CN101591619B

CN101591619B - 黑曲霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN101591619B
Application number: CN2009100885663A
Authority: CN
Inventors: 高秀华; 王海燕; 张铁涛; 丁宏标; 乔宇
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2029-07-03
Also published as: CN101591619A

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉菌株及其应用。具体该黑曲霉菌株，为黑曲霉A46CGMCC №.3084。该菌株可以同时高产木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶等，可生产动物饲喂用复合酶，该复合酶中的各种酶活最适pH在4～6之间，适应动物胃肠道的需要。这种饲用复合酶可以广泛应用在畜禽饲料中，能够降低抗营养因子，提高消化率，具有良好的经济效益，同时也有利于保护生态环境，推动畜牧业的健康发展。

Description

黑曲霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株黑曲霉菌株及其应用，特别涉及一种黑曲霉菌株及其制备酶制剂中的应用。

背景技术

酶制剂作为一种安全高效的生物催化剂可以提高畜禽和水产动物的生产性能；通过消除饲料中的抗营养因子，酶制剂能够提高饲料原料特别是非常规饲料原料的利用率，开发新的饲料资源，对缓解饲料资源短缺具有巨大的作用；同时，酶制剂通过提高营养物质特别是氮和磷的消化利用，可以有效的减少由于饲料中某些营养成分大量排放造成的养殖业环境污染。因此，饲料酶制剂一直是近年来国内外动物营养研究的热点之一，也是生物技术在饲料工业和养殖业应用最活跃的领域。

因为每一种酶都具有专一性，所以在饲料工业中一般不单独添加某一种酶制剂，而是添加复合酶制剂。在发达国家，大多通过单一酶复配的方法制备复合酶制剂，存在成本高、酶系不全，难以满足复杂的饲料成分的需要。我国研究和应用较多的是对单一菌株进行固态发酵来生产复合酶。固态发酵的底物基本上都是农副产品(主要是麦麸、豆粕等)，廉价易得，底物的诱导效应使得发酵产生的酶系具有很好的针对性，其在饲料中的实际应用效果往往优于液态发酵生产的酶；发酵所需要的设备简单、生产耗能低；后处理简单，发酵产物无需提取等复杂的后处理即可直接作为饲料添加剂使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑曲霉菌株及其应用。

本发明的黑曲霉菌株，为黑曲霉菌株(Aspergillus niger)A46。

上述黑曲霉菌株(Aspergillus niger)A46，已于2009年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3084。

该菌株在察氏培养基上生长迅速，25℃培养7天直径达40-50毫米，菌落蔓延迅速，初为白色，后变成淡黄色、浅棕色直至黑褐色厚绒状，边缘圆形、整齐；菌落正面有大量的分生孢子，褐黑色，无渗出液；菌落背面无色或中央略带黄褐色。

本发明提供的黑曲霉菌株的应用是黑曲霉菌株(Aspergillus niger)A46CGMCC№.3084在制备复合酶中的应用，特别是在制备动物饲喂用复合酶中的应用。所述复合酶中包括木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和β-甘露聚糖酶。

所述制备复合酶的方法是将黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084进行固体发酵得到含复合酶的产物。所述制备复合酶的方法是将黑曲霉菌株A46CGMCC№.3084的孢子悬浮液接种于固体发酵培养基上于28-32℃、85％相对湿度条件下培养3-4天，将获得的发酵产物在40-45℃鼓风干燥，粉碎，得到发酵产物饲用复合酶。

所述固体发酵培养基含有麦麸75％、玉米芯粉10％、豆粕粉10％、(NH₄)₂SO₄3％、KH₂PO₄2％，培养基含水量为50％；所述百分含量为质量百分含量。

所述黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084的孢子悬浮液的获得方法为：

1)将黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084接种至察氏培养基(蔗糖3.0％、NaNO30.3％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KCl 0.05％、FeSO₄0.001％、琼脂2.0％，自然pH，经121℃灭菌30min，所述百分含量(％)为质量百分含量)或马铃薯葡萄糖培养基培养基(PDA)上，28-30℃培养4天获得一级种子；

