CN109182421A - 一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，包括如下步骤：步骤1，将啤酒糟烘干，粉碎，装袋，密封，备用；步骤2，利用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基接种出芽短梗霉，再利用马铃薯葡萄糖液液态培养基活化培养，制备种子液；步骤3，按接种量在含有啤酒糟的固态发酵培养基上接种步骤（2）所得种子液，28~34℃培养2~10d，即得。本发明以啤酒糟为主要原料，出芽短梗霉为发酵菌株，采用固态发酵制备具有生理功能的阿魏酰低聚糖和膳食纤维，为啤酒加工副产物的资源化利用提供一条新的途径。
Description
技术领域
本发明属于啤酒糟的资源化利用领域，具体涉及一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法。
背景技术
啤酒糟又称麦糟、麦芽糟，是啤酒工业中的最主要副产物。啤酒糟干基含有蛋白质、戊聚糖、木质素、淀粉和葡聚糖、纤维素、脂肪等丰富的营养成分，在国外已被广泛应用于饲料、医药和食品等行业。我国是啤酒生产大国，啤酒糟作为啤酒厂最大量的副产物，除少部分被用作饲料用，大部分以废弃物的形式被排放掉，既造成了浪费又污染了环境。因此，啤酒糟资源化利用和无害化处理的深入研究，将给企业带来可观的经济效益，且能缓解环境治理压力。
阿魏酰低聚糖(Ferulol oligosaccharides,FOs)是阿魏酸与低聚糖通过酯键连接而形成的一类重要的功能性低聚糖，FOs除具有低聚糖的生物活性外，还具有抗氧化活性。有国外学者报道FOs抗氧化活性强于阿魏酸与维生素C，对小鼠红细胞溶血现象具有较强的抑制作用，对Fe2+、H2O2和羟自由基具有较强的清除能力，对乳酸菌和双歧杆菌生长有促进作用，并具有显著的抗肿瘤活性。随着FOs研究的深入，从上世纪九十年代FOs的结构解析到现在重点关注其功能性，为进一步寻找其来源和高效制备方法奠定了发展方向。FOs广泛存在于禾本科植物中，至今已在大麦胚乳、大麦杆、玉米芽、玉米糠等原料中分离到十多种由阿拉伯糖、木糖和阿魏酸组成的FOs。
膳食纤维(Dietary Fibre，DF)是继碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和水之后的第七大营养素，可预防肥胖、冠心病、糖尿病和结肠癌等疾病的发生。啤酒糟中的膳食纤维含量达55％～61％，其中不可溶性膳食纤维占总膳食纤维的60％左右，提取啤酒糟中可溶性膳食纤维在国内外均有研究报道，其得率可达15.7％。
目前制备FOs和DF的方法有物理法、化学法、酶处理法以及生物发酵法。物理法不稳定，化学法易造成化学物质的残留和环境污染。酶法制备FOs是目前较常见的方法，具有反应温和、操作简便等优点，但是该方法通常先从原料中制取不溶性膳食纤维，这增加了生产环节，且产生的大量废水给环境带来巨大压力。
如今很多企业直接将啤酒糟用来饲养动物或排放入河，长期以来，不仅会使得动物对啤酒糟不易消化、吸收，还会使得生态环境变得更加恶劣，同时也造成了啤酒糟的大量浪费。啤酒糟是微生物发酵的良好基质，我国是一个啤酒生产大国，2016年底我国生产啤酒达4506万吨，与此同时也产生了大量的啤酒糟。因此，如何合理有效的利用啤酒糟，已成为啤酒工业所面临的的重大难题。
以啤酒糟为基质底物提取水溶性膳食纤维主要是采用碱法和酶解法，另对阿魏酰低聚糖的提取研究未见报道。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法；
本发明的第二个目的是提供一种出芽短梗霉菌发酵同时制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法；
本发明的第三个目的是提供两种产品：阿魏酰低聚糖和膳食纤维。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，包括如下具体步骤：
步骤1，将啤酒糟干燥，粉碎，装袋，密封，备用；
步骤2，利用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基接种出芽短梗霉，再利用马铃薯葡萄糖液液态培养基活化培养，制备种子液；
步骤3，按接种量4～20％在含有啤酒糟的固态发酵培养基上接种步骤(2)所得种子液，28～34℃培养2～10d，即得。
