KR100267185B1 - 아스퍼질러스 오리재 p f 및 이로부터 생산된 단백질 분해효소 - Google Patents

아스퍼질러스 오리재 p f 및 이로부터 생산된 단백질 분해효소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 오리재 PF(Aspergillus oryzaePF, KCTC 8843P) 및 이로부터 생산된 단백질 분해효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질식품의 가공에 이용할 수 있는 높은 역가의 단백질 분해효소를 개발하기 위하여 자연계 시료중(누룩, 메주, 어류 및 젓갈, 토양)에 분포하는 단백질 분해효소 생산균주중 생산효율이 가장 높은 아스퍼질러스 오리재를 분리 동정한 후, 동 균주에 대하여 UV를 조사하여 단백질 분해효소의 생산효율이 높은 아스퍼질러스 오리재 U-1 변이주(KCTC 8870P)를 선별하고, 다시 동 변이주에 에칠메칠설폰산을 처리하여 더욱 높은 활성의 단백질 분해효소 생산능을 보유한 아스퍼질러스 오리재 E-1 변이주(KCTC 8869P)를 각각 얻었다. 그런 다음, 본 발명은 이들 변이주의 안정성을 확보하기 위하여 상기 두 변이주를 이용한 세포질융합과정을 거침으로서 결과되는 아스퍼질러스 오리재 PF 및 이로부터 보다 효율적으로 생산된 높은 활성의 단백질 분해효소(Protease)에 관한 것이다.

Description

아스퍼질러스 오리재 ＰＦ 및 이로부터 생산된 단백질 분해효소
본 발명은 아스퍼질러스 오리재 PF(Aspergillus oryzaePF, KCTC 8843P) 및 이로부터 생산된 단백질 분해효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질식품의 가공에 이용할 수 있는 높은 역가의 단백질 분해효소를 개발하기 위하여 자연계 시료중(누룩, 메주, 어류 및 젓갈, 토양)에 분포하는 단백질 분해효소 생산균주중 생산효율이 가장 높은 아스퍼질러스 오리재를 분리 동정한 후, 동 균주에 대하여 UV를 조사하여 단백질 분해효소의 생산효율이 높은 아스퍼질러스 오리재 U-1 변이주(KCTC 8870P)를 선별하고, 다시 동 변이주에 에칠메칠설폰산을 처리하여 더욱 높은 활성의 단백질 분해효소 생산능을 보유한 아스퍼질러스 오리재 E-1 변이주(KCTC 8869P)를 각각 얻었다. 그런 다음, 본 발명은 이들 변이주의 안정성을 확보하기 위하여 상기 두 변이주를 이용한 세포질융합과정을 거침으로서 결과되는 아스퍼질러스 오리재 PF 및 이로부터 보다 효율적으로 생산된 높은 활성의 단백질 분해효소(Protease)에 관한 것이다.
최근 생명공학의 발전과 더불어 식품, 의약품 및 섬유산업에 이르기까지 효소의 이용분야 뿐만 아니라 효소자원의 수요 또한 급격히 증가하고 있으며, 따라서 다양한 생물로부터 새로운 많은 효소가 발견되고 있다.
산업적 이용을 위한 효소의 개발 생산에는 미생물이 주로 이용되고 있으며, 그 이유는 비교적 생장속도가 빨라 짧은 시간 내에 값싼 원료배지로써 목적으로 하는 효소의 생산효율을 높힐 수 있고, 또한 배양기법의 응용에 따라서는 다양한 변이균주의 개발이 가능하여 효소를 대량으로 생산할 수 있기 때문이다.