2)将一级种子接种至三角瓶固体培养基(培养基含有麦麸75％、玉米芯粉10％、豆粕粉10％、(NH₄)₂SO₄3％、KH₂PO₄2％，培养基含水量为50％；所述百分含量为质量百分含量)，28-30℃培养3-4天至形成大量黑褐色孢子，加入无菌水浸泡、充分振荡制成黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084孢子悬浮液。

本发明还提供一种动物饲喂用复合酶制剂，其活性成分为黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084的发酵产物。

本发明的黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084可以同时高产木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶等，从而形成一种针对饲料原料的多酶复合体系，即可生产饲用复合酶)，且该复合酶中的各种酶活最适pH在4～6之间，适应动物胃肠道的需要。这种饲用复合酶可以广泛应用在畜禽饲料中，能够降低抗营养因子，提高消化率，具有良好的经济效益，同时也有利于保护生态环境，推动畜牧业的健康发展。

本发明黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084可采用固体发酵生产高效廉价的饲用复合酶制剂，该流程中涉及一级种子培养、二级种子培养、固态发酵及简单的后处理。所用固态发酵培养基原料来源广泛成本低，工艺简单；具有生产成本低、产品酶系全且活力高的特点。

本发明菌株是黑曲霉诱变筛选得到，黑曲霉为国家卫生部和FDA公布的食品安全菌株，不存在安全性问题，因此，本发明黑曲霉菌株A46CGMCC №.3084用于制备饲用复合酶安全可靠。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1、高产饲用复合酶的黑曲霉菌株A46菌株的获得及其功能验证

一、高产饲用复合酶的黑曲霉菌株A46菌株的获得

1、菌株诱变

将黑曲霉菌株(Aspergillus niger)CGMCC 3.316(购自中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心)接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDA)斜面上，28℃培养3～4天至孢子成熟，将长好的孢子用适量无菌生理盐水洗下，移入加有玻璃珠的三角瓶中，28℃摇床振荡4～5h，以打散孢子并使之活化。用四层无菌擦镜纸过滤除去菌丝片段，将孢子滤液用适量的生理盐水稀释，用血球计数板镜检查孢子浓度，用生理盐水调节孢子浓度为10⁶～10⁷个/ml，得到最终诱变用的孢子悬液。取10ml孢子悬液加入直径9cm的培养皿中，用黑纸覆盖。

调节紫外灯与培养皿距离20cm，开启紫外灯(20W)预热30min。预热完成后向培养皿中加入磁力搅拌子，开始搅拌的同时打开培养皿盖，紫外灯照射30sec后停止照射，在红光灯下将诱变处理的孢子悬液收集到50ml诱导培养基中，培养基盛放在黑纸包裹的250ml三角瓶中。28℃、170rpm震荡培养。每间隔4～5h，用四层无菌擦镜纸过滤去除已萌发的菌丝，然后继续培养。如此反复3～4次之后将滤液离心收集孢子，用少量生理盐水重悬，涂布于含有PDA培养基平板上，28℃避光培养3～4天。

用无菌牙签挑取在平板上长势良好的菌落，接种到PDA斜面上，分别给每个菌株编号，置28℃培养3～4天，4℃保存备用。

2、诱变菌株筛选

将以上获得的变异菌株进行三角瓶产酶发酵试验，测定产酶能力，以木聚糖酶产量为主要检测指标。培养基配比(干物质计算)：麦麸75％(质量含量)、玉米芯粉10％(质量含量)、豆粕粉10％(质量含量)、(NH₄)₂SO₄3％(质量含量)、KH₂PO₄2％(质量含量)，培养基含水量50％(质量含量)，自然pH。培养基分装在250ml三角瓶中，装料量30g/瓶。在121℃灭菌30min，冷却后接种斜面菌种孢子液1mL，充分混合均匀，于28℃培养4天。

