CN102987098A - 一种畜禽用小麦专用复合酶制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种畜禽用小麦专用复合酶制剂及其应用，它包括以下组分：木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、α-半乳糖甘酶、糖化酶、黑曲霉发酵复合酶；添加抗氧化剂、防霉剂、驱虫剂、载体。本发明选用有效降低粘度的木聚糖酶和β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶等单酶配制小麦专用复合酶，不仅比单纯发酵黑曲霉获得复合酶操作简便、劳动量和成本低，且有良好的酶解和降低粘度效果。本发明能有效解决日粮中添加高比例小麦所带来的抗营养作用，降低食糜粘度，提高动物的生产性能，进而帮助饲料企业用好小麦和小麦酶，有效降低饲养成本。

Description

一种畜禽用小麦专用复合酶制剂及其应用

技术领域

本发明属于动物饲料添加剂领域，具体涉及一种畜禽用小麦专用复合酶制剂及其应用。

背景技术

由于全球供求关系及工业用玉米需求量不断上升，玉米价格持续处于高价位，而小麦价格与玉米一直保持200元/吨的差价，其营养成分也较玉米有一定的优势，所以生产优质饲料和降低养殖成本，小麦成为玉米的最佳替代品之一。但也存在一些问题，主要是小麦中非淀粉多糖引起的抗营养问题，而添加酶制剂可很好的解决由于用小麦替代玉米带来的抗营养特性。

麦类饲料中一般含有较多的可溶性非淀粉多糖，主要包括阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、α-半乳糖苷、果胶聚糖等，其中前两者占SNSP的30％，阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖是由β(1-3)和β(1-4)糖苷键连接而成，β-1,3糖苷键改变了β-1,4糖苷键的主链结构，阻止了主链间的相互接近，受这两种键的特性的影响，糖分子内部结构松散，使其可与水结合，增加了消化道内容物的粘性。单胃动物不能分解SNSP，所以它不具备营养作用。而且因为SNSP本身能结合大量的水，使采食动物消化道的食糜体积增大，黏度增加，并形成凝胶，导致养分溶出速度减缓，这会干扰消化酶的功能和吸收作用，影响食糜在小肠中的滞留时间，引起微生物异常繁殖，造成动物生长受阻，降低饲料消化率和代谢能，所以它不仅是一种非营养因子，还是一种抗营养因子。

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。SNSP就是半纤维素的重要组分，含有阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的细胞壁会对动物内源消化酶产生屏蔽作用，包裹着蛋白质、淀粉等内容物，阻止其与消化酶相互作用，从而形成坚固的物理屏障，降低饲料消化率及利用率。研究表明，用小麦完全替代日粮中的玉米，食糜黏度提高了69.23%。高黏性阻止了营养物质与内源酶的接触，降低了食糜内糖、氨基酸和其它养分向肠粘膜的移动，造成养分消化吸收率降低。

养分的分子量越大，黏稠度效应对其影响也越大，尤其是脂肪。黏稠度增加阻碍了肠道内容物的机械混合，减缓了乳化作用，阻止了脂肪形成脂肪微粒。另外，SNSP表面带有的负电荷能与脂类、胆固醇和胆盐结合，使胆酸的粪便损失率增加，同时也增加了来自胆固醇的胆酸肝脏合成物。胆酸和脂类的持续排泄和粪酸及中性固醇的快速消除最终可能影响到脂类和胆固醇在小肠的消化吸收。

对小麦抗营养因子的有效降解需要多种酶或多种酶系的协同作用。不同来源酶的酶学特性对小麦的酶解效果差异也很大。但是，现有的小麦复合酶在降解粘度方面较差，且发酵操作复杂、劳动量和成本较高。

发明内容

针对现有技术中小麦酶解效果不理想的情况，本发明提供了一种畜禽用小麦专用复合酶制剂及其应用，所述复合酶具有很好的酶解效果，可获得较高量的还原糖，还具有良好的降低粘度效果。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种小麦专用复合酶制剂，它包括以下组分，按质量百分比计：木聚糖酶0.5-1.5%、β-葡聚糖酶0.2-0.6%、β-甘露聚糖酶0.1-0.3%、纤维素酶0.2-0.6%、酸性蛋白酶2-4%、中性蛋白酶0.5-1.5%、果胶酶1-2.2%、α-半乳糖甘酶8-12%、糖化酶8-12%、黑曲霉发酵复合酶8-12%；添加抗氧化剂2-4%、防霉剂2-4%、驱虫剂1-3%、载体42.3-66.5%。