현재 산업적으로 생산되고 있는 효소는 단백질 분해효소(약 59%)와 당질분해효소(약 28%)가 절대적인 비율을 점하고 있다. 여기서, 당질분해효소는 내열성과 높은 활성 및 넓은 기질특이성에 걸쳐 많은 발전이 거듭되어 왔다. 그러나, 단백질 분해효소에 있어서는 뮤코 퓨실란(Mucor pusillans)이 생산하는 산성 단백질 분해효소가 산업에 많은 기여를 하였지만, 주로 이용되어온 미생물생산효소는 알카리성에서 최대활성을 갖는 특성 때문에 세제 등에 이용되어온 서브틸리신이나 고온 조건에서도 활성이 강한 서모리신과 같이 원핵생물의 일종인 세균(bacteria)류가 생산한 효소에 거의 국한되어 왔을 뿐, 곰팡이와 같은 진핵생물에 의한 효소의 생산은 관련 연구가 극히 부진하였다. 따라서, 환경조건의 변화에 따른 생산효율 및 변이균주의 발생으로 인한 오염 등의 문제가 있어 바람직하지 않아 왔다.
오늘날, 효소생산의 효율을 높히기 위한 형질전환 방법으로는 원형질체 융합법이 흔히 이용되고 있다. 즉, 균사체에 적당한 세포벽 융해효소를 처리하여 세포형태 등의 골격을 유지해주는 세포벽을 제거하고, 결과된 각각의 원형질체를 혼합한 후, 이들 세포벽이 제거된 원형질체의 세포막사이에 상호교환이 일어나게 하므로써 원형질체 융합을 유도한다. 이때, 원형질체 융합을 유도하는 방법으로는 폴리에틸렌글리콜과 염화칼슘에 처리하는 방법과 폴리에틸렌글리콜 처리를 대행하여 전기충격을 일으키는 전장유도접합에 의한 방법이 있고, 이 두가지의 방법중 특별한 장치가 필요하지 않는 전자의 방법이 널리 채용되어 산업적으로도 많은 이용추세에 있다〔Bigelis, 1992 : Ushijima 등, 1991〕.
또한, 원형질체융합 변이균주를 이용한 효소의 생산과 관련하여 그 연구동향을 보면 크게 두가지로 분류된다. 그 중, 한 연구는 국균이 준유성 세대를 가진다는 점에 착안한 방법으로서 인접한 두 종의 균주간에 근접융합을 이용한 방법이다. 즉, 간장생산용 국균 아스퍼질러스 오리재 변이주 No. 13의 영양요구성이 없는 변이주를 이용한 원형질체 융합처리하여 변이주를 얻음으로써, 생장률이 빠른 균주와 활성이 높은 단백질 분해효소를 생산하는 균주의 두 특성을 모두 얻을 수 있는 방법이 있다. 그리고, 또 다른 방법으로 간장 제조시 유용한 균주를 얻기 위하여 효소생산에 중점을 두고 아스퍼질러스 소재의 원형질체융합에 관하여 실험한 결과, 몇몇의 이배체에 의하여 높은 효소 생산성을 나타내었다고 보고하였다〔Ushijima 등, 1991〕. 그러나, 이들 방법은 여전히 효소의 생산효율이 높지 않아 경제성이 낮은 문제점이 있어 왔으며, 또한 이로부터 생산된 단백질 분해효소의 역가 및 활성 등에 있어서도 바람직하지 않은 점이 있어 왔다.
이처럼 아스퍼질러스 속을 이용한 장유 양조에 관한 연구는 일본을 중심으로 활발한 연구가 이루어져 왔으나, 단백질 분해효소의 산업적 생산에 응용한 연구는 효소생산 균주의 생리적인 특성 등 부분적인 초기 연구는 되어있지만, 배지조건으로서 산업화에 유리한 액체배지에로의 변환에 의한 산업화 단계까지는 아직 연구가 되어있지 않다.
본 발명은 단백질 식품의 이용 및 가공에 기여할 수 있는 단백질 분해효소의 역가를 높이기 위하여, 누룩, 메주, 어류, 젓갈 및 토양 등의 시료중에서 단백질 분해효소 생산에 적합한 균주로 아스퍼질러스 오리재균을 분리 동정하였으며, 동 균주를 UV-조사, 에칠메칠설폰산처리, 원형질체 융합 등의 변이과정을 통하여 높은 생산효율을 갖는 아스퍼질러스 오리재 변이주 및 이로부터 생산된 높은 활성의 단백질 분해효소를 검색하였다.
