CN102732433B - 一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法，可有效解决断奶仔猪对现有饲料难以消化吸收，引起超敏反应的问题。本发明菌株为黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6027；所产的复合酶包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶。利用该菌株制备复合酶的方法包括菌种活化，二级种子的获得，固体发酵罐中发酵培养。本发明制备成本低，原料丰富易得，节能环保，生产的断奶仔猪用复合酶添加到仔猪饲料中，能改善饲料利用率并提高仔猪生产性能，促进健康生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法。
背景技术
随着养猪业向集约化、规模化方向发展，仔猪早期断奶已成为养猪生产中普遍采用的重要手段，是国内外养猪生产中普遍关注的先进技术，它能提高母猪的繁殖率，减少疾病由母体向仔猪的传播，并能提高生长期的生产性能和胴体品质。但随之而来的早期断奶综合症给养猪生产带来较大损失，仔猪早期断奶时受心理、环境及营养应激影响，常表现为食欲差、消化功能紊乱、腹泻，由此导致生长迟滞、饲料利用率低等所谓“仔猪早期断奶综合症”，这一问题迄今还没有得到彻底解决。研究者一直在寻找仔猪断奶综合症发生的病因，最近二十来年的研究表明，其引发因素主要是营养应激，日粮因素才是导致仔猪腹泻的主要原因，为满足仔猪生长快、代谢快的生理需求，仔猪日粮一般具备高蛋白、高营养的特点，断奶初期，仔猪消化器官及酶系统发育不完全，內源酶酶活性低，使日粮中营养物质的消化吸收进一步降低，过多的大分子蛋白质、淀粉、木聚糖等物质涌入肠道，引起超敏反应，使肠道受到损伤，最终导致仔猪腹泻。为了有效缓解这种症状，在配制仔猪饲粮时在仔猪饲料中恰当地选择和应用仔猪用复合酶制剂是非常必要的。应用单菌种进行固态发酵产生多种酶系，包括消化酶类蛋白酶、淀粉酶和非淀粉多糖酶类木聚糖酶，减少了单酶复配酶种之间相互拮抗作用，降低了酶饲用成本，在早期断奶仔猪饲料中添加酶制剂，既能改善饲料利用率和提高仔猪生产性能，且无毒、无副作用、无残留，不仅能全面促进饲粮养分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除饲料抗营养因子的有害作用，提高仔猪的生产性能和增进健康。饲用酶制剂的研究开发和推广使用是生物技术在饲料工业中应用的一个引人瞩目的领域，这使饲料工业高效、环保和可持续发展成为可能。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的就是提供一种产复合酶的菌株及其制备断奶仔猪用复合酶的方法，可有效解决断奶仔猪对现有饲料难以消化吸收，引起断奶仔猪的超敏反应，使肠道受到损伤，最终导致仔猪腹泻的问题。
本发明的技术方案是，一种产复合酶的菌株，其分类命名为黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6027；所述的复合酶为包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的断奶仔猪用复合酶；
利用该菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，包括以下步骤：
（1）从斜面保藏培养基上取黑曲霉菌菌株接种到一级种子培养基上，在28～32℃下，培养72h～96h，进行菌种活化，得活化的菌株；
（2）将活化的菌株从一级种子培养基上接种到二级种子培养基上，在28～32℃下，培养65h～84h，得二级种子；
（3）将二级种子接种到固体发酵罐中的发酵培养基上，在相对湿度为90%以上，温度为29℃的条件下，发酵培养24～32h，发酵结束后，得包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶，并对酶活性进行测定；
所述的斜面保藏培养基由以下重量计的：NaNO3 3.0g，KCL 0.5g，FeSO4·7 H2O 0.01g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蔗糖30.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000mL制成；所述的一级种子培养基由以下重量计的：黄豆1000g、MgSO4·7H2O 0.5g、可溶性淀粉2.0g、KH2PO4 1.0g、(NH4 )SO4 0.5g、琼脂15.0 g，蒸馏水1000mL制成；所述的二级种子培养基由以下重量计的：麸皮950g，豆粕粉50g，水1000mL制成； 所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮50～70Kg，小麦面粉5～10Kg，豆粕粉20～40Kg，玉米芯粉5～10Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
本发明利用微生物菌株发酵，生产复合酶，成本低，原料丰富易得，节能环保，生产的断奶仔猪用复合酶添加到仔猪饲料中，既能改善饲料利用率和提高仔猪生产性能，且无毒、无副作用、无残留，不仅能全面促进饲粮养分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除饲料抗营养因子的有害作用，提高仔猪身体素质，促进健康生长。
附图说明
图1为实施例1中CGMCC No.6027菌株在100L固体发酵罐中发酵产酶过程曲线。
