CN101305785B - 一种溶血栓豆豉的生产方法 - Google Patents

一种溶血栓豆豉的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶血栓豆豉的生产方法，包括如下步骤：优质大豆浸泡，蒸煮，冷却后接入种曲(曲霉)，发酵培养60h～72h，制得豆豉半成品；豆豉半成品室温浸泡5h～8h，添加葡萄糖8.0％～10.0％(W/W)，灭菌，冷却后接入12.0％～15.0％(V/W)枯草芽孢杆菌种子液，在温度30℃～35℃下发酵培养72h～84h。本发明结合传统豆豉生产技术进行两步固态发酵，即曲霉的前发酵和枯草芽孢杆菌的后发酵，经过两步发酵获得富含可溶性氮、可溶性糖、水溶性矿物质、游离氨基酸等营养成分以及豆豉纤溶酶、多肽、大豆异黄酮等功能成分的溶血栓豆豉，该产品具有抗氧化、抗血栓、预防心血管疾病功能。

Description

一种溶血栓豆豉的生产方法
技术领域
本发明属于食品发酵工程领域，具体涉及一种以大豆为原料制作溶血栓豆豉的生产方法。
背景技术
栓塞性疾病严重地危害人类的生命健康，尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中老年人健康最严重而又常见的疾病之一。治疗栓塞性疾病的有效可靠的方法是采用纤维蛋白溶解酶或其激活剂进行的溶栓疗法，高效、安全的溶栓剂需求迫切。此外，现代人们的疾病观念已由治病为主向防病为主转变，药食同源、功效独特的保健食品备受人们青睐。
日本专利(JP61162184)、(JP1180834)和(JP5336917)涉及一种新型的溶栓剂——纳豆激酶(Nattokinase，NK)，它是从日本传统发酵食品纳豆(Natto)中发现的，除了溶栓作用外，研究发现纳豆还具有整肠、抗癌、抗氧化、预防骨质疏松等功能，使纳豆成为集抗血栓等多种功能于一身的保健食品。日本在纳豆的生产技术方面也进行了系统的研究，开发出系列纳豆保健食品，如大和制药有限公司(Daiwa Pharmaceutical Co.Ltd.)开发的纳豆激酶制品、文翠普-圣特公司(Ventrep Sante Int.)开发的纳豆精等。
豆豉是我国的传统发酵食品，具有开胃增食，消积化滞，驱风散寒以及预防心血管疾病等功效，但豆豉在我国的消费方式仅限于调味品(少数部分入药)，没有充分发挥豆豉药食兼用的保健功能作用。目前豆豉纤溶酶的固态发酵是将枯草芽孢杆菌直接接种到大豆进行固态发酵。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种溶血栓豆豉的生产方法，该方法结合传统的豆豉生产方式，以大豆(黑豆或者黄豆)为原料，经过前发酵(曲霉发酵)制得豆豉半成品，接着以该半成品为发酵基质，接种本实验室从豆豉中筛选得到的高产豆豉纤溶酶的枯草芽孢杆菌，在一定条件下进行后发酵。本发明通过如下技术方案实现：一种溶血栓豆豉的生产方法，包括如下步骤：
(1)大豆的前发酵
a.将大豆清洗后，室温浸泡12h～15h，大豆与浸泡水的质量体积比为1∶3～5g/mL；
b.对上述浸泡好的大豆进行蒸煮；
c.将蒸煮好的大豆冷却至室温，接入种曲(曲霉)发酵培养60h～72h；
d.取出发酵好的大豆，洗去豆粒表面的分生孢子和菌丝，干燥，制得豆豉半成品；(2)大豆的后发酵
e.将步骤(1)制得的豆豉半成品室温浸泡5h～8h，豆豉半成品与浸泡水的质量体积比为为1∶1～2g/mL；
f.在浸泡好的豆豉半成品中添加8.0％～10.0％(W/W)的葡萄糖，并灭菌；
g.将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温，按每100g豆豉半成品接入12～15mL枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养，发酵培养温度为30℃～35℃，培养时间为72h～84h，制得豆豉成品。
上述方法中，步骤b中大豆在121℃、0.1MPa下蒸煮30min-40min。
上述方法中，步骤c中接入曲霉后对大豆进行厚层通风培养，24h后进行翻曲，总的发酵培养时间为60h～72h。
上述方法中，步骤d中所述干燥为在50℃干燥箱中干燥8h～10h。
上述方法中，步骤d中将制得的豆豉半成品于-20℃下保存。
上述方法中，步骤f中灭菌的温度为115℃，时间为20min。