따라서, 본 발명은 높은 활성의 단백질 분해효소를 보다 효율적으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 균체의 성장률도 높혀줌으로써 보다 안정한 균주의 확보가 가능한 신규 미생물 아스퍼질러스 오리재 PF(KCTC 8843P) 및 이로부터 생산된 단백질 분해효소를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은 신규 미생물 아스퍼질러스 오리재 PF(KCTC 8843P)를 그 특징으로 한다.
또한, 본 발병은 상기 균주로부터 생산된 단백질 분해효소를 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 높은 활성의 단백질 분해효소를 보다 효율적으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 균체의 성장률도 높혀줌으로써 보다 안정한 균주의 확보가 가능한 형질전환 신균주 아스퍼질러스 오리재 PF와 이들로부터 생산된 단백질 분해효소에 관한 것이다.
이를 단계별로 설명하면 다음과 같다.
[아스퍼질러스 오리재의 분리]
본 실험에서 사용한 균주는 오도넬 등[O'Donell, 1992]이 이용한 방법을 약간 수정하여 분리하였다. 즉, 각 5 g의 균주분리용 시료에 0.1% 트윈 #80 용액을 100 ㎖ 가하여 초음파 세척기로써 현탁시켜 살균한 거어즈로서 여과하였다. 이 여액을 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 최소 한천 평판배지에 각각 도말하고 30℃에서 3일간 배양하여 균총 주위의 투명환이 큰 균주들을 선택적으로 분리하였다.
분리된 균주는 다시 최소액체배지에 각각 접종하고, 30℃에서 3일간 배양 후에 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 상등액을 아조카제인 기질로써 단백질 분해능을 측정·비교하였다. 이 결과, 균주 배양액의 단백질 분해능이 강한 균주는 누룩으로부터 분리한 아스퍼질러스 오리재 균주로 검색되었기에 다음의 실험은 이 아스퍼질러스 오리재 균주와 관련하여 진행하였다.
[형태 및 배양학적 특성]
이 균주는 완전한천배지(8% 맥아한천배지, pH 6.0)에서 배양하였을 때, 외관상으로 곰팡이의 형태를 갖추고, 흰색 균총에 분생자의 색상이 초기에는 흰색에서 배양기간이 지남에 따라 황색, 녹색, 갈색의 색상을 가지는 것으로 나타났다. 또한, 완전배지에서 배양하였을 때 균사체가 솜털뭉치 형태를 가지고 부드러운 분생자를 가짐으로써 분생자의 색상 변화 및 외관상의 형태와 생리적 특성을 아스퍼질러스 오리재 표준균주(A. oryzaeATCC 14156,A. oryzaeATCC 14605,A. oryzaeATCC 11489 및A. oryzaeIAM 2640)와 비교·확인한 결과 아스퍼질러스 오리재로 동정할 수 있었다.
[생리학적 특성]
동 균주를 단백질 분해효소 생산용 배지(탈지대두분말, 2%; 유당, 2%; KH2PO4, 3%; CaCO3, 0.3%; MgSO4·7H2O, 0.06%, pH 7.0)에서 진탕배양하였을 때, 균체량은 20 ㎎/㎖이었다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 다음 측정한 결과, 상등액 중의 단백질 농도는 0.52 ㎎/㎖이었으며, 단백질 가수분해효소의 활성은 아조카제인을 기질로 하였을 때 0.231 U/㎖로 나타났다.
[동정 및 명명]
황녹 아스퍼질러스 오리재속의 분류에서 분생자벽에 작은 돌기가 전혀없고, 거친 컵모양의 형태를 나타내며, 분생자가 완전히 성장하였을 때 녹색을 띄고 기간이 지날수록 갈색을 띄는 균주는 아스퍼질러스 오리재 변이주 브뢰누스 무라까미(A. oryzaevar.brunneusMurakami)로, 계속적으로 녹색을 유지하는 균주를 아스퍼질러스 오리재 변이주 비리디스 무라까미(A. oryzaevar.viridisMurakami)로, 자낭이 없고 분생자의 크기가 직경 5 ∼ 6 ㎛ 이상인 것을 아스퍼질러스 오리재(알부르그) 콘 변이주 오리재(A. oryzae(Ahlburg) Cohn var.oryzae)로 분류된다(Raper와 Fennel, 1965; 회창, 1985).
