CN106544294A - 一种枯草芽孢杆菌h‑9及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌H‑9及其应用。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌H‑9(Bacillus subtilis)，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016293。本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌H‑9的应用。本发明提供了一种纳豆食品，由豆类底物经上述枯草芽孢杆菌H‑9发酵制得。本发明的枯草芽孢杆菌H‑9具有较高的纳豆激酶生产活性，以黄豆为底物，纳豆激酶活性达91.7FU/g(干重)，该方法简单高效。

Description

一种枯草芽孢杆菌H-9及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌H-9及其应用。

背景技术

血栓疾病及其相关心血管疾病严重危害人类健康，具有溶栓功效的食品和药物的开发成为近年来的研究热点。纳豆激酶因其具有可口服、安全、高效、持久和廉价等优势，成为近年来溶栓类产品的开发热点（Peng Y, Yang X, Zhang Y. Appl MicrobiolBiotechnol, 2005, 69: 126-132）。

纳豆激酶相关产品主要包括食品和保健品。经枯草芽孢杆菌发酵豆类可制备纳豆食品，富含纳豆激酶、纳豆菌、抗氧化成分等多种生理活性物质，具有溶解血栓、调节肠道菌群、促进营养吸收、抗癌、抗氧化等保健作用。纳豆相关保健品已在我国占据一定的市场，但纳豆类保健品价格昂贵，受众有限，相比之下，纳豆食品具有更广泛的潜在消费者。然而，纳豆食品具有强烈的臭味，严重影响其风味，制约其推广应用，还可能导致消费者恶心、呕吐等不适症状。随着人们对食品品质和安全的日益关注，纳豆异味问题亟待解决。本发明希望从我国传统发酵豆制品中分离高产纳豆激酶的新型枯草芽孢杆菌，并将其应用于纳豆生产中。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌H-9。

本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌H-9的应用。

本发明的再一目的是提供一种纳豆食品，其由上述枯草芽孢杆菌H-9发酵制得。

本发明的再一目的是提供上述纳豆食品的制备方法。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌H-9。本发明的发明人在中国传统发酵豆制品中，分离筛选出一种纳豆激酶生产菌株，适宜生长温度28-40℃，适宜pH 6.5-7.5。经形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为H-9（Bacillus subtilis）。该菌种保存于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，430072)，其保藏号为：CCTCC NO：M 2016293，保藏日期：2016年5月27日。

本发明菌种的分离方法在纤溶酶活性分离法的基础上，采取独特的纳豆激酶基因PCR扩增法，可快速准确的筛选到纳豆激酶生产菌株。加无菌水于发酵豆制品中，80℃加热10 min，吸取上清液稀释涂布LB培养基平板（蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，氯化钠 10 g/L，琼脂粉15 g/L，pH 7.2），37℃培养48 h，挑选较大的单菌落，转接LB固体培养基平皿（蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，氯化钠 10 g/L，琼脂粉15 g/L，pH 7.2），培养后保存于4℃冰箱中。通过PCR反应扩增纳豆激酶基因，将扩增出基因产物的菌株转接至灭菌的黄豆中，37℃，培养48 h，检测各菌株纳豆激酶活性，挑选出纳豆激酶活性较高的菌株。纳豆激酶活性检测通过纤维蛋白溶解法进行：向试管中依次加入0.4 mL纤维蛋白原溶液（0.72%，w/v），1.4 mL Tris–HCl (50 mM，pH 7.8)，37℃温浴5 min，然后加入0.1 mL凝血酶溶液(20 U/mL)，37℃温浴10 min，再加入0.1 mL的稀释酶样品，37℃ 温浴60 min，加入2 mL三氯乙酸（0.2 M）静止20 min终止反应，4000 g 离心15 min，取上清于275 nm比色测定吸光度，1个单位的纤维蛋白降解酶活（FU）相当于每分钟275 nm处吸光度增加0.01所需要的酶量。将筛选到的菌株按照规定方法进行菌种鉴定。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌在LB固体培养基上菌落边缘粗糙，菌苔表面褶皱。适宜生长温度28-40℃，适宜pH 6.5-7.5。酪蛋白水解阳性，淀粉水解阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。菌体呈直杆状，1.8-2.9×0.8-1.2 μm，革兰氏染色阳性。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列有1082个碱基，该16SrRNA基因序列如序列表中所示。

