6.5-7.5。酪蛋白水解阳性，淀粉水解阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。菌体呈直杆状，1.8-2.9×0.8-1.2μm，革兰氏染色阳性。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列有1462个碱基，该16SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示：

agggaacgtt ggggccgtgc taatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc    60

ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata    120

actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa    180

aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta    240

acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac    300

tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa    360

agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt    420

tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc    480

cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat    540

tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca    600

accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca    660

cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg    720

gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt    780

agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca    840

gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat    900

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc    960

ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga    1020

gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc    1080

aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc    1140

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg    1200

gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat    1260

cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat    1320

cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg    1380

cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca    1440

gccgccgaag tgacaagaat gt                                             1462

测得的16S rRNA序列通过MEG.4软件进行系统进化树的构建，进化树显示菌株LSSE-22属于枯草芽孢杆菌。综合形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定结果，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。

该菌株具有较高的纳豆激酶生产活性，以鹰嘴豆为底物，纳豆激酶最高活性达到356.25FU/g(鹰嘴豆干重)。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌LSSE-22的应用，优选其在生产纳豆激酶、总酚、制备纳豆食品及在医药、食品工业中的应用。

本发明提供了一种纳豆食品，其中，所述纳豆食品由豆类底物经上述枯草芽孢杆菌发酵制得。

根据本发明的纳豆食品，其中，所述豆类底物为鹰嘴豆或黄豆。

本发明的上述纳豆食品的制备方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述枯草芽孢杆菌LSSE-22菌株接在LB液体培养基上37℃培养12h后放置于无菌管中，-70℃冷冻保藏；

2)制备种子液；

3)制备豆类发酵底物，其中所述豆类为鹰嘴豆或黄豆；

4)发酵培养：按照2％-5％(v/w)的接种量，将种子液加入豆类发酵底物中混匀，31-37℃静止培养36-48h，获得纳豆食品。

根据本发明的纳豆食品的制备方法，其中，所述种子液制备方法包括以下步骤：

1)将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养12h，使其活化；

2)将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养8-14h，制得种子液。

根据本发明的纳豆食品的制备方法，其中，所述豆类发酵底物制备方法包括以下步骤：

1)精选：去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；

2)浸泡：加入5倍体积(v/w)的水，室温浸泡12h；

3)沥水，使豆子的初始含水量为50％-70％；

4)蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115℃高温高压蒸煮30min，制得豆类发酵底物。

本发明还提供了一种纳豆激酶水提物冻干粉，经由上述纳豆食品制备获得，富含纳豆激酶和总酚。

本发明还提供了一种制备纳豆激酶水提物冻干粉的方法，包括以下步骤：

向上述纳豆食品中添加4倍体积(v/w)的水，200r/min搅拌1h，5000-10000g离心20-40min，除去固体物质，上清液冷冻干燥48h，获得水提物冻干粉。

本发明还提供了一种同时制备纳豆激酶冻干粉和总酚冻干粉的方法，包括以下步骤：

1)水提：向上述纳豆食品中添加4倍体积(v/w)的水，200r/min搅拌1h，5000-10000g离心20-40min，除去固体物质，获得水提物；

2)乙醇分离：向水提物中添加3倍体积的无水乙醇，室温静止沉淀1h，离心收集沉淀物，冷冻干燥，获得纳豆激酶干粉；同时，收集上清液，经过冷冻干燥，获得总酚冻干粉。

使用该方法制备的纳豆激酶冻干粉，纳豆激酶活性高达2852.62FU/g(干重)；制备的总酚冻干粉，总酚含量达14.78mg没食子酸/g(干重)。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株及用其生产纳豆激酶产品的方法，具有较强的创新性和实用性，其优点如下：

(1)该菌株具有较高的纳豆激酶生产活性，以鹰嘴豆为底物，纳豆激酶最高活性达到356.25FU/g(鹰嘴豆干重)，是目前国内外报道最高的。

(2)首次制备鹰嘴豆纳豆激酶水提物冻干粉，富含纳豆激酶和抗氧化活性物质总酚。

(3)首次通过乙醇分离法同时分离制备纳豆激酶和抗氧化活性物质总酚，纳豆激酶活性高达2852.62FU/g(干重)，总酚含量达14.78mg没食子酸/g(干重)，该方法简单高效。