이 분류방법에 비추어 볼때, 본 균주는 아스퍼질러스 오리재 변이주 브뢰누스 무라까미(A. oryzaevar.brunneusMurakami)로 분류될 수 있었으며, 따라서 본 발명에서 분리된 균주는 아스퍼질러스 오리재 O-1으로 분류·명명하였다.
[아스퍼질러스 오리재 U-1 변이주의 제조]
아스퍼질러스 오리재 O-1 균주를 완전배지에 배양하여 포자 현탁액을 얻은 다음, 이 포자 현탁액을 페트리 접시에 취하여 자외선 등으로 시간별로 조사 시켰다. 자외선 조사를 마친 포자 현탁액을 최소 한천배지에 도말하여 3일간 배양 후, 각각의 균총을 멸균한 0.1% 트윈(Tween) #80 용액에 현탁시켜 포자 현탁액을 얻었다.
이 현탁액 0.1 ㎖씩을 단백질 분해효소 활성 검색 배지에 각각 도말하고 배양하여 투명환이 가장 큰 균주를 취하였다. 이 균주를 다시 효소생산배지에서 배양하여 각 배양물로서 측정한 단백질 가수분해효소의 활성을 다음 표 1에 나타내었다. 그리고, 이중 효소활성이 가장 높은 균주를 아스퍼질러스 오리재 U-1이라 명명하였고, 이를 1998년 2월 2일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8870P를 부여받았다.
아스퍼질러스 오리재 균주의 자외선 조사시간에 따른 각 배양액의 단백질 가수분해 활성의 비교
자외선조사시간(초) 균주수 단백질분해활성 (U/ml) 자외선조사시간(초) 균주수 단백질분해활성 (U/ml)
30 1 0.230 120 1 0.372
2 0.178 2 0.520
3 0.385 3 0.442
4 0.1400 4 0.347
5 0.130 5 0.508
6 0.307 6 0.698
7 0.810 7 0.382
8 0.495 8 0.212
9 0.240 9 0.870
10 0.398 10 0.588
60 1 1.770 150 1 0.390
2 0.412 2 0.950
3 0.126 3 0.615
4 0.490 4 0.570
5 0.330 5 0.323
6 0.230 6 0.450
7 0.640 7 0.760
8 0.472 8 0.130
9 0.699 9 0.988
10 0.312 10 0.875
90 1 0.265 180 1 0.940
2 3.294* 2 0.305
3 0.242 3 0.360
4 1.050 4 0.190
5 2.100 5 0.420
6 0.280 6 0.330
7 0.452 7 0.378
8 0.470 8 0.440
9 0.135 9 0.212
10 0.412 10 0.630
주식회사 * : 본 균주를 활성이 높은 단백질 분해효소 생산균주로서 선별하고, 아스퍼질러스 오리재 U-1(KCTC 8870P)으로 명명함.
[아스퍼질러스 오리재 E-1 변이주의 제조]
상기에서 분리한 아스퍼질러스 오리재 U-1 균주의 포자를 인산염완충액 (pH 7.2)에 현탁한 후, 이 현탁액에 에칠메칠설폰산을 0.5 M 되게 가하여, 시간별로 배양하였다. 그런 다음, 이들을 원심분리 후 포자 현탁액을 1 ∼ 100배의 범위로 희석하고 각각 0.1 ㎖씩 취한 뒤, 단백질 분해효소 활성 검색 배지에 도말하고 배양하여 투명환이 가장 큰 균주를 각각 배양하여 배양액중의 단백질 가수분해효소의 활성을 측정한 결과를 표 2에 나타내었다. 그 결과, 분리된 미생물을 아스퍼질러스 오리재 E-1으로 명명하고, 1998년 2월 2일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8869P를 부여 받았다.