生物材料样品保藏
一株产包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶的菌株，该菌株为黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6027，保藏时间为2012年4月23日。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明的技术方案是，一种产复合酶的菌株，其分类命名为黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6027；所述的复合酶为包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的断奶仔猪用复合酶；
利用该菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，包括以下步骤：
（1）从斜面保藏培养基上取黑曲霉菌菌株接种到一级种子培养基上，在28～32℃下，培养72h～96h，进行菌种活化，得活化的菌株；（2）将活化的菌株从一级种子培养基上接种到二级种子培养基上，在28～32℃下，培养65h～84h，得二级种子；（3）将二级种子接种到固体发酵罐中的发酵培养基上，在相对湿度为90%以上，温度为29℃的条件下，及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度，发酵培养24～32h，发酵结束后，得包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶，并对酶活性进行测定；
所述的斜面保藏培养基由以下重量计的：NaNO3 3.0g，KCL 0.5g，FeSO4·7 H2O 0.01g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蔗糖30.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000mL制成；所述的一级种子培养基由以下重量计的：黄豆1000g、MgSO4·7H2O 0.5g、可溶性淀粉2.0g、KH2PO4 1.0g、(NH4 )SO4 0.5g、琼脂15.0 g，蒸馏水1000mL制成；所述的二级种子培养基由以下重量计的：麸皮950g，豆粕粉50g，水1000mL制成； 所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮50～70Kg，小麦面粉5～10Kg，豆粕粉20～40Kg，玉米芯粉5～10Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
以麸皮和小麦面粉质量比以9:1复配作为培养基碳源时发酵产蛋白酶的活力较高。
以豆粕粉作为氮源时发酵产蛋白酶的活力较高。
以麸皮和小麦面粉作为碳源、豆粕粉作为氮源、玉米芯粉作为疏松填充料（酶载体），添加适量无机盐MgSO4·7H2O，K2HPO4组成的培养基时，发酵产蛋白酶的活力较高。
本发明所述产复合酶的菌株在制备断奶仔猪用复合酶中，可由以下实施例实现。
实施例1
黑曲霉菌株CGMCC No.6027在100L固体发酵罐中发酵产酶，从斜面保藏培养基斜面上接一环CGMCC No.6027菌种入一级种子培养基斜面上，进行菌种活化，在28～32℃，培养时间为72h～96h后，从一级种子培养基斜面上接三环一级种子菌种入二级种子培养基（二级种子培养基60g/1000mL三角瓶），在28～32℃，培养时间为65h～84h后，以发酵培养基重量0.2%的接种量接入到100L固体发酵罐中的发酵培养基上。100L固体发酵罐中发酵培养基为50Kg，温度为29℃，相对湿度为90%以上，发酵时间24～32h。及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度。发酵设备为镇江东方生物工程设备技术有限责任公司SF-100A 固态发酵罐。发酵结束时，蛋白酶酶活力最高值为3800μ/g，淀粉酶酶活力最高值为121μ/g，木聚糖酶酶活力最高值为6300μ/g。
所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮54Kg,小麦面粉6 Kg,豆粕粉35 Kg,玉米芯粉5 Kg, MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
实施例2
黑曲霉菌株CGMCC No.6027在100L固体发酵罐中发酵产酶，从斜面保藏培养基斜面上接一环CGMCC No.6027菌种入一级种子培养基斜面上，进行菌种活化，在28～32℃，培养时间为72h～96h后，从一级种子培养基斜面上接三环一级种子菌种入二级种子培养基（二级种子培养基60g/1000mL三角瓶），在28～32℃，培养时间为65h～84h后，以发酵培养基重量0.2%的接种量接入到100L固体发酵罐中的发酵培养基上。100L固体发酵罐中发酵培养基为50Kg，温度为29℃，相对湿度为90%以上，发酵时间24～32h。及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度。发酵设备为镇江东方生物工程设备技术有限责任公司SF-100A 固态发酵罐。发酵结束时，蛋白酶酶活力最高值为3700μ/g，淀粉酶酶活力最高值为110μ/g，木聚糖酶酶活力最高值为6270μ/g。