对上述技术方案的进一步改进：它包括以下组分，按质量百分比计：木聚糖酶1%、β-葡聚糖酶0.4%、β-甘露聚糖酶0.2%、纤维素酶0.4%、酸性蛋白酶3%、中性蛋白酶1%、果胶酶1.6%、α-半乳糖甘酶10%、糖化酶10%、黑曲霉发酵复合酶10%；添加抗氧化剂3%、防霉剂3%、驱虫剂2%、载体54.4%。

本发明还提供了所述小麦专用复合酶制剂在作为畜禽饲料添加剂中的应用。

对上述技术方案的进一步改进：所述复合酶的添加用量为100-150克/每吨料。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、分解抗营养因子，降低肠道食糜黏度

小麦中的木聚糖是提高动物肠道食糜粘度的主要原因。NSP的黏度与其分子量有很大的关系，分子量越大其黏性就越高。本发明选用有效降低粘度的木聚糖酶和β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶等单酶配制小麦专用复合酶，日粮中添加所述酶制剂后，分子量大于5万Da的葡聚糖组分明显减少，而小分子量的阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的黏性和水溶性大大降低，降低了对肠道的副作用，使食糜在消化道内更易于转运和消化吸收，本发明能有效解决日粮中添加高比例小麦所带来的抗营养作用，可有效消除其抗营养作用，降低食糜粘度，提高动物的生产性能，进而帮助饲料企业用好小麦和小麦酶，有效降低饲养成本。

2、激活内源酶的分泌，提高饲料利用率

在日粮中添加一定量的所述酶制剂，还可以激活内源酶的分泌，提高内源消化酶的活性，如提高了十二指肠内容物中总蛋白水解酶和α-淀粉酶的活性，饲料粗蛋白质、粗脂肪和粗纤维的表观消化率也分别得到提高，从而促进了养分的消化吸收。

3、减少有害菌的繁殖，改善肠道结构

因为所述酶制剂的添加，降低了肠道内容物的黏性，促进养分的消化吸收，从而改变了肠道微生物生长繁殖的环境，减少了病原微生物的数量，降低了对养分的竞争性吸收。另外，NSP酶制剂的添加减少了NSP对肠道的副作用，改善肠道结构，促进肠绒毛的生长。

除此之外，使用本发明所述酶制剂还比单纯发酵黑曲霉获得复合酶操作简便、且劳动量和成本得以大大降低。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明中木聚糖酶对小麦的体外酶解效果图。

图2是本发明中配制成的所述小麦专用复合酶体外酶解效果图。

图3是本发明中黑曲霉分泌酶、木聚糖酶及配制成的小麦专用复合酶对小麦的体外酶解效果对比图。

图4是本发明中木聚糖酶对小麦的降解粘度效果图。

图5是本发明中配制成的所述小麦专用复合酶降解粘度效果图。

图6是本发明中黑曲霉分泌酶、木聚糖酶及配制成的小麦专用复合酶对小麦的降解粘度效果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、制备黑曲霉发酵酶

取市场上对小麦酶解效果较好的黑曲霉，固体发酵使之产木聚糖酶和其他酶形成复合酶系。其培养和生产的过程为：

黑曲霉菌株的筛选（商品编号为3.316）→发酵种子的扩大培养

↓

配制发酵原料→灭菌→接种→固体发酵→后处理→精料酶源→复配工艺→产品

具体步骤为：

培养种子：麸皮：蒸馏水=2:1，配置种子培养基，121℃,30min-45min灭菌。接种，30℃培养4-5天，摇匀之后，放入4℃冰箱至少1-2天，可用。

生产：麸皮、玉米皮等按培养基配方配置倒入混合机中混料，菌种接到水里混匀，之后将混好菌种的水缓慢均匀倒入混合机中，搅拌5min后，送至培养间，摊料至2-3cm厚，30℃培养，前24h升温（25℃左右、32℃以下），生产48h出料，烘干，粉碎。

