KR100459239B1 - 신규한 아스퍼질러스 오리재 변이균주 ｇｂ-106 및 이를 이용한 대두 효소식품 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물을 이용하여 대두효소식품을 제조함에 있어서, 한국전통메주에서 분리한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 친주를 셀렌산나트륨(Na2SeO4) 내성균주 선발법과 자외선 조사에 의하여 선발한 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106(KCTC 10189BP)과 본 발명 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) GB-106의 종국제조, 본 발명 종국제조를 이용한 고체발효에 관한 것으로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106은 흰색 분생포자를 형성하고 아밀라제, 프로테아제 등의 소화효소를 다량 생산하며, 상기 본 발명 균주를 대두를 배지원료로 사용한 고체배지에서 고농도로 발효시킨 본 발명 효소식품은 종래의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 친주 발효대두보다 매우 높은 소화효소활성을 가지며 유산균의 성장을 촉진하고 대장균의 성장을 억제하여 장의 소화작용과 배변작용을 촉진하는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 신규한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106 변이균주 및 이것의 종국제조방법과 그 방법에 의해 제조된 제조종국 그리고 아스퍼질러스 오리재 GB-106를 이용한 고체발효방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 전통메주로부터 분리한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 친주를 셀렌산나트륨과 자외선에 노출하여 흰색 분생포자를 형성하며 아밀라제(amylase), 프로테아제(protease) 등의 소화효소를 다량 생산할 수 있는 아스퍼질러스 오리재 GB-106 변이주를 얻어 이를 밀기울을 원료배지로 한 종 배양 기술을 확립하고, 대두를 배지원료로 사용한 고체배지에서 본 발명 균주의 효소 생산을 위한 발효 조건을 최적화하여 장내 음식물의 소화 및 장내 유익한 미생물의 생육을 촉진할 수 있는 대두 효소식품에 관한 것이다.
콩은 20%의 지질과 단백질 40%, 탄수화물 30%와 10%의 기타성분으로 구성되어 있는 것으로 동양에서 우수한 단백질 공급원으로 식품에 이용되어 왔다. 더욱이 대두발효식품은 우리나라의 전통발효식품으로 식 문화적 관점에서 뿐 아니라 영양학적인 관점에서 매우 우수한 식품으로 인정되고 있다.
대두발효식품에는 암, 혈관계 질환 골다공증 신장질환 등 각종 성인병 예방 및 치료효과를 나타내는 것으로 알려졌다(Messina 등, Mordern applications for an ancient been soybeans and the prevention and treatment of chronic disease. J. Nutr. 125:567-71, 1995). 최근에는 콩으로부터 미생물의 강력한 효소작용에 의하여 생성된 여러 종류의 펩타이드가 항암, 혈압강하, 혈중콜레스테롤 저하, 혈전저해 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려졌다(Shon 등, Physiological active peptide from food protein, Food Technology 7: 25-29, 1994).
자연 상태에서 전통메주 발효에는 수집 종의 균주가 복합적으로 작용하지만 주요 균주는 메주 외부 표면에서 증식하는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)와 바실러스(Bacillus)속 세균들이다. 바실러스속 균은 아스퍼질러스 오리재에 비하여 아밀라제, 프로테아제 등 효소 생성이 떨어지기 때문에 소규모의 장류제조 공장에서는 바실러스속 균으로 발효한 개량메주를 사용하고 있지만 고속의 대두발효를 요하는 오늘날 장류 산업에서는 아스퍼질러스 오리재를 이용하고 있다[김 등,Aspergillus속 균류들을 이용한 콩알메주 발효의 생화학적 특성, 한국산업미생물학회지 26(6):551-557, 1998; 유 등, 전통 된장 및 간장의 숙성 기간별 생육 미생물의 분리 및 동정 27(2):113-117, 1999; Yu, 등, Effect of steam-flaked or steam-rolled corn with or withoutAspergillus oryzaein the diet on performance of dairy cows fed during hot weather. J. Dairy Sci. 80(12):3293-7, 1997; McGilliard 등, Increase in milk yield of commercial dairy herds fed a microbial and enzyme supplement. J. Dairy Sci. 81(5):1353-7, 1988].