아스퍼질러스 오리재 균주의 에칠메칠설폰산 처리시간에 따른 각 배양액의 단백질 가수분해 활성의 비교
EMS처리시간(초) 균주수 단백질분해활성(U/ml) EMS처리시간(초) 균주수 단백질분해활성(U/ml)
3 1 1.63 18 1 7.33
2 7.04 2 5.42
3 8.04 3 8.21
4 7.20 4 6.39
5 8.20 5 4.89
6 1 8.91* 30 1 8.77
2 2.14 2 7.50
3 0.34 3 5.60
4 0.62 4 8.13
5 0.49
12 1 0.88
2 0.68
3 0.88
4 0.43
5 0.63
주식회사 * : 본 균주를 활성이 높은 단백질 분해효소 생산균주로서 선별하 고, 아스퍼질러스 오리재 E-1(KCTC 8869P)으로 명명함.
[아스퍼질러스 오리재 PF의 제조]
아스퍼질러스 오리재 E-1(KCTC 8869P) 포자를 배양하여 균체를 흡인여과하므로써 모은 다음, 멸균수로서 세정 후, 과잉의 수분을 없애고, 적당량을 L자관에 넣었다. 다음 아스퍼질러스 오리재의 원형질체화액을 10 ㎖ 가하여, 30℃에서 3시간 동안 서서히 교반한 후에 반응액을 흡인여과함으로써 균체 잔사를 제거하고, 원형질체를 함유한 여액을 저속원심분리하여 원형질체를 얻었다.
얻어진 원형질체를 2회 세척한 다음, 최종 수용균의 농도가 2.5×108/㎖로 되도록 부피를 계산한 후, 폴리에틸렌글리콜-염화칼슘용액을 사용하여 원형질융합(protoplast fusion)이 일어나게 하였다.
상기 과정에 따라 얻어진 원형질 융합체를 각각 분리하고, 최소배지에 2 ∼ 3회 계대배양하므로써 완전한 형질전환체를 얻어 단백질 가수분해효소 활성이 높은 효소를 생산하는 균주를 분리하였다.
그리고, 이 분리된 신규 미생물을 1997년 11월 4일부로 대한민국 특허균주기탁기관인 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8843P를 부여받았다. 그리고, 상기 형질전환 신균주의 세균학적, 배양학적 및 미생물학적 특성을 검토한 결과 단백질 분해효소 생산능외에는 아스퍼질러스 오리재와 동일하였다.
[형질전환 신균주가 생산하는 단백질 분해효소의 생산, 분리 및 정제]
단백질 분해효소 생산성이 가장 높은 배지를 사용하여 균주를 배양하고 그 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후, pH 5.0으로 조절된 10% 탄닌용액으로서 최종농도가 3%되게 가하여 4℃에서 3시간 방치하였다. 이를 다시 원심분리하여 침전된 효소를 0.02 M 트리스-염산 완충액(pH 6.8)에 용해시켜 차가운 아세톤을 최종농도가 60% 되도록 가한 후, 4℃에서 3시간 동안 방치하여 효소를 침전시키고, 원심분리함으로써 가용성의 탄닌을 제거하였다. 이를 다시 3회 반복 후, 잔사를 소량의 0.2 M 트리스-염산 완충액(pH 7.5)에 용해시키고, 원심분리하여 효소농축액을 얻었다. 이 효소액에 황산암모늄으로 40 ∼ 80% 포화 염석획분을 얻어 투석막으로 0.02 M 트리스-염산 완충액(pH 7.5)에 대하여 투석을 시켰다. 투석 후, 원심분리한 상등액을 같은 완충액으로 평형화시킨 세파로스 칼럼[Q-Sepharose column(ψ 2.6 X 30 cm)]에 부가하여, 0 ∼ 0.5 M의 NaCl 농도구배법으로 용출시키고, 각 획분별로 단백질 분해효소 활성을 측정하여 단백질 분해효소 활성획분을 얻었다. 이를 0.02 M 인산나트륨 완충액(pH 6.5)에 대하여 투석 후, 원심분리(8,000×g, 20 min)한 상층 중의 효소액을 동일 완충액에 평형화시킨 SE-HPLC (ψ 0.75 x 60 cm)에 부가·용출시켜 단백질 분해효소 활성획분을 얻음으로써 단백질분해 정제효소를 분리하였다.
