JP6800950B2 - 血栓溶解酵素の高生産のバチルス・サブチリス菌株 - Google Patents
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Description
本発明は、血栓溶解酵素を高生産するバチルス・サブチリス菌株に関する。
血栓溶解酵素である納豆キナーゼ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）は、納豆の発酵に関与する菌であるバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその類縁菌によって生産されるセリンタンパク質加水分解酵素（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の一種である。納豆キナーゼは、大豆発酵食品である韓国の清麹醤、日本の納豆などで容易に確認でき、強力なフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）分解活性を有するので、血栓の溶解に有効であると知られて、清麹醤と納豆との重要な機能性を示す成分の１つとして脚光を浴びている。
前記バチルス・サブチリスは、大豆を培地で培養した場合以外にも、差はあるが、多様な物質を基質として培地中に血栓溶解酵素を蓄積する。したがって、バチルス・サブチリスを多様な培養方法で培養すれば、血栓溶解酵素の量産が可能なので、納豆キナーゼ製品を安価で供給するために努力している（特許文献１、特許文献２）。
最近、食品として簡便に摂取することができる納豆の血栓溶解酵素の活性を高めるための多様な方法に関する研究が進められている。
納豆の血栓溶解酵素の活性は、発酵菌の種類、大豆の品種、培養条件などによって影響を受けると知られている。しかし、納豆製造時に、血栓溶解酵素の活性が高く示される大豆の品種を使用することは可能であるが、大豆の品種を制限する方法で同じ品質の納豆を量産するという側面では制限性がある。一例として、おからは、血栓溶解酵素の活性を高める培地の１つとして知られているが、おからを大豆と共に混ぜて発酵させることは、納豆の食感や外形に大きな影響を及ぼすので、望ましい方法はならない。また、培養時間、温度及び湿度などの培養条件を変化させる方法は、血栓溶解酵素の活性を高めることができるが、これは、納豆の味、香、外観のような嗜好性に多大な影響を及ぼすので、望ましい方法とは言えない。
一方、既存の宮城野菌または高橋菌などの市販の納豆菌は、同じ培養条件で互いに異なる血栓溶解酵素の活性を示すと知られている。また、従来、市販の納豆菌に比べて、血栓溶解酵素（特許文献３）の活性が２倍増加した新規菌株に関する技術内容が開示されており、血栓溶解酵素を量産するためには、活性が高い菌株の開発が最も効率的な方法であるということが分かる。
しかし、血栓溶解を目的として納豆を摂取する場合には、納豆菌によって納豆に生成及び蓄積されるＫ２などのビタミンによる副作用を考慮しなければならない。納豆に含有されたビタミンＫ２は、メナキノン−７（ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ−７）で血液凝固を促進し、骨形成を促進する因子として知られている。一般的に、納豆には、６００〜９００μｇ／１００ｇのビタミンＫ２が含有されて、ビタミンＫ２高含量食品に分類されている。参考までに、成人１人当たり１日勧奨摂取量は、日本の場合、男性は７５μｇであり、女性は６０〜６５μｇであり（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇ，２００７，Ｖｏｌ．５３，４６４−４７０）、米国の場合、男性は１２０μｇ、女性は９０μｇ（Ｊ Ａｍ Ｄｉｅｔ Ａｓｓｏｃ．，１９９６，ｖｏ１．９６，１４９−１５４）である。したがって、４０〜５０ｇの内容量で包装されて販売される通常の納豆１ケース（ｃａｓｅ）を摂食する場合、算術的に３００〜４５０μｇに相当する相当量のビタミンＫ２が同伴摂取される。また、血栓形成抑制剤の１つであるワーファリンを服用する患者の場合に、ビタミンＫ２がワーファリンの作用を抑制するので、納豆の摂取を制限している。前記のように、納豆に含まれたビタミンＫ２の問題点を解消するために、従来、エタノールなどの有機溶媒を用いて納豆に含まれたビタミンＫ２を除去する精製段階を導入して納豆を生産しているが（特許文献２、特許文献１）、前記のような精製段階は、工程が複雑であって、製造コストが増加するという問題がある。
前記のように、納豆の摂取は、食品本来の味と香とを楽しみながらも、精製した酵素よりは十分な量の血栓溶解酵素を安価で提供されうるという長所があるが、ビタミンＫ２の含量が問題点として台頭しつつあり、従来に知られた納豆菌などは、おからを培地として活用する場合、嗜好性が落ちるという短所があって、このような問題点を解決することができる方法についての研究が必要である。
本発明の発明者らは、血栓溶解酵素の活性が高い納豆の製造を目標として鋭意研究した結果、従来に開発された納豆菌株よりも血栓溶解酵素の高生産能を有する新たな菌株であるバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＤＮ）の分離に成功し、当該菌株をおからで培養したおから発酵物の場合、血栓溶解酵素の活性が大豆発酵物に比べて、さらに増加するという事実を確認して、固体培養を通じても、血栓溶解酵素を効率的に生産可能であるということが分かった。