以啤酒糟为主要原料，出芽短梗霉为发酵菌株，采用固态发酵制备具有生理功能的阿魏酰低聚糖和膳食纤维，为啤酒加工副产物的资源化利用提供了一条新的途径。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤3中，以啤酒糟为主要原料的固态发酵培养基，还补充添加有碳源和氮源。
优选的，所述氮源为酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素和蛋白胨中的一种或两种以上的混合。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤3中，固态发酵培养基主要包括如下组分：啤酒糟、木聚糖、尿素和水，其中木聚糖、尿素和水分别占啤酒糟质量的3～7％、1～5％和100～300％。
优选的，该固态发酵培养基还包括KH2PO4和VB2，所述KH2PO4、VB2占啤酒糟质量的0～2％、0.01～0.1％。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤2中，先将马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基放入28℃恒温培养箱观察2d，没有杂菌则可以进行接种；在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上接种出芽短梗霉，于恒温培养箱中28℃培养，待长满斜面后，将菌种接入马铃薯葡萄糖液态培养基中，在28℃，培养3d进行活化培养，即为种子液。
优选的，所述步骤2中，活化培养时采用180r/min条件下摇床培养。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤1中，啤酒糟干燥方式为热风干燥，微波干燥，紫外线干燥，红外线干燥中的一种或者其中两种或两种以上的结合。
优选的，在干燥之前还可以对啤酒糟进行脱水处理。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤1中，啤酒糟干燥温度为60℃，使用设备为烘箱。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤1中，啤酒糟粉碎至粒径大小为40-80目，优选为60目。
本发明还保护由上述方法制备得到的阿魏酰低聚糖。
本发明还保护由上述方法制备得到的膳食纤维。
本发明中，以啤酒糟为发酵基质，固态发酵制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的最佳培养基配方为：木聚糖6％、尿素4％和磷酸二氢钾1％；最佳固态发酵工艺条件为：接种量、发酵时间和温度分别为12.26％、4.12d和29.27℃，在此条件下阿魏酰低聚糖含量和膳食纤维品质都达到最高，分别是37.76μM和23.76％。
有益效果：
本发明提供的一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明以啤酒糟为原料，出芽短梗霉为发酵菌株，采用固态发酵制备具有生理功能的阿魏酰低聚糖和膳食纤维，并确定发酵培养基的最优配方及发酵工艺条件，以期为啤酒加工副产物啤酒糟的资源化利用提供一条新的途径；
(2)采用“一线多品”的啤酒糟高效生物深加工工艺路线，利用微生物发酵法同时制取啤酒糟中功能性低聚糖及膳食纤维，突破以往单一产品开发为目标的研发思路，资源综合利用率高，生产成本低，无化学物质残留和环境污染；
(3)可进一步发展啤酒产业的低值副产品的高值综合利用和无害化处理，而且还可为相关固体废弃物的综合开发利用提供示范，从而提高企业的经济效益和社会效益；
(4)采用微生物发酵法生产FOs时，可直接将产木聚糖酶的微生物应用于FOs制备中，使微生物发酵产酶过程与酶解木聚糖获得FOs的过程合二为一，则可省去酶制剂生产中的分离纯化过程，降低生产成本，提高产率；
(5)食安性真菌出芽短梗霉生长过程中可产生淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等。其中淀粉酶和蛋白酶水解原料中的淀粉、蛋白质为其生长提供营养，并将其转变为真菌多糖和菌体纤维等膳食纤维，木聚糖酶可水解原料的细胞壁多糖，生成FOs，同时也可以对啤酒糟DF进行改性；因此，利用出芽短梗霉发酵啤酒糟同时制备高生物活性FOs和DF具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为接种量和发酵温度交互作用对FOs含量影响的响应面及等高线图；
图2为发酵时间和温度交互作用对FOs含量影响的响应面及等高线图；