所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮50Kg，小麦面粉10Kg，豆粕粉40Kg，玉米芯粉10Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
实施例3
黑曲霉菌株CGMCC No.6027在100L固体发酵罐中发酵产酶，从斜面保藏培养基斜面上接一环CGMCC No.6027菌种入一级种子培养基斜面上，进行菌种活化，在28～32℃，培养时间为72h～96h后，从一级种子培养基斜面上接三环一级种子菌种入二级种子培养基（二级种子培养基60g/1000mL三角瓶），在28～32℃，培养时间为65h～84h后，以发酵培养基重量0.2%的接种量接入到100L固体发酵罐中的发酵培养基上。100L固体发酵罐中发酵培养基为50Kg，温度为29℃，相对湿度为90%以上，发酵时间24～32h。及时开通无菌空气调节系统和全雾化补水系统，实现温度自控和保持湿度。发酵设备为镇江东方生物工程设备技术有限责任公司SF-100A 固态发酵罐。发酵结束时，蛋白酶酶活力最高值为3750μ/g，淀粉酶酶活力最高值为117μ/g，木聚糖酶酶活力最高值为6180μ/g。
所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮70Kg，小麦面粉5Kg，豆粕粉20Kg，玉米芯粉5Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
本发明方法简单，生产周期短，成本低，原料丰富易得，节能环保，易于生产，应用效果好，并经试验取得了满意的效果，有关试验资料如下：
采用以下分析方法对所得复合酶的活性进行测定：
A.酸性蛋白酶分析方法：福林-酚试剂法测定。
A.1 试剂
A.1.1 福林试剂
于2000mL磨口回流装置中，加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100.0g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25.0g,蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10小时，取出冷凝器，加入硫酸锂(LiSO4)50.0g，蒸馏水50mL混匀，加入几滴溴水，再煮沸5分钟，以驱逐残溴及除去颜色，溶液呈黄色而非绿色。若仍有绿色，需再加几滴溴液再煮沸除去。冷却后，定容至1000mL，细菌漏斗（NO.4～5）过滤，置于棕色瓶中保存，此溶液使用时，加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。
A.1.2 0.4mol Na2CO3溶液：称取无水Na2CO342.4g，定容至1000mL。
A.1.3 0.4mol三氯乙酸（TCA）溶液：称取三氯乙酸65.4g，定容至1000mL。
A.1.4 0.05mol pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液：
a液：称取80%—90%的乳酸10.6g，加蒸馏水稀释定容至1000mL。
b液：称取70%乳酸钠16g，加水稀释定容至1000mL。
取a液16mL和b液1mL混合稀释1倍即成。
A.1.5 2%酪蛋白溶液
称取干酪素2.000g，精确至0.002g，加入浓乳酸10mL，在水浴中加热使溶解（必要时，用小火加热煮沸）。然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至100mL即成。配制后，放入冰箱内保存。
A.1.5 100ug/mL酪氨酸溶液
精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为1000μg/mL。再吸取此溶液10mL，以0.2N盐酸定容至100mL，即成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后应及时使用或放入冰箱保存，以免繁殖细菌而变质。
A.2 标准曲线绘制
按表1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
表1 配制不同浓度的酪氨酸浓度
取6支试管编号按分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4 mol Na2CO3溶液5ml，再各加入已稀释的福林试剂1mL，摇匀置于水浴锅中40℃保温发色20min，在581-G型光电比色计上分别测定光密度（OD）（滤光片用65#）或72型分光光度计进行测定（波长660nm）。一般测3次，取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD值，以净OD值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，绘制成标准曲线并求出其回归方程。
A.3 样品测定
A.3.1 待测酶液的制备
称取样品1g～2g(精确至0.0001g)，先用少量pH2.5的乳酸-乳酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒搅拌，将上清液倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再用pH2.5的乳酸-乳酸钠缓冲液溶解。如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用pH2.5的乳酸-乳酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀，用滤纸过滤，滤液供额定测定用。