아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)는 오랫동안 검증을 거친 안전한 균주로 인식되어 있으며 양조산업, 장류산업, 최근 들어서 사료첨가제 산업 등에서 많은 균주가 선발 육종되어 이용되고 있다. 이와 같이 아스퍼질러스 오리재가 산업적 이용성이 높은 이유는 아스퍼질러스 오리재가 생산하는 아밀라제(amylase)의 전분 당화능과 프로테아제(protease)의 단백 분해능 때문이다. 따라서 산업체에서는보다 생산성 향상을 위하여 아밀라제와 프로테아제의 생산능이 우수한 균주선발 및 고속발효방법을 개발하고 있다.
미생물 변이주 개발 방법에는 전통적으로 자외선, 감마선, X-선 등을 조사하는 방법, 돌연변이 유도화학물질을 처리하는 방법, 세포막 합성 저해 항생제 처리 후 선별법 등이 있고, 최근의 유전공학적 기법에 의한 유전자 형질전환기법이 있지만 유전자 변형 생물의 위험성 등의 문제점이 있으므로 전통적 방법이 선호되고 있다. 그러나 변이주 개발방법으로 생체 독성이 강한 셀렌산나트륨을 이용한 변이유도 및 내성균주 선발하여 효소생성이 우수한 균주를 선별하는 방법은 아직 보고된바 없다.
지금까지 발효대두의 우수한 기능성에도 불구하고 발효대두를 장류제조를 위한 원료로 사용해 왔지만 발효대두를 그대로 효소식품으로 이용하고자 하는 연구는 없었다. 종래에 대두 발효에 이용된 아스퍼질러스 오리재의 효소 생성능이 장내 소화기능을 향진할 만큼 활성이 높지 않으며, 아스퍼질러스 오리재를 대두에 발효하는 과정 중에 바실러스속 균들이 오염되어 발효취가 나며 발효가 완료된 후에도 아스퍼질러스 오리재의 녹색 분생포자 색상으로 인하여 식품으로서 가치가 떨어지는 문제점이 있다.
한편 종래 축산분야에서는 아스퍼질러스 오리재를 대두박에 발효하여 발효생성물을 가축의 장내 유익한 미생물 균총을 유지하여 질병에 강한 건강한 가축육성 방법이 확립되었지만, 인간의 장운동을 촉진하는 기능성 식품으로 개발한 바는 없다(한 등, 황국균을 산란계 급여시 분중 미생물 군총, 난질 및 영양소, 대사율에미치는 영향. 아·태축산학회지 12:417-421, 1999)
본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 흰색 분생포자를 형성하며 아밀라제, 프로테아제를 다량 생산하는 신규한 균주를 제공하는데 그 목적이 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명 균주를 사용하여 밀기울을 원료 배지로 한 종국 배양기술 및 종국을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명 종국으로 대두를 원료배지로 한 고체발효기술 및 대두 효소식품을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 전통메주로부터 분리한 아스퍼질러스 오리재 포자를 셀렌산나트륨과 탈지 분유를 포함하는 고체 한천 배지에 도말하여 성장이 왕성하며 탈지분유 분해환이 큰 변이 균주를 1차 선발한 후 음식물의 소화와 관련되는 아밀라제, 프로테아제 활성이 우수한 균주를 2차 선발하고, 2차 선발된 균주의 포자에 자외선 조사에 의한 돌연변이를 유발하여 식품의 기호성을 향상시킬 수 있는 흰색 포자를 형성하는 균주를 최종 선발한 다음, 밀기울을 원료배지로 하는 고체배지에서 상기 균주의 대량발효를 위한 상기 균주의 종 배양 및 종국제조 기술을 확립하고, 대두의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 아밀라제 생성과 프로테아제 생성을 조사하여 상기 제조종국으로 대두를 원료배지로 사용한 고체배지에서 음식물의 소화 향상에 중요한 역할을 하는 소화효소의 생산을 향상시키기 위한 상기 균주의 발효조건을 최적화한 후, 상기조건에서 본 발명 균주를 발효시켜 효소식품을 제조하고, 상기 효소식품이 유산균의 성장을 촉진하고 대장균의 성장을 억제하는 효과를 규명함으로써 달성하였다.