二、配制小麦专用复合酶

选用具有良好的降低粘度作用的木聚糖酶，同时选用其它的单酶配成小麦专用复合酶，组分及含量如下：木聚糖酶1%、β-葡聚糖酶0.4%、β-甘露聚糖酶0.2%、纤维素酶0.4%、酸性蛋白酶3%、中性蛋白酶1%、果胶酶1.6%、α-半乳糖甘酶10%、糖化酶10%、黑曲霉发酵酶10%，同时添加抗氧化剂3%、防霉剂3%、驱虫剂2%和载体54.4%。

木聚糖酶具有内切酶功能，可以把结构复杂的木聚糖水解为木寡糖和单糖。β-甘露聚糖酶是水解以β-1,4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露寡糖、甘露多糖(甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖)的内切水解酶，它除具有一般非淀粉多糖(NSP)酶类的作用—降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外，它还是一种多功能的促生长剂，因为它可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饲料能量利用率。在日粮中添加β-葡聚糖酶可降低含有β-葡聚糖的细胞壁对内源酶的屏障作用，提高胚乳细胞中淀粉和蛋白质的利用率，使淀粉在小肠后段的消化率明显提高。

三、试验验证

采用二硝基水杨酸法（DNS法）和毛细管粘度计来检测小麦经酶解后还原糖增量及降低粘度效果，并进行组间比较，验证本发明所述小麦专用复合酶的作用效果。

1、还原糖增量实验

(1)木聚糖酶活力单位定义

在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

(2)实验原理

木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。

(3)试剂与溶液

所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。

浓度为200g/L的氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。

浓度为0.1mol/L的乙酸溶液：吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。

浓度为0.1mol/L的乙酸钠溶液：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100mL。

浓度为0.1mol/L，pH为5.50的乙酸-乙酸钠缓冲溶液：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.50，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.50。木糖溶液（C₅H₁₀O₅），浓度为10.0mg/mL

称取无水木糖1.000g，加乙酸-乙酸钠缓冲溶液（3.4）溶解，定容至100mL。

浓度为100mg/mL的木聚糖溶液：

称取木聚糖（Sigma X0627）1.00g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min，加入0.5ml冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其pH值。如果pH值为5.50，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.4）定容至100mL。如果pH值偏离5.50，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.50，然后再用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.4）定容至100mL。使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。

DNS试剂：

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌3-5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（3.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后方可使用，有效期为180d。

(4)仪器与设备

实验室用样品粉碎机或碾钵；

分样筛：孔径为0.25mm；

分析天平：感量0.001g；

pH计：精确至0.01；

磁力搅拌器：附加热功能；

电磁振荡器；

烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm；

离心机：最大离心加速度不小于2000g；

恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃；

秒表：每小时误差不超过5s；

可见分光光度计；

移液器：精度为1μL。

(5)绘制标准曲线

吸取乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.4）4.0mL，加入DNS试剂（3.7）5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。

分别吸取木糖溶液（3.5）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL，分别用缓冲溶液（3.4）定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。

分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液（3.4）和5.0mL DNS试剂（3.7）。电磁振荡3～5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A值。

以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。

(6)反应用酶液的制备

固体样品的反应用酶液制备

称取试样两份，精确至0.001g。加入40mL乙酸——乙酸钠缓冲溶液（3.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h。上离心机（4.8）1000g离心3-5min，取上清液，再用缓冲溶液（3.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04～0.10U/mL之间）。

液体样品的反应用酶液制备

液体样品可以直接用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（3.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04～0.10U/mL之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.50，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节校正至5.50，然后再用缓冲溶液（3.4）做适当稀释定容。

(7)测定步骤

吸取10.0mL木聚糖溶液（3.6），37℃平衡20min。

吸取10.0mL经过适当稀释的酶液（6.1）或（6.2），37℃平衡10min。

吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂（3.7），电磁振荡3-5s。然后加入2.0mL木聚糖溶液（3.6），37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3～5s。以标准空白样（参见5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。

吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0mL木聚糖（3.6）（已经过37℃平衡），电磁振荡3～5s，37℃精确保温30min。加入5.0mLDNS试剂（3.7），电磁振荡3～5s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3～5s。以标准空白样（参见5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。(8)试样酶活的计算

用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按下式计算：

$X_D=\frac{[(A_E-A_B)\×K+C_O]}{M\×t}\×1000\left(I\right)$

式中：

X_D—稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL；

A_E—酶反应液的吸光度；

A_B—酶空白样的吸光度；

K—标准曲线的斜率；

C_O—标准曲线的截距；

M—木糖的摩尔质量M（C₅H₁₀O₅）=150.2g/mol；

t—酶解反应时间，min；

1000-转化因子，1mmol=1000μmol；

X_D值应在0.04～0.10U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X＝X_D×D_f    （Ⅱ）

X—试样中木聚糖酶的活力，U/g（或U/mL）；

D_f—试样的稀释倍数；

酶活力的计算值保留三位有效数字。

(9)重复性

每个试样应取二份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值。

由以上试验得出数据分析，所述小麦专用复合酶对小麦酶解效果明显好于单一用木聚糖酶对小麦的体外酶解效果。

2、降低粘度实验

1实验目的

使用毛细管粘度计测定酶解后小麦粘度，比较不同来源酶降低小麦粘度效果。

2材料与方法

2.1实验材料

毛细管粘度计

新配制小麦专用复合酶

特定木聚糖酶

黑曲霉分泌酶

小麦：取部分样品用粉碎机粉碎后至60目，80℃烘干至恒重后用密封袋保存。

2.2实验设计

不同来源酶按不同稀释倍数稀释，设计四个不同的酶活添加量：0、5U／g、10U／g和20U／g，酶解小麦后用毛细管粘度计测量其粘度。

2.3实验方法

称取5g小麦粉到100mL三角瓶中，加入20mL蒸馏水混匀，分别加入相应的酶，每个酶样每个梯度三个重复，均匀后封口膜封口，放入41℃的恒温水浴锅内振荡（120次／min）作用4h。所有处理样用同一个毛细管粘度计测量粘度，每个样测三次取平均值，并计算降低粘度效果。降低粘度效果=（不含酶的小麦粘度－不同木酶添加量酶解小麦后的粘度）/不含酶的小麦粘度×100%。

结合图1-6可以看出，在降解粘度效果方面，所述小麦专用复合酶降解粘度效果略低于木聚糖酶，但明显好于黑曲霉分泌酶，其酶解的还原糖的量与其相差不大。因此新型小麦复合酶比单纯发酵黑曲霉获得复合酶操作简便、劳动量和成本低，且有良好的酶解和降低粘度效果。本发明能有效解决小麦中非淀粉多糖引起的抗营养问题和食糜粘度的升高，有助于生产优质饲料和降低养殖成本。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种小麦专用复合酶制剂，其特征在于它包括以下组分，按质量百分比计：木聚糖酶0.5-1.5%、β-葡聚糖酶0.2-0.6%、β-甘露聚糖酶0.1-0.3%、纤维素酶0.2-0.6%、酸性蛋白酶2-4%、中性蛋白酶0.5-1.5%、果胶酶1-2.2%、α-半乳糖甘酶8-12%、糖化酶8-12%、黑曲霉发酵复合酶8-12%；添加抗氧化剂2-4%、防霉剂2-4%、驱虫剂1-3%、载体42.3-66.5%。

2.根据权利要求1所述的一种小麦专用复合酶制剂，其特征在于它包括以下组分，按质量百分比计：木聚糖酶1%、β-葡聚糖酶0.4%、β-甘露聚糖酶0.2%、纤维素酶0.4%、酸性蛋白酶3%、中性蛋白酶1%、果胶酶1.6%、α-半乳糖甘酶10%、糖化酶10%、黑曲霉发酵复合酶10%；添加抗氧化剂3%、防霉剂3%、驱虫剂2%、载体54.4%。

3.根据权利要求1或2所述的一种小麦专用复合酶制剂在作为畜禽饲料添加剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种小麦专用复合酶制剂在作为畜禽饲料添加剂中的应用，其特征在于所述复合酶的添加用量为100-150克/每吨料。

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