附图说明

枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4970。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1菌株的筛选

本发明菌种的分离方法综合了纤溶酶活性分离法和纳豆激酶基因PCR扩增法，可快速准确的筛选到纳豆激酶生产菌株。加无菌水于黄豆酱制品中，80℃加热10min，吸取上清液稀释涂布筛选培养基平板(纤维蛋白12g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2)，37℃培养48h，挑选透明圈较大的单菌落，转接LB固体培养基平皿(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2)，培养后保存于4℃冰箱中。通过菌种活化，转接至灭菌的鹰嘴豆中，37℃，发酵48h。挑选纤溶活性较高的菌株，通过PCR反应扩增纳豆激酶基因。菌株总DNA通过细菌基因组抽提试剂盒抽提，PCR扩增采用纳豆激酶基因开放阅读框特异性引物aprNF(CCGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCA)和aprNR(ATTTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG)进行。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。结果显示有3株菌可得到PCR产物，其中活性最高的菌株纤溶活性达173.75FU/g(干豆)，收集该菌株的PCR产物进行测序，测序结果显示该基因长度为1146bp，可翻译成381个氨基酸组成的蛋白，其中信号肽29个氨基酸，前肽77个氨基酸，成熟肽275个氨基酸。通过BioEdit进行相似性比对，该酶同已报道的纳豆激酶的基因序列和氨基酸序列相似性达到99.9％和99.7％，因此所得菌株生产的纤溶酶被鉴定为纳豆激酶。

纳豆激酶活性检测通过纤维蛋白溶解法进行：向试管中依次加入0.4mL纤维蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.4mL Tris-HCl(50mM，pH 7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.1mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃温浴10min，再加入0.1mL的稀释酶样品，37℃温浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.2M)静止20min终止反应，4000g离心15min，取上清于275nm比色测定吸光度，1个单位的纤维蛋白降解酶活(FU)相当于每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量。

实施例2菌株的鉴定

形态及生理生化鉴定

细菌形态及生理生化鉴定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行，分离所得菌株在LB固体培养基上生长时，菌落边缘粗糙，菌苔表面褶皱。适宜生长温度28-40℃，适宜pH 6.5-7.5。酪蛋白水解阳性，淀粉水解阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。菌体呈直杆状，1.8-2.9×0.8-1.2μm，革兰氏染色阳性。

16S rRNA分子鉴定

菌株总DNA通过细菌基因组抽提试剂盒抽提，16S rRNA基因PCR扩增采用通用引物(27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和(1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，28个循环；72℃延伸10min。基因测序通过ABI Prism 370自动测序仪完成。测序结果显示该菌株的16S rRNA基因序列有1462个碱基(SEQ ID NO.1)，与枯草芽孢杆菌JBE0016的序列相似性达到99.1％。通过MEG.4软件进行系统进化树的构建，进化树也显示菌株属于枯草芽孢杆菌。结合16S rRNA分子鉴定与前面的形态学和生理生化鉴定结果，鉴定该菌株为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌，命名为LSSE-22(Bacillus subtilis)。该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4970，保藏日期：2011年6月22日。

实施例3鹰嘴豆固体发酵

1、用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌LSSE-22为原始菌种；

2、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12h。

3、种子液培养：

将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180rpm培养8h；

4、鹰嘴豆底物制备：

(1)鹰嘴豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的鹰嘴豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用水清洗两边。

(2)浸泡：加入5倍体积(v/w)水，室温浸泡12h。

(3)沥水：沥去浸泡后的鹰嘴豆中多余的水分，初始含水量为50％。

(4)蒸煮：115℃高温高压蒸煮30min，冷却至室温。

5、发酵培养：按照2％(v/w)的接种量，加入鹰嘴豆中混匀，31℃静止培养36h，获得鹰嘴豆纳豆食品。

6、纳豆激酶活性分析：向发酵鹰嘴豆中加入4倍体积(v/w)水，200r/min水提1h，5000g离心20min除去菌体，上清液为纳豆激酶水提物。采用实施例1所述纳豆激酶活性分析方法，检测分析发酵鹰嘴豆中纳豆激酶活性为150.35FU/g(干重)，水提物冻干粉中纳豆激酶活性为788.95FU/g(干重)。