图3为发酵时间和温度交互作用对膳食纤维品质影响的响应面及等高线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
啤酒糟是大麦芽经粉碎、糖化、过滤而剩余的残渣，主要成分为麦芽皮壳，含有51.4％的多聚糖，是制备FOs的理想原料。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)又名出芽茁霉，为半知菌类短梗霉属，是一类与酵母有密切关系的食安性真菌。出芽短梗霉生长迅速，培养数日就可生长成熟。而出芽短梗霉生长过程中可生成木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，其中半纤维素酶可水解原料的细胞壁多糖，生成FOs；淀粉酶和蛋白酶水解原料中的淀粉、蛋白质为其生长提供营养，并将其转变为真菌多糖和菌体纤维，增加膳食纤维来源。同时，直接将产木聚糖酶的微生物应用于FOs制备中，使微生物发酵产酶过程与酶解木聚糖获得FOs的过程合二为一，可省去酶制剂生产中的分离纯化步骤及不溶性膳食纤维的制备步骤，降低生产成本，提高FOs和DF的产率。
实施例1：
步骤1：将啤酒糟放入烘箱中于60℃烘干，粉碎至啤酒糟的颗粒径度大小为60目，装袋，密封，备用。
步骤2：将马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)斜面培养基放入28℃恒温培养箱观察2d，没有杂菌则可以进行接种；在PDA斜面培养基上接种出芽短梗霉，于恒温培养箱中28℃培养7d，待长满斜面后，将菌种接入马铃薯葡萄糖液态培养基中，在28℃，180r/min条件下摇床培养3d进行活化培养，即为种子液。
步骤3：按12％(v/v)的接种量取出芽短梗霉的种子液接入到装有固体发酵培养基(啤酒糟20g，木聚糖5％，尿素3％，KH2PO4 0.5％，VB2 0.01％，蒸馏水40mL，pH自然)的锥形瓶中，每种同样条件下做3个平行试验，置于28℃下培养4d。
步骤4：发酵培养基组分比例优化
考察木聚糖(3，4，5，6，7％)、尿素(1，2，3，4，5％)和磷酸二氢钾(0，0.5，1，1.5，2％)添加量对制备FOs和膳食纤维品质(SDF/TDF)的影响，在单因素试验结果的基础上，设计L9(34)正交试验优化选出碳源、氮源和无机盐的最适添加量。
步骤5：响应面法优化发酵工艺条件
利用最优的发酵培养基组分，考察接种量(4、8、12、16、20％)、发酵时间(2、4、6、8、10d)和温度为(26、28、30、32、34℃)三个因素对FOs含量及膳食纤维品质的影响。以单因素实验得到的结果为基础，依据Box-Behnken实验设计的原理，以FOs含量及膳食纤维品质为响应值，进行三因素三水平的实验设计。用Design-Expert version 7.0软件设计实验因素水平及编号如表1所示，每组实验重复三次。
表1 BBD试验设计因素水平及编码
测试方法：
发酵结束后测定阿魏酰低聚糖、不溶性膳食纤维、可溶性膳食纤维含量，并计算总膳食纤维和膳食纤维品质。具体实施方式如下：
(1)阿魏酰低聚糖含量的测定
称取干燥后的固态发酵样品0.5g，用10倍50mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)在28℃，250r/min条件下摇床振荡培养箱中摇床60min。结束后，离心(4℃，10000rpm，15min)，取上清液0.1mL，与0.9mL的0.1mol/L硼砂-甘氨酸缓冲溶液(pH10)混合，分别在345nm和375nm处测定混合溶液的吸光度。根据如下的数据可推算出FOs的浓度。
阿魏酸的摩尔吸光系数(M-1.cm-1)：ε’345＝19662,ε’375＝7630；
阿魏酰低聚糖的摩尔吸光系数(M-1.cm-1)：ε345＝23064,ε375＝31430。
C＝(ε’345×A375-ε’375×A345)b/(ε’345×ε375-ε345×ε’375)
式中：C为阿魏酰低聚糖浓度(mol/L)；b为比色皿厚度(cm)：1cm；A345为波长345nm的OD值；A375为波长375nm的OD值。
(2)不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF)测定
发酵样品于60℃烘箱中干燥至恒重，取发酵样1.00g，置平底烧瓶中，加15mL去离子水，90℃水浴30min，淀粉酶、蛋白酶酶解后过滤，加75mL中性洗涤剂溶液，再加0.05g无水Na2SO3，电炉加热，5-10min内煮沸，移至电热板上，保持微沸1h，用10mL丙酮冲洗残渣，于耐酸玻璃砂芯漏斗中抽滤至干，移至烘箱内，110℃保持4h，取出冷却至室温，称重。