これにより、本発明では、血栓溶解酵素である納豆キナーゼを高生産するバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株に対する技術内容を提供しようとする。
前記のような技術的課題を果たすために、本発明は、血栓溶解酵素を高生産するバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＤＮ、受託番号ＫＣＴＣ１３０２０ＢＰ）を提供する。
また、前記菌株が、配列番号１の１６ｓＲＮＡを含むことを特徴とする。
また、本発明は、前記菌株を用いて発酵させた培養物を提供する。
また、前記培養物は、納豆であり、前記培養物に含まれた血栓溶解酵素が、納豆キナーゼであり得る。
また、前記培養物は、おから発酵物であり、前記おから発酵物は、３４００〜４３００ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔ／ｇの血栓溶解酵素の活性を示すことを特徴とする。
また、本発明は、前記培養物を含む食品組成物を提供する。
また、本発明は、前記菌株を用いて発酵させる段階を含む血栓溶解酵素の製造方法を提供する。
また、前記発酵が、納豆の発酵であることを特徴とし、前記納豆の発酵によって納豆キナーゼが製造されることを特徴とする。
また、前記発酵が、生おからの発酵であることを特徴とする。
本発明によるバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株は、宮城野菌のような従来の納豆菌に比べて、血栓溶解酵素の生産能が顕著に高く、本発明のバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株で製造した納豆を摂取する場合、従来の納豆菌によって製造した納豆を摂取する場合に比べて、納豆の摂取量を５分の１程度に減らしても、血栓溶解酵素の活性は同様に保持し、ビタミンＫ２の摂取量は、１日勧奨量の限界値内に調節することができて、前記バチルス・サブチリスＧＤＮ菌株は、血栓溶解を目的とした多様な食品の製造のために効果的に活用が可能である。
また、本発明によるバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株を培養したおから発酵物の場合、大豆発酵物に比べて、血栓溶解酵素の活性がｌ．５倍以上高い特性を示して、追加的な処理なしに固体培養を通じて効率的に血栓溶解酵素を生産し、培地から簡単な操作を通じて血栓溶解酵素を容易に精製することができて、血栓溶解酵素の生産コストを画期的に節減することができるだけではなく、産業廃棄物であるおからをリサイクルできるという点で環境に優しい。
また、前記菌株は、大豆類または生おからなどを発酵時に、血糖降下に効果があるα‐グルコシダーゼ阻害剤を多量生成して、成人病の予防にも効果的な食品製造が可能であるだけではなく、味、粘質物の強度、外形などの官能特性に優れた納豆を製造することができる。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、血栓溶解酵素を高生産するバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＤＮ、受託番号ＫＣＴＣ１３０２０ＢＰ）を提供する。
前記菌株は、稲わら及び乾草から耐熱性胞子を形成する菌を分離し、大豆類または生おからなどの発酵時に、高含有の血栓溶解酵素を生産する菌株を選別することで得られる。選別された前記菌株は、血栓溶解酵素、特に、納豆キナーゼを高含有で生産し、納豆の発酵において、一般菌株を使用した場合に比べて、５倍以上に高い血栓溶解酵素の活性を有する納豆を生産することができる。
これにより、本発明のバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株で製造した納豆を摂取する場合、従来の納豆菌によって製造した納豆を摂取する場合に比べて、納豆の摂取量を５分の１程度に減らしても、血栓溶解酵素の活性は同様に保持し、ビタミンＫ２の摂取量は、１日勧奨量の限界値内に調節することができて、前記バチルス・サブチリスＧＤＮ菌株は、血栓溶解を目的とした多様な食品の製造のために活用が可能である。
また、本発明によるバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株を培養したおから発酵物の場合、大豆発酵物に比べて、血栓溶解酵素の活性が１．５倍以上高い特性を示して、追加的な処理なしに固体培養を通じて効率的に血栓溶解酵素を生産し、培地から簡単な操作を通じて血栓溶解酵素を容易に精製することができて、血栓溶解酵素の生産コストを画期的に節減することができるだけではなく、産業廃棄物であるおからをリサイクルできるという点で環境に優しい。
前記菌株は、大豆類または生おからなどを発酵時に、血糖降下に効果があるα‐グルコシダーゼ阻害剤を多量生成して、成人病の予防にも効果的な食品製造が可能であるだけではなく、味、粘質物の強度、外形などの官能特性に優れた納豆を製造することができる。
前記菌株は、下記の配列番号１の１６ｓＲＮＡを有することを特徴とする。
配列番号１：
ＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴ
ＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴ
また、本発明は、前記バチルス・サブチリスＧＤＮ菌株を用いて発酵させた培養物を提供する。
望ましくは、前記培養物は、生おからに前記菌株を接種して発酵させたおから発酵物であり、前記おから発酵物は、３４００〜４３００ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔ／ｇの優れた血栓溶解酵素の活性を示すことができる。
また、前記培養物は、大豆類に前記菌株を接種して発酵させた大豆類の培養物であり、望ましくは、納豆であり得る。前記菌株を接種して発酵させた納豆は、２３００〜２５００ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔ／ｇの血栓溶解酵素の活性を示して、宮城野菌のような従来の納豆菌を接種して発酵させた納豆（４００〜５００ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔ／ｇ）に比べて、血栓溶解酵素の活性が５倍以上優れている。
また、本発明は、前記培養物を含む食品組成物を提供する。
また、本発明は、前記菌株を用いて発酵させる段階を含む血栓溶解酵素の製造方法を提供する。前記血栓溶解酵素の製造方法では、生おからを発酵させておから発酵物を製造し、各種の大豆類を発酵させて納豆などの大豆発酵物を製造し、前記大豆発酵物は、血栓溶解酵素として納豆キナーゼを含みうる。
また、前記おから発酵物は、優れた血栓溶解酵素の活性を示し、前記血栓溶解酵素の製造方法は、産業廃棄物であるおからを用いて追加的な処理なしに固体培養を通じて効率的に血栓溶解酵素を生産し、培地から簡単な操作を通じて血栓溶解酵素を容易に精製することができて、血栓溶解を目的とする多様な食品製造のために活用可能である。
以下、本発明を実施例を挙げてより詳しく説明する。
提示された実施例は、本発明の具体的な例示であり、本発明の範囲を制限するためのものではない。
１．菌株の探索
韓国、中国、日本、米国など世界各地から収集した約５００余点の稲わら及び乾草を試料として微生物を分離した。各試料を滅菌食塩水に少量加えて懸濁させた後、８０℃恒温水槽で３０分間熱処理して得た胞子液を２％寒天を含有するＬＢ平板培地（１％トリプトン、０．２％砂糖、０．５％酵母抽出物及び０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に塗抹し、３７℃の培養器で１日間培養した後、菌集落を形成する菌体を分離した。
血栓溶解酵素の生産量を調査するために、分離された菌株を５ｍｌの５％大豆粉を懸濁した培地に接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養液を遠心分離して、上澄み液から血栓溶解酵素の活性をフィブリン平板法（ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。
前記フィブリン平板法は、下記に示した方法で行った。
まず、１．２％のフィブリノーゲン溶液（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２．５ｍｌ、２０ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）５００μｌ、１％のアガロース溶液（ａｇａｒｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）７ｍｌが溶解された０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）をペトリディッシュ（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）に入れ、均一に開かれた状態で固化させてフィブリン平板（ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔｅ）を製造した。パスツールピペットを用いてフィブリン平板に一定間隔で空隙を形成させた。それぞれの菌株を培養して作った試料２μｌを空隙に注入して３７℃で培養し、形成されたクリアゾーン（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）の面積から血栓溶解酵素の活性を測定した。
前記の過程を通じて、活性が強い順に８０種の菌株を分離して、血栓溶解酵素生産菌で１次選抜した後、簡易同定法（Ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｏ１．２．ｐ．１６６８，１９９２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）で血栓溶解酵素の活性が高い５種の菌株を２次選抜した。分離した５種の菌株は、１６ｓＲＮＡ塩基配列分析を通じてバチルス・サブチリスに同定になり、配列番号１の塩基配列を有するという事実を確認した。血栓溶解酵素の活性が最も高い１種の菌株をバチルス・サブチリスＧＤＮ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＤＮ）と名付け、韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に２０１６年５月３日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０２０ＢＰ）。
配列番号１：
ＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴ
ＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴ
また、分離した菌株を顕微鏡で観察し（図１参照）、形態学的特性を分析して、下記の表１に示した。
表１に示すように、分離した菌株は、グラム陽性であり、細胞のサイズは、ほぼ０．６〜０．７×１．４〜１．６μｍであることを確認することができ、前記結果を総合して、バチルス・サブチリスＧＤＮ菌株の分類学上の位置を図２に示した。
また、分離した菌株の生化学的特性の分析結果を下記の表２に示した。
２．フィブリン溶液を用いた血栓溶解酵素の活性測定
希釈した試料１００μｌと０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２００μｌ（１０ｍＭ ＣａＣ１２含む、ｐＨ７．８）、０．４％フィブリン溶液（ｐＨ７．０）２００μｌとを混合した後、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応停止液（０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸含有０．１１Ｍトリクロロ酢酸）５００μｌを添加し、遠心分離して上澄み液を収得した。該収得した上澄み液に２７５ｎｍ波長の光を照射して吸光度を測定した（但し、血栓溶解酵素の活性１ｕｎｉｔは、３７℃で反応して１分間作り出す１μｇのチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）の量と同じである）。
希釈した試料１００μｌと０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液２００μｌ（１０ｍＭ ＣａＣ１２含む、ｐＨ７．８）、０．４％フィブリン溶液（ｐＨ７．０）２００μｌとを混合した後、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応停止液（０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸含有０．１１Ｍトリクロロ酢酸）５００μｌを添加し、遠心分離して上澄み液を収得した。該収得した上澄み液に２７５ｎｍ波長の光を照射して吸光度を測定した（但し、血栓溶解酵素の活性１ｕｎｉｔは、３７℃で反応して１分間作り出す１μｇのチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）の量と同じである）。
３．大豆発酵物の製造及び血栓溶解酵素の活性分析
洗浄した大豆を室温で一晩浸漬した後、１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌（ａｕｔｏｃｌａｖｅ）して、煮た大豆を作った。煮た大豆５０ｇ当たりバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株胞子液（１０５胞子／ｍｌ）１ｍｌの比率で煮た大豆が冷める前に接種して、発泡スチレン容器に入れ、被膜を行って、３７℃で１８時間培養した。その後、４℃で２４時間熟成して、大豆発酵物を製造した。対照群としては、市販の宮城野菌を使用した。
洗浄した大豆を室温で一晩浸漬した後、１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌（ａｕｔｏｃｌａｖｅ）して、煮た大豆を作った。煮た大豆５０ｇ当たりバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株胞子液（１０５胞子／ｍｌ）１ｍｌの比率で煮た大豆が冷める前に接種して、発泡スチレン容器に入れ、被膜を行って、３７℃で１８時間培養した。その後、４℃で２４時間熟成して、大豆発酵物を製造した。対照群としては、市販の宮城野菌を使用した。
製造した大豆発酵物の血栓溶解酵素の活性を測定して、下記の表３にその結果を示した。
表３に示すように、大豆発酵物で血栓溶解酵素の活性の測定結果、実施例のＧＤＮ菌で製造した大豆発酵物の血栓溶解酵素の活性は、対照群である宮城野菌に比べて、約５倍の酵素活性が増加したことを確認することができた。
すなわち、実施例のＧＤＮ菌は、従来の納豆菌に比べて、血栓溶解酵素の生産能が顕著に高いので、当該菌で製造した納豆は、一般的な納豆の摂取量の５分の１程度に減らして摂取しても、従来の納豆１ケースから期待することができる血栓溶解酵素を供給されうるということを確認することができた。
参考までに、ビタミンＫ２の１日勧奨量は、日本の場合、男性が７５μｇであり、女性が６０〜６５μｇであるが、従来の納豆菌で製造した納豆１ケースを摂取する場合、３００〜４５０μｇのビタミンＫ２が供給されるので、１日勧奨量を約５倍超過する。しかし、実施例のＧＤＮ菌株で製造した納豆は、前記従来の納豆の１／５程度の量を摂取しても、血栓溶解酵素の活性はそのまま保持し、ビタミンＫの量を１日勧奨量の限界値内に調節することができるという事実を確認することができた。
３．官能評価
前記の方法で得られた大豆発酵物について官能評価を行った。官能評価は、５段階評価法で行い、５点は非常に良好、４点は良好、３点は普通、２点は不良、１点は非常に不良として、下記の５項目について評価し、その結果を下記の表４に示した。