实施例4鹰嘴豆固体发酵

1、用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌LSSE-22为原始菌种；

2、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12h。

3、种子液培养：

将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180rpm培养14h；

4、鹰嘴豆底物制备：

(1)鹰嘴豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的鹰嘴豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用水清洗两边。

(2)浸泡：加入5倍体积(v/w)自来水，室温浸泡12h。

(3)沥水：沥去浸泡后的鹰嘴豆中多余的水分，初始含水量为70％。

(4)破碎：用研磨机将鹰嘴豆磨成鹰嘴豆碎片。

(5)蒸煮：115℃高温高压蒸煮30min，冷却至室温。

5、发酵培养：按照5％(v/w)的接种量，加入鹰嘴豆中混匀，37℃静止培养48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。

6、纳豆激酶活性分析：向发酵鹰嘴豆中加入4倍(v/w)体积水，200r/min水提1h，10000g离心20min除去菌体，上清液为纳豆激酶水提物。采用实施例1所述纳豆激酶活性分析方法，检测分析发酵鹰嘴豆中纳豆激酶活性为310.58FU/g(干重)，水提物冻干粉中纳豆激酶活性为996.45FU/g(干重)。

实施例5鹰嘴豆固体发酵

1、用冷冻保藏的枯草芽胞杆菌LSSE-22为原始菌种；

2、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12h。

3、种子液培养：

将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180rpm培养12h；

4、鹰嘴豆底物制备：

(1)鹰嘴豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的鹰嘴豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用自来水清洗两边。

(2)浸泡：加入5倍体积自来水，室温浸泡12h。

(3)沥水：沥去浸泡后的鹰嘴豆中多余的水分，初始含水量为50％。

(4)破碎：用研磨机将鹰嘴豆磨成鹰嘴豆碎片。

(5)蒸煮：115℃高温高压蒸煮30min，冷却至室温。

5、发酵培养：按照5％(v/w)的接种量，加入鹰嘴豆中混匀，34℃静止培养44h。

6、纳豆激酶活性分析：向发酵鹰嘴豆中加入4倍体积自来水，200r/min水提1h，5000g离心20min除去菌体，上清液为纳豆激酶水提物。采用实施例1所述纳豆激酶活性分析方法，检测分析发酵鹰嘴豆中纳豆激酶活性为356.25FU/g(干重)，水提物冻干粉中纳豆激酶活性为1113.28FU/g(干重)。

7、总酚含量分析：0.2mL样品加入到0.2mL的福林酚试剂(1N)中，反应3min，加入0.4mLNa₂CO₃溶液(1N)，室温反应90min，加入2mL去离子水，4000g离心10min，725nm测定上清吸光度，以没食子酸为标准品(10、20、30、40、50μg/mL)，总酚含量等价表示为mg没食子酸/g干重。检测分析发酵鹰嘴豆中总酚含量为3.81mg没食子酸/g干重，水提物冻干粉中总酚含量为11.61mg没食子酸/g干重。

实施例6一步分离纳豆激酶和总酚活性物质

向实施例4所制备的纳豆激酶水提物中加入3倍体积(v/w)的无水乙醇，放置1h后，5000g离心10min，收集沉淀和上清液。沉淀物冷冻干燥，即得纳豆激酶冻干粉，冻干粉产量为115.74mg/g(干重)，冻干粉纳豆激酶活性为2852.62FU/g(干重)，酶活回收率达92.65％；上清液冷冻干燥，即得总酚冻干粉，产物检测总酚含量为14.78mg没食子酸/g干重，回收率为89.23％。

实施例7黄豆固体发酵

1、用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌LSSE-22为原始菌种；

2、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12h。

3、种子液培养：

将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180rpm培养12h；

4、黄豆底物制备：

(1)黄豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的黄豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用自来水清洗两边。