A.3.2 样品测定
取15mm×100mm试管3支，编号1、2、3（作2支也可），每管内加入样品稀释液1ml，置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min，时间到后，立即再加入0.4ml/L三氯乙酸2ml，以终止反应。继续于水浴中保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后离心（或过滤），然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入滤液1ml，再加0.4mol Na2CO3溶液5ml，已稀释的福林试剂1mL，摇匀，40℃保温发色20min，再进行光密度(0D)测定。
空白试验也取试管3支，编号(1)、（2）、（3），测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2ml，使酶失活，再加入酪蛋白。
A.3.3 计算
酸性蛋白酶酶活力定义：在40℃、PH2.5条件下,每分钟水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸所需的酶量,定义为一个蛋白酶活力单位。
样品酶活力单位=(4/10)K×A×N；
式中：4/10——4为反应液总面积（mL），10为反应时间（min）；K——标准曲线斜度率常数；A——660nm 光密度；N——稀释倍数；
B.淀粉酶酶分析方法
B.1 试剂
B.1.1 0.2mol 醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.8）
称取醋酸钠16.06g，冰醋酸4.92mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL。
B.1.2 3，5-二硝基水杨酸显色液（DNS）
取酒石酸钾钠182.0g，溶于500mL 蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温保存，放置10d 后使用。
B.1.3 1% 可溶性淀粉液
称取1g（精确至0.0001g）可溶性淀粉，先用少量缓冲液溶解后，徐徐倾入已煮沸的缓冲液中，继续煮沸透明冷却后用缓冲液定至100mL，冰箱保存备用。
B.1.4 1% 葡萄糖标准液
称取1.000g（精确至0.001g）分析纯葡萄糖（预先在105℃ 干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解并定至100mL，冰箱保存备用。
B.2 葡萄糖标准曲线的绘制
分别吸取B.1.4标准葡萄糖液1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL 定容于100mL 容量瓶中，每1mL分别含有葡萄糖0.100mg，0.200mg，0.300mg，0.400mg，0.500mg，0.600mg 的标准液。各取不同溶度标准溶液0.5 mL于试管中，加蒸馏水1.5mL，DNS 试剂3mL，沸水浴中沸腾7min（样品放入后重新沸腾时算起），取出后即加入蒸馏水10mL，混匀，冷却后，在分光光度计540nm 处比色，以所得的吸光度（OD值）为横坐标，以对应的标准葡萄糖液浓度的值（即0.100mg/mL，0.200mg/mL，0.300mg/mL，0.400mg/mL，0.500mg/mL，0.600mg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线并求出其回归方程。
空白制作：以0.5mL 蒸馏水代替0.5mL 标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。
B.3 样品测定
B.3.1 待测酶液的制备
称取样品1～2g（精确至0.0001g），先用少量0.2mol（pH4.8）醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清夜倾入适应的容量瓶中，沉渣部分再用少量上述缓冲液溶解，如此反复捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定至刻度，摇匀后用滤纸过滤，滤液供测定用。
B.3.2 测定
取0.5mL 适当稀释的酶液加1.5mL 1% 可溶性淀粉液，50℃ 水浴保温0.5h，立即加入3mL DNS，在沸水中煮沸7min，冷却后加蒸馏水10mL 混匀，冷却后，在分光光度计540nm 处比色，测定光密度（OD）值。
空白试验以0.2mol（pH4.8）醋酸-醋酸钠缓冲液代替稀释的酶液做对照，其它操作同上。
B.3.3 计算
淀粉酶酶活力定义：在50℃，pH4.8条件下，每分钟水解可溶性淀粉产生1mg 还原糖所需的酶量，定义为一个淀粉酶酶活力单位。
样品酶活力单位=(K×A)×N；
K——葡萄糖标准曲线斜率常数；A——540nm 吸光度；N——稀释倍数。
C.木聚糖酶分析方法
C.1 试剂
C.1.1 0.2 mol柠檬酸缓冲液(pH5.0)
甲液：称取7.16gNa2HPO4·12H2O溶于水中，定容至100mL。
乙液：称取2.1g柠檬酸溶于水中，定容至100mL。
取甲液24.3ml、乙液25.7ml混匀即可。
C.1.2 2%木聚糖溶液
准确称取2.000g 木聚糖(sigma公司生产） ,先用适量的缓冲液(C.1.1)溶解,在沸水浴中加热,使其完全溶解,冷却后移入100ml容量瓶,用上述缓冲液定容至100ml，贮存于冰箱中备用。