测得的16S rRNA序列通过MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建，进化树显示菌株H-9属于枯草芽孢杆菌。综合形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定结果，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。

该菌株具有较高的纳豆激酶生产活性，以黄豆为底物，纳豆激酶最高活性达到91.7 FU/g（黄豆干重）。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌H-9的应用，优选其在生产富含纳豆激酶的纳豆食品中的应用。

本发明提供了一种纳豆食品，其中，所述纳豆食品由豆类底物经上述枯草芽孢杆菌发酵制得。

根据本发明的纳豆食品，其中，所述豆类底物为黄豆。

本发明的上述纳豆食品的制备方法，包括以下步骤：

1）将权利要求1所述枯草芽孢杆菌H-9菌株接在LB液体培养基上37℃培养12 h后放置于无菌管中，-70℃冷冻保藏；

2）制备种子液；

3）制备豆类发酵底物，其中所述豆类为黄豆；

4）发酵培养：按照2%-5%（v/w）的接种量，将种子液加入豆类发酵底物中混匀，28-42℃静止培养36-48 h，获得纳豆食品。

根据本发明的纳豆食品的制备方法，其中，所述种子液制备方法包括以下步骤：

1）将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养12 h，使其活化；

2）将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37℃，180 rpm培养8-14 h，制得种子液。

根据本发明的纳豆食品的制备方法，其中，所述豆类发酵底物制备方法包括以下步骤：

1）精选：去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；

2）浸泡：加入4倍体积（v/w）的水，室温浸泡4 h；

3）沥水，使豆子的初始含水量为50%-70%；

4）蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115℃高温高压蒸煮30 min，制得豆类发酵底物。

附图说明

图1为Bacillus subtilis H-9菌株的16S rDNA序列分析。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 菌株的筛选

本发明菌种的分离方法综合了纳豆激酶基因PCR扩增法和纤溶酶活性分离法，可快速准确的筛选到纳豆激酶生产菌株。加无菌水于黄豆酱制品中，80℃加热10 min，吸取上清液稀释涂布LB培养基平板（蛋白胨 10 g/L, 酵母粉 5 g/L, 氯化钠 10 g/L, 琼脂粉15 g/L，pH 7.2），37℃培养48 h，挑选较大的单菌落，转接LB固体培养基平皿（蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，氯化钠 10 g/L， 琼脂粉15 g/L，pH 7.2），培养后保存于4℃冰箱中。通过PCR反应扩增纳豆激酶基因。菌株总DNA通过细菌基因组抽提试剂盒抽提，PCR扩增采用纳豆激酶基因开放阅读框特异性引物aprNF (CCGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCA)和aprNR(ATTTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG)进行。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。结果显示有10株菌可得到PCR产物。收集菌株的PCR产物进行测序，测序结果通过blast进行相似性比对，同已报道的纳豆激酶的基因序列相似性达到99%，因此所得菌株生产的纤溶酶被鉴定为纳豆激酶。通过菌种活化，转接至灭菌的黄豆中，37℃，发酵48 h，检测纳豆激酶活性，其中活性最高的菌株H-9纤溶活性达91.7 FU/mL。

纳豆激酶活性检测通过纤维蛋白溶解法进行：向试管中依次加入0.4 mL纤维蛋白原溶液（0.72%, w/v），1.4 mL Tris–HCl (50 mM, pH 7.8)，37℃温浴5 min，然后加入0.1mL凝血酶溶液(20 U/mL), 37℃温浴10 min，再加入0.1 mL的稀释酶样品，37℃温浴60min，加入2 mL三氯乙酸（0.2 M）静止20 min终止反应，4000 g 离心15 min，取上清于275nm比色测定吸光度，1个单位的纤维蛋白降解酶活（FU）相当于每分钟275 nm处吸光度增加0.01所需要的酶量。