(3)可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)测定
取测定不溶性膳食纤维时第1次过滤的滤液，加入4倍体积的95％的乙醇，于4℃放置8h后，离心，收集沉淀，无水乙醇洗涤离心2次，再加丙酮洗涤离心1次，105℃烘至恒重，称重。
(4)总膳食纤维
TDF:可溶性膳食纤维与不可溶性膳食纤维之和(TDF＝SDF+IDF)
(5)膳食纤维品质
可溶性膳食纤维占总膳食纤维的比例(SDF/TDF)
结果与分析
1.发酵培养基组分比例优化实验结果
表2不同培养基组分添加量对FOs含量及膳食纤维品质的影响
由表2实验结果可知，随着三种培养基组分添加量的增加，FOs含量及膳食纤维品质逐渐增加，当添加量达到一定浓度时FOs含量及膳食纤维品质开始呈下降趋势。本发明中选择木聚糖添加量(5％、6％、7％)，尿素添加量(3％、4％、5％)，KH2PO4添加量(0.5％、1.0％、1.5％)作为继续研究对象。
以木聚糖、尿素和KH2PO4添加量为评价因素，以FOs含量及膳食纤维品质为评价指标进行L9(34)发酵试验，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3正交实验结果
表4以FOs含量及膳食纤维品质为评价指标的正交试验结果方差分析
注：“*”表示对结果影响差异显著(α＝0.05)。
由表3实验结果分析可知，三种培养基组分对FOs含量影响的主次顺序依次是：木聚糖>尿素>KH2PO4，对膳食纤维品质影响的主次顺序依次为：尿素>KH2PO4>木聚糖。综合分析，以K值选择最优组合为A2B2C2，即木聚糖6％、尿素4％、KH2PO4 1.0％。由表4可知，木聚糖和尿素对FOs产量有显著影响(P＜0.05)，而KH2PO4对固态发酵啤酒糟产FOs影响并不显著；尿素对膳食纤维品质也有显著影响。
在最佳条件下进行验证试验，测得FOs含量及膳食纤维品质分别为31.15μM，21.56％。该验证试验说明啤酒糟在最优组合培养基中发酵。
2.发酵工艺优化实验结果
2.1接种量对FOs含量及膳食纤维品质的影响
表5接种量对FOs含量及膳食纤维品质的影响
按照最佳培养基组分的比例，改变接种量4、8、12、16、20％，按照步骤1、2、3的方法进行实验。结果表明(表5)，随着接种量增加，发酵后啤酒糟基质中FOs含量及膳食纤维品质呈现先增加后下降的趋势，接种量为12％时两项指标均达到最大值。接种量较小时，出芽短梗霉生长过程中的延滞期太长，在发酵周期内菌种没有充分生长。接种量较大时，会导致出芽短梗霉生长过快，大量消耗营养物质，使得营养物质不断减少，转而去利用FOs和膳食纤维供其生长。
2.2发酵时间对FOs含量及膳食纤维品质的影响
表6发酵时间对FOs含量及膳食纤维品质的影响
由表6可知，在接种量和发酵温度分别为12％和28℃的条件下，出芽短梗霉固态发酵啤酒糟制备得出的FOs含量及膳食纤维品质变化趋势都是先增加，在第4d后达到最大值后，FOs含量及膳食纤维品质不断下降，这种结果可能是因为一开始随着时间的增加，出芽短梗霉分泌的阿魏酸酯酶的含量增加，但是到达一定的时间之后，出芽短梗霉所利用的营养物质不断减少，转而去利用FOs和膳食纤维供给其生长，进而会造成FOs含量及膳食纤维品质的下降。综上，在第4d时，FOs含量及膳食纤维品质达到最大值。最优发酵时间选取第4天。
2.3发酵温度对FOs含量及膳食纤维品质的影响
表7发酵温度对FOs含量及膳食纤维品质的影响
由表7可知，出芽短梗霉在30℃时发酵啤酒糟得到的FOs含量及膳食纤维品质均达到最大值。出芽短梗霉的最适生长温度是32℃，因此随着温度从26℃逐渐升高，FOs含量及膳食纤维品质先逐渐增加，到了32℃，出芽短梗霉开始进行大量生长，因此消耗了啤酒糟中的大量营养物质，进而也利用了FOs及膳食纤维供给其生长，两者含量减少。因此，最优的发酵温度选取30℃。
2.4响应面实验设计及结果
表8响应面实验设计及结果
2.4.1模型的建立及显著性检验
通过Design-Expert软件对表3中的数据进行多元回归拟合，计算回归系数，可以得到FOs含量对接种量(A)、发酵时间(B)和发酵温度(C)的多项回归方程：
Y＝37.76+2.43×A+2.32×B－1.16×C－0.45×AB-3.81×AC+4.75×BC－13.17×A2－8.80×B2－5.41×C2
膳食纤维品质对接种量(A)、发酵时间(B)和发酵温度(C)的多项回归方程：