C.1.3 3，5—二硝基水扬酸显色液（DNS）
取酒石酸钾钠182.0g，溶于500mL 蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温保存，放置10d 后使用。
C.1.4 0.1%标准木糖溶液
准确称取100mg分析纯木糖(预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重)，用少量蒸馏水溶解，定溶至100ml，冰箱保存。
C.2 木糖标准曲线绘制
表2配制各种不同浓度的木糖溶液
| 步骤与编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 标准木糖溶液（mg/mL） | 0 | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.30 | 0.35 | 0.35 | 0.40 |
| 蒸馏水（mL） | 5 | 2.50 | 2.45 | 2.40 | 2.35 | 2.30 | 2.25 | 2.20 | 2.15 | 2.10 |
| DNS （mL） | 0 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 | 2.50 |
| 煮沸5min | ||||||||||
| OD值 |
按上表操作，用721型分光光度计，530nm处测定OD值，以OD值为横坐标，标准木糖含量为纵坐标绘制标准曲线并求出其回归方程。
C.3 样品测定
C.3.1 待测酶液的制备
称取样品1～2g（精确至0.0001g），先用少量0.2mol柠檬酸缓冲液(pH5.0)溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清夜倾入适应的容量瓶中，沉渣部分再用少量上述缓冲液溶解，如此反复捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定至刻度，摇匀后用滤纸过滤，滤液供测定用。
C.3.2 测定
取小试管（15×150mm），加2%木聚糖溶液（C.1.2）2.0mL，于50℃水浴中预热2—3min，加酶液0.5mL，保温0.5h，取出后立即加入3，5—二硝基水杨酸显色液2.5mL，沸水浴中煮沸5min，冷却后测OD值。
另取小试管加2%木聚糖溶液（C.1.2）2.0mL，先加入3，5—二硝基水杨酸显色液2.5mL，再加酶液0.5mL，50℃保温0.5h，煮沸5min，冷却后作为空白对照液侧OD值。
比色时，可以以蒸馏水作对照，调节零点，由净OD值查出标准曲线上的葡萄糖量。
C.3.2 计算
木聚糖酶酶活力定义：在PH5.0，50℃条件下，每分钟能水解木聚糖生成1μg木糖所需的酶量，称为一个木聚糖酶酶活力单位。
木聚糖酶酶活力（X）按式（1）计算
X=1000NG/（2/100×0.5×30）
式中：G —标准曲线上查得的木糖量；N——稀释倍数。
实验1本发明所产复合酶在断奶仔猪养殖中的应用试验
试验选择（杜×长×大）三元杂交断奶仔猪72头，健康、体重相近（7.8Kg左右）随机分为3个处理组，每个处理组设4个重复，每个重复6头试验断奶仔猪。3个处理组为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组，对照组饲喂常规基础日粮；试验Ⅰ组饲喂常规基础日粮+0.02%断奶仔猪用复合酶；试验Ⅱ组饲喂常规基础日粮+0.05%断奶仔猪用复合酶。试验期内采用常规的饲养管理和药物防疫程序，自由采食和饮水，每天清洗猪舍一次。试验开始时先进入7d的预试期，预试期内完成编号等准备工作，正式试验期为21d。
基础日粮组成（%）：玉米63；豆粕；乳清粉4；鱼粉4；植物油2；磷酸氢钙1.5；石粉0.75；食盐0.25；赖氨酸0.35；蛋氨酸0.15；预混料1。营养水平：消化能（MJ/kg）13.80；粗蛋白（%）18.0；钙（%）0.9；有效磷（%）0.7。
试验结果：
表3 复合酶对断奶仔猪生产性能的影响
| 项目 | 对照组 | 试验Ⅰ组 | 试验Ⅱ组 |
| 日增重/g | 391±43 a | 401±59 a | 432±65 b |
| 日采食量/g | 750±36 | 755±56 | 762±56 |
| 料重比 | 1.92±0.05 a | 1.88±0.04 a | 1.76±0.04 b |
| 腹泻率（%） | 2.04±0.04 a | 1.97±0.04 a | 1.77±0.02 b |
注：同行数据含相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异显著（P<0.05）。
本发明的有益效果：所提供的复合酶产生菌CGMCC No.6027，能以麸皮和小麦面粉作为碳源、豆粕粉作为氮源、玉米芯粉作为疏松填充料（载体）的发酵培养基上发酵产生适用于断奶仔猪养殖应用的具有高蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶活力的复合酶，发酵所需原料为农副产品，价廉易得，降低了生产、养殖成本。在100L固体发酵罐中发酵产酶，我们生产的断奶仔猪用复合酶发酵周期32小时左右，与我国目前大部分厂家生产复合酶发酵周期相比，培养时间大幅度缩短。
实验2不同碳源对本发明菌株产酶的影响
分别选取不同碳源，研究不同碳源对黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11即CGMCC No.6027产蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的影响，结果见表4。