(2)浸泡：加入5倍体积(v/w)自来水，室温浸泡12h。

(3)沥水：沥去浸泡后的黄豆中多余的水分，初始含水量为50％。

(4)蒸煮：115℃高温高压蒸煮30min，冷却至室温。

5、发酵培养：按照5％(v/w)的接种量，加入黄豆中混匀，34℃静止培养44h，获得纳豆食品。

6、纳豆激酶活性分析：向发酵黄豆中加入4倍体积(v/w)自来水，200r/min水提1h，10000g离心20min除去菌体，上清液为纳豆激酶水提物。检测分析发酵黄豆中纳豆激酶活性为188.75FU/g(干重)，水提物冻干粉中纳豆激酶活性为686.36FU/g(干重)。

实施例8黄豆固体发酵

1、用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌LSSE-22为原始菌种；

2、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12h。

3、种子液培养：

将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180rpm培养12h；

4、黄豆底物制备：

(1)黄豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的黄豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用自来水清洗两边。

(2)浸泡：加入5倍体积(v/w)自来水，室温浸泡12h。

(3)沥水：沥去浸泡后的黄豆中多余的水分，初始含水量为70％。

(4)破碎：用研磨机将黄豆磨成1-5mm的碎片。

(5)蒸煮：115℃高温高压蒸煮30min，冷却至室温。

5、发酵培养：按照5％(v/w)的接种量，加入黄豆中混匀，37℃静止培养48h，获得纳豆食品。

6、纳豆激酶活性分析：向发酵黄豆中加入4倍体积(v/w)自来水，200r/min水提1h，10000g离心20min除去菌体，上清液为纳豆激酶水提物。检测分析发酵黄豆中纳豆激酶活性为292.5FU/g(干重)。向纳豆激酶水提物中加入3倍体积(v/w)的无水乙醇，放置1h后，5000g离心10min，收集沉淀，沉淀物检测纳豆激酶活性为2242.96FU/g(干重)。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏编号为：CGMCC No.4970。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌LSSE-22在以鹰嘴豆或黄豆为底物生产纳豆激酶和/或总酚，或者制备纳豆食品中的应用。

3.一种纳豆食品，其特征在于，所述纳豆食品由豆类底物经权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵制得，其中，所述豆类底物为鹰嘴豆或黄豆。

4.一种纳豆食品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述枯草芽孢杆菌LSSE-22菌株接在LB液体培养基上37℃培养12h后放置于无菌管中，-70℃冷冻保藏；

2)制备种子液；

3)制备豆类发酵底物，其中所述豆类为鹰嘴豆或黄豆；

4)发酵培养：按照2％-5％(v/w)的接种量，将种子液加入豆类发酵底物中混匀，31-37℃静止培养36-48h，获得纳豆食品。

5.根据权利要求4所述的纳豆食品的制备方法，其特征在于，所述种子液制备方法包括以下步骤：

1)将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养12h，使其活化；

2)将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养8-14h，制得种子液。

6.根据权利要求4所述的纳豆食品的制备方法，其特征在于，所述豆类发酵底物制备方法包括以下步骤：

1)精选：去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；

2)浸泡：加入5倍体积(v/w)的水，室温浸泡12h；

3)沥水，使豆子的初始含水量为50％-70％；

4)蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115℃高温高压蒸煮30min，制得豆类发酵底物。

7.一种纳豆激酶水提物冻干粉，其特征在于，经由权利要求3所述纳豆食品制备获得，富含纳豆激酶和总酚。

8.一种制备纳豆激酶水提物冻干粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

向权利要求3所述纳豆食品中添加4倍体积(v/w)的水，200r/min搅拌1h，5000-10000g离心20-40min，除去固体物质，上清液冷冻干燥48h，获得水提物冻干粉。

9.一种同时制备纳豆激酶冻干粉和总酚冻干粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)水提：向权利要求3所述纳豆食品中添加4倍体积(v/w)的水，200r/min搅拌1h，5000-10000g离心20-40min，除去固体物质，获得水提物；

2)乙醇分离：向水提物中添加3倍体积的无水乙醇，室温静止沉淀1h，离心收集沉淀物，冷冻干燥，获得纳豆激酶干粉；同时，收集上清液，经过冷冻干燥，获得总酚冻干粉。