上述方法中，步骤g中还对制得的豆豉成品进行真空冷冻干燥16h-18h，粉碎，过60目筛，制得豆豉冻干粉。
上述方法中，步骤g中所述种子液采用如下方法制备：
(1)获取枯草芽孢杆菌：从豆豉中筛选高产豆豉纤溶酶菌株，保存于-80℃下；
(2)配制种子培养基：按照100mL水中含有葡萄糖1.0g、大豆蛋白胨1.0g、Na2HPO40.2g、NaH2PO40.1g、CaCl20.02g和MgSO40.05g的比例配置种子培养基；
(3)种子液制备：将枯草芽孢杆菌转接至营养琼脂斜面培养基，37℃恒温培养过夜，从斜面培养基取一环活化菌种，接入50mL种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养14h～16h。
上述方法中，粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉，豆豉纤溶酶酶活为1800-2000单位/g冻干粉，大豆异黄酮、游离氨基酸的含量分别达到7.80-8.60mg/g冻干粉和18.50-20.00mg/g冻干粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明采用两步固态发酵，首先经过前发酵(曲霉发酵)制得豆豉半成品，由于曲霉分泌的多种酶系的作用，豆豉半成品中的可溶性氮、可溶性糖、水溶性矿物质、游离氨基酸、大豆异黄酮等比原料显著提高。在此基础上，接种枯草芽孢杆菌进行豆豉纤溶酶的固态发酵，有利于豆豉中的纤溶酶含量的提高，并进一步提高多肽、大豆异黄酮等活性成分含量。用本发明的方法生产的溶血栓豆豉富含豆豉纤溶酶、大豆异黄酮、游离氨基酸和矿物质等营养成分，豆豉纤溶酶可以专一地水解血纤维蛋白，具有溶解血栓的功能；大豆异黄酮具有抗氧化作用；游离氨基酸和矿物质是人体必需的营养成分，是一种具有抗氧化、抗血栓、预防心血管疾病功能的新一代保健食品，可在有关保健食品生产企业，豆豉生产厂家推广应用，具有显著的社会效益和经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。
实施例1
1、黑豆的前发酵
精选优质黑豆清洗后，室温浸泡5h，浸水比例1∶3；121℃，0.1MPa，蒸煮30min，冷却后接入种曲(曲霉)，厚层通风培养，24h后进行翻曲，60h后豆粒遍布黄绿色孢子即可出曲；将成曲投入水池，洗去表面分生孢子和菌丝，于50℃干燥箱中干燥8h，制得豆豉半成品，保存于-20℃备用。
2、黑豆的后发酵
(1)菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC-12为本实验室从豆豉中筛选的高产豆豉纤溶酶菌株，保存于-80℃。
(2)种子培养基
按照100mL水中含有葡萄糖1.0g、大豆蛋白胨1.0g、Na2HPO40.2g、NaH2PO40.1g、CaCl20.02g和MgSO40.05g的比例配置种子培养基，种子培养基的pH值为7.0。
(3)种子液制备
将保存菌种转接至营养琼脂斜面培养基，37℃恒温培养过夜。从斜面培养基取一环活化菌种，接入50mL种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养14h。
(4)后发酵
豆豉半成品室温浸泡5h，浸水比例为1∶1；添加8.0％(W/W)的葡萄糖，并灭菌20min；将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温，按每100g豆豉半成品接入12mL新鲜培养的枯草芽孢杆菌种子液，30℃发酵培养72h，制得豆豉成品。
(5)豆豉纤溶酶、大豆异黄酮、游离氨基酸的测定
以尿激酶作标准品，采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶酶活；以染料木素作标准品，采用紫外分光光度计法测定大豆异黄酮含量；采用电位滴定法测定游离氨基酸的含量。
3、冷冻干燥
两步固态发酵得到的豆豉成品黑亮圆润，表面有大量粘液，成品真空冷冻干燥16h，粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉，豆豉纤溶酶酶活为1800单位/g冻干粉，大豆异黄酮、游离氨基酸的含量分别达到7.80mg/g冻干粉和18.50mg/g冻干粉。