도 1은 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106과 변이전 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 친주의 비교도,
도 2는 대두의 수분함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 변이주 GB-106의 아밀라제 활성도를 나타낸 그래프,
도 3은 대두의 수분함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 변이주 GB-106의 프로테아제 활성도를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명 대두 효소식품에 포함된 아밀라제의 pH 안전성을 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명 대두 효소식품에 포함된 프로테아제의 pH 안전성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 흰색 분생포자를 형성하며 아밀라제, 프로테아제 생산하는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106을 분리·동정하는 단계; 본 발명 균주를 사용하여 밀기울을 원료배지로 한 종국을 제조하는 단계; 대두의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 아밀라제 생성과 프로테아제 생성을 조사하여 상기 제조종국으로 대두를 원료배지로 사용한 고체배지에서 상기 소화효소의 생산을 향상시키기 위한 상기 균주의 발효조건을 최적화하는 단계; 대두를 배지원료로 사용한 고체배지에서 종국을 이용하여 발효시키는 고체발효단계; 상기 방법에 의해 제조된 본 발명 대두 효소식품의 pH에 대한 안정성과 장내 미생물 균총 형성에 미치는 영향을 조사하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 흰색 분생포자를 형성하며 아밀라제, 프로테아제 생산하는 균주의 분리 및 선발을 위하여 전통메주로부터 분리한 아스퍼질러스 오리재 포자를 셀렌산나트륨과 탈지 분유를 포함하는 고체 한천 배지에 도말하여 성장이 왕성하며 탈지분유 분해환이 큰 변이 균주를 1차 선발한 후 음식물의 소화와 관련되는 아밀라제, 프로테아제 활성이 우수한 균주를 2차 선발하였고, 2차 선발된 균주의 포자에 자외선 조사에 의한 돌연변이를 유발하여 식품의 기호성을 향상시킬 수 있는 흰색 포자를 형성하는 균주를 최종 선발하였다. 본 발명에서는 전통적, 화학적, 유전공학적 미생물 변이주 개발방법 대신 셀렌산나트륨을 이용하여 아스퍼질러스 오리재의 변이를 유도하였다. 위의 방법으로 새로운 균주를 분리하고 선발함으로써 기존의 대두 발효에 이용된 아스퍼질러스 오리재에 비해 아밀라제와 프로테아제 생성능이 뛰어나서 장내 소화기능을 향상시키고, 흰색 포자를 형성하여 식품의 가치를 높일 수 있다.
밀기울을 원료배지로 하는 고체배지의 상기균주의 대량발효를 위한 상기 균주의 종국 배양(seed culture) 기술을 확립하였다. 종국 배양은 밀기울 배지의 수분함량을 조정하고 스테인레스로된 체에 3-5 ㎝로 펼쳐서 121℃에서 20분 동안 멸균한 다음, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 분생포자 현탁액을 분사하여 접종하여 상기 고체배지를 30℃에서 5일 동안 배양·발효시킨다. 원료배지인 밀기울의 수분함량에 따른 종국 배양 후 발명 균주의 분생포자수(표2)를 살펴보면 수분함량이 35%이하에서는 균사성장이 충분하지 않는 상태에서 분생포자가 형성되어 분생포자수가 낮은 것으로 보이고 수분함량 50%이상에서는 균사성장은 잘되지만 높은 수분량에 의하여 공기와의 접촉이 부족하여 포자형성이 잘되지 않아서 그람당 분생포자수가 낮은 것으로 생각된다. 따라서 본 발명 균주 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 종국 배양을 위한 최적 원료배지는 밀기울 수분함량 40-45%로 나타난다.