发酵结束后，将培养物置于培养皿中40℃鼓风条件下烘干5-6小时，粉碎，取0.5克溶于20mL水中，室温140rpm震荡1小时，4℃冰箱静置3小时，4层纱布过滤，滤液4℃5000rpm离心10分钟，所得上清即为粗酶液，用于酶活力测定。测定酶活力包括：木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶，以木聚糖酶产量为主要检测指标进行筛选，获得高产黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，将其命名为A46。

酶活测定方法为：

1)酶活力定义：

木聚糖酶活力：在40℃和pH5.5条件下，每分钟从浓度为20mg/ml的木聚糖溶液中水解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力：在40℃和pH5.5条件下，每分钟从浓度为10mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中水解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

果胶酶活力：在40℃和pH5.5条件下，每分钟从浓度为10mg/ml的果胶溶液中水解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

淀粉酶活力：在40℃和pH5.5条件下，每分钟从浓度为20mg/ml的可溶性淀粉溶液中水解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

β-甘露聚糖酶活力：在40℃和pH5.5条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的刺槐豆胶溶液中水解释放相当于1μmol甘露糖的还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

2)酶活力测定方法：

取0.5克步骤2获得的发酵产物饲用复合酶溶于20mL水中，室温140rpm震荡1小时，4℃冰箱静置3小时，4层纱布过滤，滤液4℃5000rpm离心10分钟，所得上清即为饲用复合酶粗酶液。测定酶活时用蒸馏水进行粗酶液适当稀释。取四支具塞试管，分别在三支(三个重复)中加入0.1ml稀释的饲用复合酶液粗酶液，第四支试管中加入0.1ml经煮沸5min的灭活酶液作为对照，与用pH5.5的0.2mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的底物(具体底物和底物浓度见步骤1)所述的各种酶活力定义)一起于40℃水浴中预热5min；在各试管中加入0.1ml底物，40℃精确反应30min，反应完成后在四支试管中加入0.6mlDNS试剂，摇匀，煮沸10min灭活显色，迅速冷却到室温，用水定容到5.0ml，在550nm波长下测定吸光度。调整饲用复合酶粗酶液的稀释倍数(用蒸馏水稀释)，使测定的吸光度数值在标准曲线测定范围之内。

上述黑曲霉(Aspergillus niger)A46菌株，已于2009年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3084。

3、黑曲霉菌株A46的培养学特性

将黑曲霉菌株A46接种到察氏培养基(蔗糖3.0％、NaNO₃0.3％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KCl 0.05％、FeSO₄0.001％、琼脂2.0％，经121℃灭菌30min，“％”表示质量百分含量)上观察其培养学特性，结果表明黑曲霉菌株A46菌落在察氏培养基上生长迅速，25℃培养7天直径达40-50毫米，菌落蔓延迅速，初为白色，后变成淡黄色、浅棕色直至黑褐色厚绒状，边缘圆形、整齐；菌落正面有大量的分生孢子，褐黑色，无渗出液；菌落背面无色或中央略带黄褐色。

二、黑曲霉A46菌株的产酶特性

按照上述步骤2“酶活力测定方法”进行发酵产物酶活力测定，该菌种一次发酵可同时产生木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶等多种酶，并且所产酶活性较高。

以木聚糖酶活力为研究对象，检测了该酶活的适宜反应条件，其适宜反用温度范围为40-55℃，最适反应温度为50℃，低于35℃或高于60℃酶活力迅速下降；适宜作用pH为3.5-5.5，最适反应pH为4-4.5。综合以上情况，木聚糖酶的适宜反应温度40-55℃，适宜反应pH范围pH3.5-5.5，与动物消化道环境基本吻合，适合作为饲料添加剂使用。

三、黑曲霉A46菌株在制备饲用复合酶中的应用及其效果验证

1、固体发酵黑曲霉A46菌株制备饲用复合酶

将黑曲霉A46菌株以麦麸为主要原料发酵生产木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶等饲用复合酶的固体发酵方法为：