实施例2
1、黑豆的前发酵
精选优质黑豆清洗后，室温浸泡8h，浸水比例1∶5；121℃，0.1MPa，蒸煮40min，冷却后接入种曲(曲霉)，厚层通风培养，24h后进行翻曲，72h后豆粒遍布黄绿色孢子即可出曲；将成曲投入水池，洗去表面分生孢子和菌丝，于50℃干燥箱中干燥10h，制得豆豉半成品，保存于-20℃备用。
2、黑豆的后发酵
(1)菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC-12为本实验室从豆豉中筛选的高产豆豉纤溶酶菌株，保存于-80℃。
(2)种子培养基
按照100mL水中含有葡萄糖1.0g、大豆蛋白胨1.0g、Na2HPO40.2g、NaH2PO40.1g、CaCl20.02g和MgSO40.05g的比例配置种子培养基，种子培养基的pH值为7.0。
(3)种子液制备
将保存菌种转接至营养琼脂斜面培养基，37℃恒温培养过夜。从斜面培养基取一环活化菌种，接入50mL种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养16h。
(4)后发酵
豆豉半成品室温浸泡8h，浸水比例为1∶2；添加10.0％(W/W)的葡萄糖，并灭菌20min；将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温，按每100g豆豉半成品接入15mL新鲜培养的枯草芽孢杆菌种子液，35℃发酵培养84h，制得豆豉成品。
(5)豆豉纤溶酶、大豆异黄酮、游离氨基酸的测定
以尿激酶作标准品，采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶酶活；以染料木素作标准品，采用紫外分光光度计法测定大豆异黄酮含量；采用电位滴定法测定游离氨基酸的含量。
3、冷冻干燥
两步固态发酵得到的豆豉成品黑亮圆润，表面有大量粘液，成品真空冷冻干燥18h，粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉，豆豉纤溶酶酶活为2000单位/g冻干粉，大豆异黄酮、游离氨基酸的含量分别达到8.60mg/g冻干粉和20.00mg/g冻干粉。
实施例3
1、黄豆的前发酵
精选优质黄豆清洗后，室温浸泡7h，浸水比例1∶4；121℃，0.1MPa，蒸煮35min，冷却后接入种曲(曲霉)，厚层通风培养，24h后进行翻曲，72h后豆粒遍布黄绿色孢子即可出曲；将成曲投入水池，洗去表面分生孢子和菌丝，于50℃干燥箱中干燥9h，制得豆豉半成品，保存于-20℃备用。
2、黄豆的后发酵
(1)菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC-12为本实验室从豆豉中筛选的高产豆豉纤溶酶菌株，保存于-80℃。
(2)种子培养基
按照100mL水中含有葡萄糖1.0g、大豆蛋白胨1.0g、Na2HPO40.2g、NaH2PO40.1g、CaCl20.02g和MgSO40.05g的比例配置种子培养基，种子培养基的pH值为7.0。
(3)种子液制备
将保存菌种转接至营养琼脂斜面培养基，37℃恒温培养过夜。从斜面培养基取一环活化菌种，接入50mL种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养15h。
(4)后发酵
豆豉半成品室温浸泡6h，浸水比例为1∶2；添加9.0％(W/W)的葡萄糖，并灭菌20min；将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温，按每100g豆豉半成品接入14mL新鲜培养的枯草芽孢杆菌种子液，33℃发酵培养84h，制得豆豉成品。
(5)豆豉纤溶酶、大豆异黄酮、游离氨基酸的测定
以尿激酶作标准品，采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶酶活；以染料木素作标准品，采用紫外分光光度计法测定大豆异黄酮含量；采用电位滴定法测定游离氨基酸的含量。
3、冷冻干燥
两步固态发酵得到的豆豉成品黑亮圆润，表面有大量粘液，成品真空冷冻干燥17h，粉碎后得到土黄色的豆豉冻干粉，豆豉纤溶酶酶活为1900单位/g冻干粉，大豆异黄酮、游离氨基酸的含量分别达到8.20mg/g冻干粉和19.30mg/g冻干粉。