상기제조종국으로 대두를 원료배지로 사용한 고체배지에서 음식물의 소화향상에 중요한 역할을 하는 각종 소화효소의 생산을 향상시키기 위한 상기 균주의 발효조건을 최적화한다. 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 아밀라제 생성은 배양36시간, 수분함량 50%에서 프로테아제 생성은 배양36시간, 수분함량 40%에서 가장 높게 나타난다.
고체발효방법은 정선된 대두를 물에 약 2시간 침지하여 수분함량이 40-50%가 되도록 하여 대형 압력솥에 넣고 열을 가하여 약 30분간 증자한 후, 종국 2g/대두원료 1kg 넣어 접종하고, 대두원료의 두께를 약 10㎝로 하여 평평하게 고른 후 광목을 덮어 품온이 30℃가 유지되도록 하여 12시간동안 분생 포자를 발아시켜, 상기 대두 원료를 광주리에 두께가 3-5㎝되도록 펼친 다음 물에 적신 광목 조각을 덮은 후 광주리를 여러 개 포개어 배지 품온이 30-33℃되도록 유지시키면서 상기 균주를 발효시킨다. 상기 조건에서 본 발명 균주를 발효시켜 효소식품을 제조한 후 상기 효소식품과 전통메주, 종래 대두 발효식품의 아밀라제 및 프로테아제의 역가를 비교한 결과 본 발명에 의한 대두 효소식품의 효소 활성이 현저히 뛰어남을 알 수 있다(표3).
본 발명 대두 효소식품의 pH에 대한 안정성을 살펴 본 결과 아밀라제는 pH 4-7에서 5시간 후 약 90%의 역가를 유지하였고 pH 3에서 5시간 후 약 45%의 역가를 유지하였으며, 프로테아제는 pH 3-7에서 5시간 후 약 90%의 역가를 유지하였고 pH 2.6에서 약 50%의 역가를 유지함을 알 수 있다. 사람의 위에서 음식물을 섭취했을 때 pH 3-6정도이므로 본 발명 대두 효소식품을 다른 음식물과 함께 복용했을 때 음식물의 소화를 도와 위장운동을 촉진한다.
또한 본 발명 대두 효소식품이 장내 미생물 균총 형성에 미치는 영향을 알기 위하여 대두 효소식품을 포함한 배지에 대장균과 유산균을 동시에 배양한 결과 대두 효소식품 무첨가 배지에서 24시간 배양된 대장균은 유산균 보다 약 11배 높은 농도이지만 본 발명 대두효소식품을 첨가한 배지에서는 유산균이 대장균 보다 약 180배 높다는 것을 알 수 있다(표4). 이것은 본 발명 대두 효소식품이 유산균의 생육을 촉진하고 배지의 pH를 낮춤으로서 대장균의 생육을 억제하기 때문에 나타나는 결과라 예상되며 본 대두 효소식품을 일정한 간격으로 연속적으로 복용할 경우 장내에는 콜리(coli) 형태의 대장균류 현격히 줄어들고 유산균류가 장내 주요균총을 형성하여 장운동 촉진 및 원활한 배변활동에 도움을 준다. 따라서 본 발명에서 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106는 유산균의 성장을 촉진하고 대장균의 성장을 억제하는 효과가 있음을 밝혔다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 본 발명 변이균주의 분리 및 선발
본 발명 변이균주를 분리하기 위하여 충남 공주시에서 수집한 전통메주를 시료로 사용하였다. 시료 1g을 10㎖의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 현탁하여 10-1∼10-5의 비율로 희석하여 희석액 100㎕를 클로람페니콜(chloramphenicol) 100㎍/mL을 포함하는 포테이토 덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar)에 도말하고 30℃에서 48-56시간 배양한 후 녹색 포자를 형성하는 콜로니를 수집한 다음 현미경으로 균사의 형태, 분생포자경(conidiophore), 경자(phialide), 분생포자의 모양을 관찰하여 아스퍼질러스 오리재 친주를 1차 선발하였다. 분리된 균주를 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 5일간 배양하여 분생포자를 수집한 후 셀렌산나트륨(Sodium selanate, Na2SeO4)를 0.5%(w/v) 및 탈지분유 5%(w/v)를 포함하는 한천배지에 1×106의 상기 균주 분생포자를 도말한 다음 30℃에서 48시간 배양하여 성장이 왕성하며 탈지분유 분해환이 큰 콜로니를 2차 선발하였다. 상기 균주의 포자를 모아 포테이토 데스트로스 한천배지에 1×106의 상기 균주 분생포자를 도말하여 자외선등(40W)의 10㎝아래에서 30초 간격으로 자외선을 조사한 후 30℃에서 48-56시간 배양하여 흰색포자를 형성하는 콜로니를 최종 선발하였다.