Y＝22.82-0.47×A+1.60×B－1.91×C－0.30×AB-0.40×AC+2.20×BC－5.07×A2－4.64×B2－0.43×C2
表9回归模型方差分析
注：*，影响显著(P<0.05)；**，影响极显著(P<0.001)。
由表9分析结果可知，回归方程模型P<0.0001，表明模型具有极显著性；两个失拟项P＝0.0658>0.05，P＝0.4032>0.05说明失拟项均不显著，表明回归模型是合适的，可以用来分析和预测固态发酵制备FOs和膳食纤维的发酵条件。一次项接种量、发酵时间对FOs的含量影响极显著，发酵温度对FOs的含量影响显著，发酵时间、温度对膳食纤维品质的影响显著。接种量与发酵温度以及发酵时间与温度对FOs的含量交互作用影响极显著。
2.4.2响应面优化分析
通过响应面图和等高线图结果可知，三个因素都是随着因素数值增大响应值增大，当响应值达到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小。由图1可知，接种量和发酵温度两个因素对FOs含量的交互作用极显著，图2和图3则表明发酵温度和时间两个因素对FOs含量和膳食纤维品质的交互作用极显著。结果与表8方差分析结果一致。
由Design-Expert version 8.0.6软件得出FOs含量和膳食纤维品质的最佳工艺条件为：接种量为12.26％，发酵时间为4.12d，发酵温度为29.27℃，在此条件下FOs的含量为37.67μM，膳食纤维品质为23.76％。与模型预测的最大含量37.76μM，最高品质23.16％基本一致，说明响应面法得到的FOs和膳食纤维品质发酵工艺条件真实可靠。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (9)
1.一种固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤1，将啤酒糟干燥，粉碎，装袋，密封，备用；
步骤2，利用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基接种出芽短梗霉，再利用马铃薯葡萄糖液液态培养基活化培养，制备种子液；
步骤3，按接种量4~20%在含有啤酒糟的固态发酵培养基上接种步骤（2）所得种子液，28~34 ℃培养2~10 d，即得。
2.根据权利要求1所述的固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，所述步骤3中，固态发酵培养基主要包括如下组分：啤酒糟、木聚糖、尿素和水，其中木聚糖、尿素和水分别占啤酒糟质量的3~7%、1~5%和100~300%。
3.根据权利要求1所述的固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，所述步骤3中，该固态发酵培养基还包括KH2PO4和VB2，所述KH2PO4、VB2占啤酒糟质量的0~2%、0.01~0.1%。
4. 根据权利要求1所述的固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，所述步骤2中，先将马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基放入28℃恒温培养箱观察2 d，没有杂菌则可以进行接种；在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上接种出芽短梗霉，于恒温培养箱中28℃培养，待长满斜面后，将菌种接入马铃薯葡萄糖液态培养基中，在28℃，培养3 d进行活化培养，即为种子液。
5. 根据权利要求4所述的固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，所述步骤2中，活化培养时采用180 r/min条件下摇床培养。
6.根据权利要求1所述的固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，所述步骤1中，啤酒糟干燥温度为60℃，使用设备为烘箱。
7.根据权利要求1所述的固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖和膳食纤维的方法，其特征在于，所述步骤1中，啤酒糟粉碎至粒径大小为60目。
8.由权利要求1所述的方法制备的阿魏酰低聚糖。
9.由权利要求1所述的方法制备的膳食纤维。
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