前記の方法で得られた大豆発酵物について官能評価を行った。官能評価は、５段階評価法で行い、５点は非常に良好、４点は良好、３点は普通、２点は不良、１点は非常に不良として、下記の５項目について評価し、その結果を下記の表４に示した。
表４に示すように、官能評価を行った結果、ＧＤＮ菌株で製造した大豆発酵物の官能評価は、３．６〜４．８点の高い点数が出て、納豆のような大豆発酵物で開発しても、立派な製品になりうるということを確認することができた。
４．おから発酵物の製造
当日製造された生おから（３種）をそのまま１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌し、該滅菌したおから５０ｇ当たり１０５胞子／ｍｌの胞子液を１ｍｌの比率で冷める前に接種して、３７℃で２４時間培養した。
当日製造された生おから（３種）をそのまま１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌し、該滅菌したおから５０ｇ当たり１０５胞子／ｍｌの胞子液を１ｍｌの比率で冷める前に接種して、３７℃で２４時間培養した。
製造したおから発酵物（３種）の血栓溶解酵素の活性を測定して、下記の表５にその結果を示した。
表３に示すように、互いに異なる３つの工場で製造したおからを発酵して生成されたおから発酵物の血栓溶解酵素の活性を測定した結果、おから発酵物が大豆発酵物よりも酵素生産量がほぼ１．５倍高いと確認された。これを通じて、産業廃棄物であるおからを用いて追加的な処理なしに固体培養を通じて効率的に血栓溶解酵素の生産に用いられうるということを確認することができた。
５．おから発酵物で血栓溶解酵素の精製
おからを３０ｃｍ×２４ｃｍ×６ｃｍサイズのステンレストレー（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ ｔｒａｙ）に５００ｇずつ入れ、１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌した。該滅菌したおから１ｋｇ当たり１０５胞子／ｍｌの胞子液２０ｍｌを冷める前に加えて接種し、ビニール被膜を行って、３７℃で２４時間培養して、おから発酵物を製造した。該製造したおから発酵物に３倍量の水を加え、よく撹拌して血栓溶解酵素を抽出した。これにＣａＣｌ２の最終濃度が０．１ＭになるようにＣａＣｌ２粉末を加え、３０分間静置した後、遠心分離して沈殿を除去し、上澄み液であるおから抽出物を製造した。
おからを３０ｃｍ×２４ｃｍ×６ｃｍサイズのステンレストレー（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ ｔｒａｙ）に５００ｇずつ入れ、１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌した。該滅菌したおから１ｋｇ当たり１０５胞子／ｍｌの胞子液２０ｍｌを冷める前に加えて接種し、ビニール被膜を行って、３７℃で２４時間培養して、おから発酵物を製造した。該製造したおから発酵物に３倍量の水を加え、よく撹拌して血栓溶解酵素を抽出した。これにＣａＣｌ２の最終濃度が０．１ＭになるようにＣａＣｌ２粉末を加え、３０分間静置した後、遠心分離して沈殿を除去し、上澄み液であるおから抽出物を製造した。
また、上澄み液に２倍量のエタノールを加え、遠心分離し、沈殿を凍結乾燥して、血栓溶解酵素粉末を製造し、血栓溶解酵素の活性を測定して、その結果を収率と共に下記の表６に示した。
表６に示すように、カルシウム（ＣａＣｌ２）処理したおから抽出物の血清溶解酵素の活性が非常に高いと確認された。これを通じて、ＧＤＮ菌株のおから発酵物に重量に比べて、３倍量の水を加えて均質化し、そこに最終濃度が０．１ＭになるようにＣａＣｌ２粉末を加え、３０分間静置すれば、おからから由来した固形分が凝集して容易に沈殿で除去され、血栓溶解酵素は、清い上澄み液に残るので、簡単な操作によっても、血栓溶解酵素の精製が高収率でなされるという事実を確認することができた。
本発明によるバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株は、血栓溶解酵素の生産能が顕著に高く、血栓溶解を目的とした多様な食品製造に活用されうる。
寄託機関名：韓国生命工学研究院韓国微生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号：ＫＣＴＣ１３０２０ＢＰ
受託日：２０１６０５０３
受託番号：ＫＣＴＣ１３０２０ＢＰ
受託日：２０１６０５０３
（受託証）
Claims (4)
- 配列番号１の１６ｓＲＮＡを含み、血栓溶解酵素を高生産するバチルス・サブチリスＧＤＮ菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＤＮ、受託番号ＫＣＴＣ１３０２０ＢＰ）を用いて発酵させたおから発酵物であって、３４００〜４３００ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔ／ｇの血栓溶解酵素の活性を示すおから発酵物。
- 前記おから発酵物に含まれる前記血栓溶解酵素が納豆キナーゼである、請求項１に記載のおから発酵物。
- 請求項１に記載のおから発酵物を含む食品組成物。
- 請求項１に記載のおから発酵物を用いる段階を含む、血栓溶解酵素の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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