본 발명 변이균주에 대한 생리적 특성을 변이처리 전 아스퍼질러스 오리재 친주와 비교 분석하여 표 1에 나타내었다. 상기 본 발명 균주를 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106로 명명하고, 생명공학연구소 유전자센터에 2002년 3월 2일에 기탁번호 KCTC 10189BP로 기탁하였다.
| 구분 | 변이전 아스퍼질러스오리재 친주 | 신균주 아스퍼질러스 오리재 GB-106(KCTC 10189BP) |
| 포자색상 | 녹색 | 흰색 |
| 셀렌산나트륨 0.5%농도에서 생육정도 | - | ++ |
| 포테이토 덱스트로스 한천배지에서 48시가 배양후 콜로니 직경 | 5mm | 10mm |
| 탈지분유 한천배지에서 48시간 배양했을 때 분해환의 직경 | 7mm | 20mm |
| 전분(Starch)가수분해 | + | +++ |
| 카제인(Casein)가수분해 | + | +++ |
-:전혀 안됨, +:보통, ++:잘됨, +++:매우 잘됨
실시예 2 : 본 발명 아스퍼질러스 오리재(
Aspergillus oryzae
) GB-106(KCTC 10189BP)의 종배양
본 발명 균주의 종배양(seed culture)은 스테인레스스틸로된 체(지름: 21.5㎝, 높이: 6.5㎝, 메시:600㎛)에 수분함량 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%로 맞춘 밀기울 200g을 담아서 알루미늄 호일을 덮어씌우고 121℃에서 30분간 멸균한 후 30℃로 식힌 다음 아스퍼질러스 오리재 GB-106 분생포자 현탁액(5×108/㎖) 5㎖을 각 배지에 분사하여 골고루 섞은 후 30℃ 배양기에서 5일간 배양하여 생성된 분생포자수를 평판도말법으로 계수하여 표 2에 나타내었다.
| 배지의수분량(%) | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 |
| 그람(g)당분생포자수 | 1±0.5×108 | 5±0.5×108 | 1.5±0.5×109 | 2.1±0.5×109 | 3±0.5×108 | 2±0.5×107 | 3±0.5×105 |
본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106은 배지원료인 밀기울의 수분함량이 35%이하에서는 균사성장이 충분하지 않는 상태에서 분생포자가 형성되어 분생포자수가 낮은 것으로 사료되고 수분함량 50%이상에서는 균사성장은 잘 되지만 높은 수분량에 의하여 공기와의 접촉이 부족하여 포자형성이 잘되지 않아서 그람당 분생포자수가 낮은 것으로 사료되며 본 발명 균주 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106 의 종배양을 위한 최적 원료배지는 밀기울 수분함량 40-45%로 나타났다.