表4 不同碳源对CGMCC No.6027产酶的影响
| 碳源 | 蛋白酶相对酶活（%） | 淀粉酶相对酶活（%） | 木聚糖酶相对酶活（%） |
| 麸皮+小麦面粉 | 100 | 100 | 100 |
| 麸皮 | 94 | 92 | 105 |
| 小麦面粉 | 33 | 35 | 37 |
| 玉米面粉 | 32 | 33 | 29 |
| 淀粉 | 32 | 34 | 20 |
从结果中可以看出，以麸皮和小麦面粉质量比以9:1复配作为培养基碳源时发酵产蛋白酶的活力较高。
实验3不同氮源对本发明菌株产酶的影响
以麸皮和小麦面粉质量比9:1复配作为培养基碳源，在其它条件相同的条件下，添加适量的（NH4）2SO4、尿素、NH4Cl、NaNO3、豆粕粉、蛋白胨为实验氮源，进行固态发酵实验，分别测其各项酶活力，观察CGMCC No.6027产蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的影响，结果如表5。
表5不同氮源对CGMCC No.6027产酶的影响
| 氮源 | 蛋白酶相对酶活（%） | 淀粉酶相对酶活（%） | 木聚糖酶相对酶活（%） |
| （NH4）2SO4 | 75 | 89 | 65 |
| 尿素 | -- | -- | -- |
| NH4Cl | 41 | 55 | 50 |
| NaNO3 | 45 | 60 | 52 |
| 豆粕粉 | 100 | 100 | 100 |
| 蛋白胨 | 53 | 46 | 79 |
从结果中可以看出，以豆粕粉作为培养基氮源时发酵产蛋白酶的活力较高。
本发明利用微生物菌株发酵，生产复合酶，周期短，成本低，原料丰富易得，节能环保，生产的断奶仔猪用复合酶添加到仔猪饲料中，既能改善饲料利用率和提高仔猪生产性能，且无毒、无副作用、无残留，不仅能全面促进饲粮养分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除饲料抗营养因子的有害作用，提高仔猪身体素质，促进健康生长。
Claims (4)
1.一种产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从斜面保藏培养基上取产复合酶的黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11的菌株接种到一级种子培养基上，在28～32℃下，培养72h～96h，进行菌种活化，得活化的菌株；所述的黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCC No.6027的黑曲霉菌（Aspergillus niger）HKS11，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
（2）将活化的菌株从一级种子培养基上接种到二级种子培养基上，在28～32℃下，培养65h～84h，得二级种子；
（3）将二级种子接种到固体发酵罐中的发酵培养基上，在相对湿度为90%以上，温度为29℃的条件下，发酵培养24～32h，发酵结束后，得包括蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的复合酶，并对酶活性进行测定；
所述的斜面保藏培养基由以下重量计的：NaNO3 3.0g，KCL 0.5g，FeSO4·7 H2O 0.01g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蔗糖30.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000mL制成；
所述的一级种子培养基由以下重量计的：黄豆1000g、MgSO4·7H2O 0.5g、可溶性淀粉2.0g、KH2PO4 1.0g、(NH4 )2SO4 0.5g、琼脂15.0 g，蒸馏水1000mL制成；
所述的二级种子培养基由以下重量计的：麸皮950g，豆粕粉50g，水1000mL制成；
所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮50～70Kg，小麦面粉5～10Kg，豆粕粉20～40Kg，玉米芯粉5～10Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
2.根据权利要求1所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮54Kg,小麦面粉6 Kg,豆粕粉35 Kg,玉米芯粉5 Kg, MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
3.根据权利要求1所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮50Kg，小麦面粉10Kg，豆粕粉40Kg，玉米芯粉10Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
4.根据权利要求1所述的产复合酶的菌株制备断奶仔猪用复合酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基由以下重量计的：麸皮70Kg，小麦面粉5Kg，豆粕粉20Kg，玉米芯粉5Kg，MgSO4·7H2O 0.05Kg，K2HPO4 0.1Kg，水100L制成。
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