Claims (7)

1.一种溶血栓豆豉的生产方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)大豆的前发酵
a.将大豆清洗后，室温浸泡12h～15h，大豆与浸泡水的质量体积比为1∶3～5g/mL；
b.对上述浸泡好的大豆进行蒸煮；
c.将蒸煮好的大豆冷却至室温，接入曲霉发酵培养60h～72h；
d.取出发酵好的大豆，洗去豆粒表面的分生孢子和菌丝，干燥，制得豆豉半成品；
(2)大豆的后发酵
e.将步骤(1)制得的豆豉半成品室温浸泡5h～8h，豆豉半成品与浸泡水的质量体积比为1∶1～2g/mL；
f.在浸泡好的豆豉半成品中添加8.0wt％～10.0wt％的葡萄糖，并灭菌；
g.将灭菌后的豆豉半成品冷却至室温，按每100g豆豉半成品接入12～15mL枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养，发酵培养温度为30℃～35℃，培养时间为72h～84h，制得溶血栓豆豉成品；
所述种子液采用如下方法制备：
(1)获取枯草芽孢杆菌：从豆豉中筛选高产豆豉纤溶酶菌株，于-80℃下保存；
(2)按照100mL水中含有葡萄糖1.0g、大豆蛋白胨1.0g、Na2HPO40.2g、NaH2PO40.1g、CaCl20.02g和MgSO40.05g的比例配置种子培养基，种子培养基的pH值为7.0；
(3)种子液制备：将枯草芽孢杆菌转接至营养琼脂斜面培养基，37℃恒温培养过夜，从斜面培养基取一环活化菌种，接入50mL种子培养基中，37℃，200rpm振荡培养14h～16h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中大豆在121℃，0.1MPa下蒸煮30min～40min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中接入曲霉后对大豆进行厚层通风培养，24h后进行翻曲，总的发酵培养时间为60h～72h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中所述干燥为在50℃干燥箱中干燥8h～10h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤d中还将制得的豆豉半成品于-20℃下保存。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤f中灭菌的温度为115℃，时间为20min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g中还对制得的豆豉成品进行真空冷冻干燥16h～18h，粉碎，过60目筛，制得豆豉冻干粉。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102972700B (zh) * 2012-10-29 2014-07-16 韩山师范学院 一种休闲益身细菌型干豆豉的制作方法
CN104770678A (zh) * 2015-04-01 2015-07-15 广西南宁桂知科技有限公司 一种豆豉粉的制备方法
CN104928308B (zh) * 2015-06-19 2018-06-19 湖北真福医药有限公司 溶栓酶基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌以及应用
CN105029252A (zh) * 2015-07-06 2015-11-11 湖北医药学院 一种溶纤维蛋白乳酸菌豆豉的快速生产方法
CN106418210A (zh) * 2016-06-30 2017-02-22 山东凤凰生物有限公司 一种具有溶栓降压功能的风味豆豉及其制备方法
CN107950900A (zh) * 2017-12-19 2018-04-24 黑龙江省中医药科学院 一种高纤溶活性复合豆豉的制备方法
CN109363133A (zh) * 2018-12-10 2019-02-22 山东天博食品配料有限公司 一种豉香鱼膏及其制备方法
CN109363134A (zh) * 2018-12-10 2019-02-22 山东天博食品配料有限公司 一种豉香鸡膏及其制备方法
CN115005433A (zh) * 2022-07-19 2022-09-06 湖北真福医药有限公司 一种具有美容养颜功效的枯草杆菌纤溶酶组合物、制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1986775A (zh) * 2006-12-25 2007-06-27 浙江大学 适用于淡豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株
CN1986776A (zh) * 2006-12-25 2007-06-27 浙江大学 适用于细菌型豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株
CN1985651A (zh) * 2006-12-25 2007-06-27 浙江大学 生产豆豉的纯种发酵工艺

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1986775A (zh) * 2006-12-25 2007-06-27 浙江大学 适用于淡豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株
CN1986776A (zh) * 2006-12-25 2007-06-27 浙江大学 适用于细菌型豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株
CN1985651A (zh) * 2006-12-25 2007-06-27 浙江大学 生产豆豉的纯种发酵工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王希春.固态发酵高溶栓活性豆豉及其抗氧化特性的研究.《江南大学硕士学位论文》.2007,1-45. *
范晓丹，等.产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化.《华南理工大学学报（自然科学版）》.2007,第35卷(第4期),91-94.
范晓丹等.产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化.《华南理工大学学报(自然科学版)》.2007,第35卷(第4期),91-94. *

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