실시예 3 : 대두의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(
Aspergillus oryzae
) GB-106(KCTC 10189BP)의 아밀라제 생성
대두의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 아밀라제 생성을 조사하기 위하여 실시예 2의 스테인레스스틸로된 체에 수분함량 30%, 40%, 50%, 60%로 맞춘 대두 200g을 담아서 알루미늄 호일을 덮어씌우고 121℃에서 30분간 멸균한 후 30℃로 식힌 다음 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106 분생포자 현탁액(5×108/㎖) 5㎖을 각 배지에분사하여 골고루 섞은 후 30℃ 배양기에서 6시간마다 시료 10g을 취하여 아밀라제 활성도를 측정하였다. 이때, 상기 효소 활성도를 측정하기 위한 조 효소액으로는 시료 10g을 막자사발에 갈아 매스 플라스크에 담은 후 증류수를 100㎖까지 채우고 30분간 교반하고 2시간 정치한 후 10분간 원심분리(10,000×g, 4℃)하여 얻은 상등액을 사용하였다. 아밀라제 활성은 가용성 전분(20mM 인산나트륨 버퍼 내 1%, pH 7.0)을 기질로 하여 생성된 총 환원당을 DNS(dinitrosalicylic acid)법[Miller, Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428, 1959]으로 측정하였다. 여기서, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 아밀라제 생성은 배양18시간 후부터 급격히 증가하여 배양36시간에서 최고조로 달하고 수분함량 50%에서 가장 높게 나타났다. 수분함량 30%와 60%에서는 균체 성장이 느리므로 아밀라제의 생성량이 적은 것으로 사료된다.
실시예 4 : 대두의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(
Aspergillus oryzae
) GB-106(KCTC 10189BP)의 아밀라제 생성
대두의 수분 함량에 따른 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 프로테아제 생성을 조사하기 위하여 실시예 3의 방법의 효소액으로 프로테아제 활성도를 측정하였다. 프로테아제 활성은 카세인(20mM tris-HCl 버퍼 내 0.7%, pH 8.0)을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신을 폴린(Folin)법[Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4: 101, 1978]으로 측정하였다. 여기서, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 프로테아제 생성은 배양 12시간부터 서서히 증가하여 배양 36시간에서 최고조에 달하였으며 수분함량 40%에서 생성량이 가장 많았다. 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106 발효에 의한 높은 프로테아제 활성은 대두의 단백질을 가수분해하여 다양한 종류의 대두 펩타이드를 생산하며 이 발효과정에서 만들어진 대두 펩타이드는 장내에서 유익한 미생물 균총을 형성하여 장운동을 촉진하는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
실시예 5 : 아스퍼질러스 오리재(
Aspergillus oryzae
) GB-106(KCTC 10189BP)을 발효한 본 발명 대두 효소식품 대량제조
정선된 대두를 물에 약 2시간 침지하여 수분함량을 40-50%로 맞추고 대형 압력솥에 넣고 열을 가하여 약 30분간 증자한 후 대두원료를 깨끗한 광목 위에 쏟은 다음 품온이 35℃될 때 까지 식힌다. 대두원료가 식으면 본 발명 균주 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 종 배양한 종국을 대두원료 kg당 2g 넣어 골고루 섞은 다음 대두원료의 두께를 약 10㎝로 하여 평평하게 고른 후 광목을 덮어 품온을 30℃로 유지시키면서 12시간동안 분생포자를 발아시킨다. 분생포자의 발아가 완료되면 상기의 대두원료를 바닥이 평탄하고 공기유통이 원활한 광주리에 두께가 3-5㎝되도록 펼친 다음 물에 적신 광목 조각을 덮은 후 광주리를 여러 개 포개어 배지 품온이 30-33℃로 유지시키면서 28시간 배양한다. 배양이 완료된 대두는 50℃에서 열풍 건조한 후 분쇄하여 본 발명 대두 효소식품을 제조한다. 본 발명 대두 효소식품과 아스퍼질러스 오리재 친주를 발효한 대두, 전통메주, 납두균 발효 대두식품을 분쇄하여 실시예 3의 방법으로 조효소액을 추출한 후 추출한 조효소액의 아밀라제 역가를 실시예 3의 아밀라제 활성 측정방법으로 조사하고, 상기 동 조효소액의 프로테아제 역가를 실시예 4의 프로테아제 활성 측정방법으로 조사하여 표 3에 나타내었다.