实施例2 菌株的鉴定

形态及生理生化鉴定

细菌形态及生理生化鉴定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行，分离所得菌株在LB固体培养基上生长时，菌落边缘粗糙，菌苔表面褶皱。适宜生长温度28-40℃，适宜pH 6.5-7.5。酪蛋白水解阳性，淀粉水解阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。菌体呈直杆状，1.8-2.9×0.8-1.2 μm，革兰氏染色阳性。

16S rRNA分子鉴定

菌株总DNA通过细菌基因组抽提试剂盒抽提，16S rRNA 基因PCR扩增采用通用引物(27f: agagtttgatcctggctcag)和(1492r：ggttaccttgttacgactt)进行。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，28个循环；72℃延伸10min。基因测序通过ABI Prism 370自动测序仪完成。测序结果显示该菌株的16S rRNA基因序列有1443个碱基，与枯草芽孢杆菌HYM11的序列相似性达到99 %。通过MEGA. 5软件进行系统进化树的构建，进化树也显示菌株属于枯草芽孢杆菌。结合16S rRNA分子鉴定与前面的形态学和生理生化鉴定结果，鉴定该菌株为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌，命名为H-9（Bacillus subtilis）。该菌种保存于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，430072)，其保藏号为：CCTCC NO：M 2016293，保藏日期：2016年5月27日。

实施例3 黄豆固体发酵

1、用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌H-9为原始菌种；

2、斜面菌种活化：

将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12 h。

3、种子液培养：

将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180 rpm培养8 h；

4、黄豆底物制备：

（1）黄豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的黄豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用水清洗两边。

（2）浸泡：加入4倍体积（v/w）水，室温浸泡4 h。

（3）沥水：沥去浸泡后的黄豆中多余的水分，初始含水量为50%。

（4）蒸煮：115℃高温高压蒸煮30 min，冷却至室温。

5、发酵培养：按照4%（v/w）的接种量，加入黄豆中混匀，31℃静止培养36 h，获得黄豆纳豆食品。

6、纳豆激酶活性分析：向发酵黄豆中加入20倍体积（v/w）水，200 r/min水提1 h，5000 g离心20 min除去菌体，上清液为纳豆激酶水提物。采用实施例1所述纳豆激酶活性分析方法，检测分析发酵黄豆中纳豆激酶活性为91.7 FU/g（干重）。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌H-9 （Bacillus subtilis），其保藏编号为：CCTCC NO：M2016293。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌H-9在以黄豆为底物制备纳豆食品中的应用。

3.一种纳豆食品，其特征在于，所述纳豆食品由豆类底物经权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵制得。

4.根据权利要求3所述的纳豆食品，其特征在于，所述豆类底物为黄豆。

5.一种纳豆食品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将权利要求1所述枯草芽孢杆菌H-9菌株接在LB液体培养基上37℃培养12 h后放置于无菌管中，-20℃冷冻保藏；

2）制备种子液；

3）制备豆类发酵底物，其中所述豆类为黄豆；

4）发酵培养：按照2%-5%（v/w）的接种量，将种子液加入豆类发酵底物中混匀，28-42℃静止培养36-48 h，获得纳豆食品。

6.根据权利要求4所述的纳豆食品的制备方法，其特征在于，所述种子液制备方法包括以下步骤：

1）将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养12 h，使其活化；

2）将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37℃，180 rpm培养8-14 h，制得种子液。

7.根据权利要求4所述的纳豆食品的制备方法，其特征在于，所述豆类发酵底物制备方法包括以下步骤：

1）精选：去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；

2）浸泡：加入4倍体积（v/w）的水，室温浸泡4 h；

3）沥水，使豆子的初始含水量为50%-70%；

4）蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115℃高温高压蒸煮30 min，制得豆类发酵底物。