[단백질 분해효소 활성 등의 측정]
(1) 효소활성의 측정
본 발명에 따른 효소 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford, 1976)의 방법에 따라 측정하고, 표준 단백질(bovine serum albumin)로써 측정한 검량곡선에 의하여 단백질농도를 구하였다.
그리고, 결과된 효소의 활성은 아조카제인을 기질로 하여 측정하였다. 즉, 0.25 ㎖의 2% 아조카제인용액과 0.75 ㎖의 완충액을 가하여 50℃에서 5분간 예비 가열시킨후, 0.1 ㎖의 효소액을 가하여 10분간 반응시켰다. 이후 10% 삼염화초산을 1 ㎖ 가하여 반응을 정지시키고, 원심분리하여 유리된 색소의 량을 흡광도(파장 410 nm)를 측정하고, 아조카제인의 분해정도를 추정하였다.
효소의 활성 단위는 단위반응 시간(분)당 흡광도 값을 0.1 상승시키는데 필요한 효소량을 1 단위(U)로 나타내었다. 그리고, 고유활성(specific activity)의 계산은 측정된 효소활성값을 효소단백질의 농도로써 나눈 값으로 하였다. 그 결과, 각 변이조건별에 따른 생산된 단백질 가수분해효소의 활성과 균체량을 비교요약하면 다음 표 3과 같다.
각 조건별 변이주에 의한 단백질 가수분해효소의 활성 및 균체량의 비교
변이 균주 단백질가수분해효소활성(U/㎖) 균체량(㎎/㎖)
아스퍼질러스 오리재 0.23 20.22
아스퍼질러스 오리재 U-1 3.29 9.89
아스퍼질러스 오리재 E-1 8.91 8.75
아스퍼질러스 오리재 PF 19.00 13.50
(2)열과 pH에 대한 활성, 안정성 및 분자량 비교
최적 pH :각 기질용액에 대하여 각 pH별 반응액을 제조하고, 효소용액을 기질의 1/20,000(v/v) 양으로 가하여 30℃에서 5분간 반응시킨 후, 유리되어 나오는 생성물의 양을 측정함으로써 효소활성의 최적 pH를 구한 결과, 기질 아조카제인에 대하여 pH 6.50이었다.
최적 온도:효소용액을 최적 pH 조건에서 제조한 기질용액에 대하여 반응온도별(반응온도 25 ∼ 75℃, 간격 5℃; 반응시간, 5분)로 반응시켜, 생성물의 양을 측정함으로써 효소활성의 최적온도를 구한 결과, 이 효소의 반응 최적온도는 50℃이었다.
효소의 열 안정성:정제 효소를 0 ∼ 70℃의 각 온도에서 30분간 서서히 교반하면서 가온한 후에 각각 잔류하는 효소의 활성을 측정하고, 가온 전에 측정한 효소활성을 대조군으로 하여 상대활성을 구하여 측정한 결과, 온도 55℃까지는 안정하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 높은 활성의 단백질 분해효소를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 균체의 생장속도도 높혀줌으로써 효소의 생산효율이 높은 안정한 균주를 확보할 수 있다.
이렇게하여 얻어진 높은 활성을 갖는 단백질 분해효소의 생산 변이주가 생산한 효소를 이용하여 식품, 의약품 및 섬유산업 등의 여러 산업분야에서 널리 이용하므로서 각종 효과와 잇점을 얻을 수 있다.

Claims (1)

  1. 단백질 분해효소를 생산사는 아스퍼질러스 오리재 PF(Aspergillus oryzaePF; KCTC 8843P).
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