| 효소 | 본 발명 대두 효소식품 | 아스퍼질러스 오리재 친주를 발효한 대두 | 전통메주 | 납두균 발효 대두식품 |
| 아밀라제(U/g) | 105 | 23 | 2.5 | 2.7 |
| 프로테아제(U/g) | 7.2 | 1.5 | 1.1 | 1.2 |
실시예 6 : 아스퍼질러스 오리재(
Aspergillus oryzae
) GB-106(KCTC 10189BP)을 발효한 본 발명 대두 효소식품의 pH에 대한 안정성
본 발명 대두 효소식품을 복용하였을 때 장내환경에서 소화효소의 기능을 수행할 수 있는지 알아보기 위하여 pH 2.6-7범위에서 아밀라제와 프로테아제의 효소안정성을 조사하였다. 본 발명 대두 효소식품 1g을 pH 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0의 0.1M 시트레이트-포스페이트 버퍼 (citrate-phosphate buffer) 10mL에 넣고 30℃ 배양기에서 1시간, 3시간, 5시간 추출한 조 효소액의 아밀라제 역가를 실시예 3의 아밀라제 활성 측정방법으로 조사하여 도면 4에 나타내었고, 상기 동 조효소액의 프로테아제 역가를 실시예 4의 프로테아제 활성 측정방법으로 조사하여 도면 5에 나타내었다.
본 발명 대두 효소식품의 아밀라제는 pH 4-7에서 5시간 후 약 90%의 역가를 유지하였고 pH3에서 5시간 후 약 45%의 역가를 유지하였으며, 프로테아제는 pH 3-7에서 5시간 후 약 90%의 역가를 유지하였고 pH 2.6에서 약 50%의 역가를 유지하였다. 사람의 위에서 음식물을 섭취했을 때 pH 3-6정도이므로 본 발명 대두 효소식품을 다른 음식물과 함께 복용했을 때 음식물의 소화를 도와 위장운동을 촉진할 것으로 사료된다.
실시예 7 : 아스퍼질러스 오리재(
Aspergillus oryzae
) GB-106(KCTC 10189BP)를 발효한 본 발명 대두 효소식품이 장내 미생물 균총 형성에 미치는 영향
본 발명 대두 효소식품이 장내 미생물 균총형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명 대두 효소식품 1%(w/v) 및 1%의 포도당을 포함하는 LB 액체배지 100㎖이 든 250㎖ 삼각플라스크에 대장균(Escherichia coliJM109) 4×106과 유산균(Lactobacillus acidophilus) 4×106을 접종하여 37℃에서 진탕 배양하면서 4시간마다 배양액을 채취하여 맥콘키(MacConkey)고체배지와 멤알에스(MRS)고체배지에서 평판도말법으로 각각의 균수를 조사하여 표 3에 나타내었다.