1)一级种子的获得：从原始PDA斜面保存黑曲霉A46菌株菌种接种至察氏培养基(蔗糖3.0％、NaNO₃0.3％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KCl 0.05％、FeSO₄0.001％、琼脂2.0％，经121℃灭菌30min，“％”表示质量百分含量)上，28-30℃培养4天获得一级种子；

2)二级种子的获得：上述获得的一级种子接种至250mL三角瓶固体培养基(培养基含有麦麸75％、玉米芯粉10％、豆粕粉10％、(NH₄)₂SO₄3％、KH₂PO₄2％，培养基含水量为50％；所述百分含量为质量百分含量)，28-30℃培养3-4天至形成大量黑褐色孢子，加入无菌水浸泡、充分振荡制成孢子悬浮液，用于生产接种；

3)固体发酵：发酵培养基为麦麸75％、玉米芯粉10％、豆粕粉10％、(NH₄)₂SO₄3％、KH₂PO₄2％，加水100％，自然pH，121℃灭菌40-60min，冷却后接入0.1％-0.2％的孢子悬浮液(按重量比计算)，于28-30℃、85％相对湿度条件下培养3-4天；

4)后处理：将以上3)获得的固体发酵物在40-45℃鼓风干燥，粉碎，得到发酵产物饲用复合酶。

2、黑曲霉A46产饲用复合酶活力测定

1)酶活力定义：

2)酶活力测定方法：

取0.5克步骤1的步骤4)获得的发酵产物饲用复合酶溶于20mL水中，室温140rpm震荡1小时，4℃冰箱静置3小时，4层纱布过滤，滤液4℃5000rpm离心10分钟，所得上清即为饲用复合酶粗酶液。测定酶活时用蒸馏水进行粗酶液适当稀释。取四支具塞试管，分别在三支(三个重复)中加入0.1ml稀释的饲用复合酶粗酶液，第四支试管中加入0.1ml经煮沸5min的灭活酶液作为对照，与用pH5.5的0.2mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的底物(具体底物和底物浓度见步骤1)所述的各种酶活力定义)一起于40℃水浴中预热5min；在各试管中加入0.1ml底物，40℃精确反应30min，反应完成后在四支试管中加入0.6mlDNS试剂，摇匀，煮沸10min灭活显色，迅速冷却到室温，用水定容到5.0ml，在550nm波长下测定吸光度。调整饲用复合酶粗酶液的稀释倍数(用蒸馏水稀释)，使测定的吸光度数值在标准曲线测定范围之内。

(3)酶活力测定结果：

采用本发明所提供的黑曲霉A46菌株进行固体发酵获得的饲用复合酶含有多种酶活力，在以上测试条件下，每克步骤1获得的饲用复合酶(干重)中木聚糖酶活力可达4473U、纤维素酶活力达到2703U、果胶酶活力达到268U、淀粉酶活力达到516U、β-甘露聚糖酶活力达到887U。

Claims

1.黑曲霉菌株(Aspergillus niger)A46，其保藏号为CGMCC №.3084，保藏日为2009年06月01日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.黑曲霉A46 CGMCC №.3084在制备复合酶中的应用，

所述复合酶为饲用复合酶，所述饲用复合酶由木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和β-甘露聚糖酶组成。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述复合酶的制备方法是将黑曲霉A46 CGMCC №.3084进行固体发酵得到含复合酶的产物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述复合酶的制备方法是将黑曲霉菌株A46 CGMCC №.3084的孢子悬浮液接种于固体发酵培养基上于28-32℃、85％相对湿度条件下培养3-4天，将获得的发酵产物在40-45℃鼓风干燥，粉碎，得到发酵产物复合酶。

5.根据权利要求4所示的应用，其特征在于：所述固体发酵培养基含有麦麸75％、玉米芯粉10％、豆粕粉10％、(NH₄)₂SO₄3％、KH₂PO₄2％；所述固体发酵培养基的含水量为50％，所述百分含量为质量百分含量。