| 구분 | 대두 효소식품 첨가배지 | 대두 효소식품 무첨가배지 | ||
| 배양시간 | 유산균수 | 대장균수 | 유산균수 | 대장균수 |
| 0시간 | 4±0.2×104 | 4±0.2×104 | 4±0.2×104 | 4±0.2×104 |
| 4시간 | 3.9±0.3×105 | 2.6±0.3×105 | 6.6±0.1×104 | 7.6±0.4×105 |
| 8시간 | 7.5±0.2×106 | 4.5±0.3×106 | 6.2±0.4×106 | 6.1±0.3×108 |
| 12시간 | 6.1±0.3×107 | 2.0±0.2×107 | 4.2±0.3×106 | 8.3±0.4×108 |
| 16시간 | 5.7±0.4×108 | 1.5±0.3×107 | 1.0±0.3×107 | 1.0±0.3×109 |
| 20시간 | 1.0±0.5×109 | 7.4±0.3×106 | 1.0±0.4×107 | 1.2±0.3×109 |
| 24시간 | 1.2±0.5×109 | 6.7±0.3×106 | 8.4±0.5×106 | 9.5±0.5×108 |
대두 효소식품 무 첨가 배지에서 24시간 배양된 대장균은 유산균 보다 약 11배 높은 농도이지만 본 발명 대두효소식품을 첨가한 배지에서는 유산균이 대장균 보다 약 180배 높다. 상기는 본 발명 대두 효소식품이 유산균의 생육을 촉진하고 배지의 pH를 낮춤으로서 대장균의 생육을 억제하기 때문에 나타나는 결과라 사료되며 본 대두 효소식품을 일정한 간격으로 연속적으로 복용할 경우 장내에는 콜리(coli) 형태의 대장균류 현격히 줄어들고 유산균류가 장내 주요 균총을 형성하여 장운동 촉진 및 원활한 배변활동에 도움을 줄 것으로 사료된다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106은 종래의 대두 발효식품보다 매우 높은 아밀라제, 프로테아제 활성 및 다양한 종류의 대두 펩타이드를 생성하는 효과가 있을 뿐만 아니라 흰색 분생포자를 형성하므로 상기 본 발명 균주를 대두배지에서 고상 발효시켜 제조한 본 발명 대두 효소식품은 종래의 아스퍼질러스 오리재를 고농도로 발효했을 때 발생하는 발효산물의 색상 문제를 해결할 수 있는 뛰어난 효과가 있어 식품의 주원료, 부원료 또는 부용제로 사용되었을 때 장내 음식물의 소화를 돕고 장 활동에 유익한 미생물 균총을 형성하여 인간의 원활한 소화작용 및 배변작용을 유도하여 건강한 삶을 영위케 할 수 있는 기능성 식품이므로, 상기 본 발명 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106 및 이를 이용한 대두 효소식품은 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (5)
- 셀렌산나트륨 및 자외선 조사를 이용하여 선발된 변이균주로, 흰색 분생포자를 형성하며 아밀라제 및 프로테아제 생성능이 높은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106 (KCTC 10189BP).
- 밀기울 배지의 수분함량을 40∼45%(w/w)로 조정하는 단계;상기 고체배지를 스테인레스로된 체에 3-5 ㎝로 펼쳐서 121℃에서 20분 동안 멸균하는 단계;상기 고체배지에 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106(KCTC 10189BP)의 분생포자 현탁액을 분사하여 접종하는 단계; 및상기 고체배지를 30℃에서 5일 동안 배양하여 상기 균주를 발효시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 종국제조 방법.
- 대두를 물에 약 2시간 침지하여 수분함량이 40-50%가 되도록 하여 대형 압력솥에 넣고 열을 가하여 약 30분간 증자하는 단계;제 2항의 종국 2g/대두원료 1kg 넣어 접종하는 단계;대두원료의 두께를 약 10㎝로 하여 평평하게 고른 후 광목을 덮어 품온이 30℃가 유지되도록 하여 12시간동안 분생포자를 발아하는 단계; 및상기의 대두원료를 광주리에 두께가 3-5㎝되도록 펼친 다음 물에 적신 광목 조각을 덮은 후 광주리를 여러 개 포개어 배지 품온이 30-33℃되도록 유지시키면서 상기 균주를 발효 단계로 구성되는 것을 특징으로 대두를 배지로한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 고체발효방법.
- 제 2항 기재의 방법으로 발효시킨 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-106의 제조종국.
- 제 3항 기재의 방법으로 발효시킨 발효생성물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 장의 소화배변촉진용 조성물.
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