KR20020021178A - 기능성 청국장 및 그 제조방법 - Google Patents

기능성 청국장 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기능성 청국장 및 그 제조방법에 관한 것으로 원료대두로 중소립콩을 정선 및 수세하고 1.5배의 15℃ 물에 12시간 침지한 후 탈수시간을 45분으로 하고 1.0∼1.5㎏/㎠ 의 오토클래브(Autoclave)를 사용하여 60분간 증자한 다음 전배양한 종균액을 접종하여 40℃에서 48시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 2.0%, 마늘 0.2%를 첨가하여 혼합 및 마쇄하고 5℃에서 15일간 후숙하여 제조한 청국장은 풍미가 우수한 뛰어난 효과가 있고 또 중소립콩을 정선 및 수세하고 1.5배의 15℃ 물에 12시간 침지한 후 탈수시간을 45분으로 하고 오토클래브를 사용하여 60분 증자하고 전배양한 종균액을 접종하여 40℃에서 72시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%를 첨가하고 혼합 및 마쇄하여 제조한 청국장은 항암 기능성이 우수한 뛰어난 효과가 있다.

Description

기능성 청국장 및 그 제조방법{functional Chungkookjang and process for preparation thereof}
본 발명은 기능성 청국장 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 대두품종과 스타터 균주를 선정하여 증자 및 발효시킨 후 부재료를 혼합하여 제조한 풍미가 우수하고 항암 기능성이 있는 청국장 및 그 제조방법에 관한 것이다.
청국장은 콩을 삶아 볏짚을 군데군데 꽂고 따뜻한 아랫목에 덮어 두면 하룻밤 사이에 표면이 회백색이 되고 끈적끈적한 실이 나게 띄워진다. 여기에 소금이나 마늘, 고춧가루 등을 섞어 절구통에서 찧어 단지에 다져 넣고 두면서 찌개의 재료로 사용하여 온 것으로 우리의 전래 간장, 된장, 고추장과는 달리 전통장류 중 유일하게 소금을 첨가하지 않고 고온에서 속성으로 발효시킨 식품이기 때문에 전통적으로 콩을 수확한 뒤 늦가을부터 초봄 사이에 각 가정에서 손쉽게 제조 이용하여 왔다. 그 제조방법이 정형화 된 것은 없고 경험에 의해서 전래된 방법대로 제조하였다.
청국장은 삶은 콩을 볏짚에 붙어 있는 고초균(枯草菌)이라 부르는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용하여 띄워 만든 것으로 발효과정 중에 고초균이 생산하는 효소에 의해서 그 특유의 맛과 냄새를 내는 동시에 원료대두의 당질과 단백질에서 유래된 레반 폼 프럭탄트(levan form fructan)와 폴리글루타메이트 (polyglutamate)의 중합물질인 끈적끈적한 점질물을 생성한다. 이와 같이 제조된 청국장은 콩을 원료로한 우리나라의 대표적 발효식품으로 간장, 된장, 고추장 등과 함께 오늘날까지 상용되어 온 전통장류 중의 하나로 된장보다 콩 단백질과 지방질 함량이 많고 소화 흡수율이 높으며, 칼슘과 비타민 A, B의 중요한 공급원, 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방효과, 발암물질과 콜레스테롤의 체외 배출효과, 점질물(mucin)의 알코올 흡수에 의한 해장효과, 사포닌의 혈관강화와 혈액순환 촉진과 젖산분해효과, 레시친의 뇌 노화와 치매, 고혈압과 동맥경화의 예방 등의 효과가 있다는 것이 많이 알려져 왔다(이서래, 한국의 발효식품, 1997., 이한창, 발효식품, 1996., 김상순 한국전통식품의 과학적 고찰, 1985., 김상순, 청국장, 1987., 이한창, 청국장론, 1991., 이한창, 청국장 소고, 1992., 주현규, 청국장은 기능성 건강식품, 1996.).
최근 많은 연구자들에 의해서 밝혀지고 있는 청국장의 생리활성 효과로는 청국장이 콩으로부터 유래된 이소플라본(isoflavons), 피트산(phytic acid), 사포닌(saponin), 트립신 저해제(trypsin inhibitor), 토코페롤(tocopherol), 불포화지방산, 식이섬유, 올리고당 등의 각종 생리활성 물질과 항산화물질 및 혈전용해 효소를 다량 함유하고 있는 기능성 식품으로서 고혈압방지 효과, 혈중 콜레스테롤 저하능, 항돌연변이성, 항암성, 항산화성, 혈전 용해능 등이 있다(김정상, 한국콩연구회지 1996., 성미경, 한국콩연구회지, 1996., 윤기도 외 4인, 1996., 정건섭외1인 산업미생물학회지, 1997., 길지은 외 2인, 1998., 건국대학교 식품개발연구소, 개교 50주년기념 심포지움 자료, 1996., 권익부 외 1인, 영남대학교 부설 장류 연구소, 1999., 윤기도 외 4인, 산업미생물학회지, 1996., 정건섭외 1인, 산업미생물학회지, 1997., 허석 외 2인, 한국농화학회지, 1998., 영양과 암, 한국콩연구회 소식, 1998.).
그러나 청국장은 각 지방 또는 가정마다 제조방법이 일정하지 않으며 그 품질 또한 볏짚에 부착된 고초균의 종류와 발효조건 등에 따라 크게 다르게 된다. 따라서 전통 장류 문화의 계승발전과 우수한 기능을 지닌 전통 청국장의 품질을 향상시키고 표준화하기 위해서는 제조방법을 확립하는 것이 절실히 요망되고 있다.
지금까지 청국장 품질 향상과 산업화 기술에 관한 연구로는 전통 청국장 이용실태(최정숙 외 6인, 한국콩연구회지, 1996.)와 산업체 청국장 생산현황 조사 등에 대하여 설문을 통하여 고찰한 것과 청국장 발효우수균주 선발 및 대두 품종별 제조 청국장의 품질 특성 연구, 발효조건별 청국장 품질 특성 연구(한국식품개발연구원, 1998., 주현규, 한국식품과학회지 1971., 김경자 외 2인 1982., 김상순, 장유, 1997., 한만숙, 동국대학논총, 1985., 유진영, 식품과학기술지, 1997., 장창문, 제 1 회 장류심포지움 및 장류전시회, 1998., 권동진, 한국전통식품산업화연구회, 1999., 장창문, 생물공학적 기법에 의한 전통 장류의 제품화 연구 제 2 단계 결과 보고서, 1998., 장창문, 농촌생활과학, 1996., 고현숙, 건국대 석사학외논문, 1998.) 등이 있으나, 이는 전통 청국장을 계승하기보다는 일본 낫토(Natto)의 제조공정에 적용시킨 것이었다.
본 발명자들은 우리나라 청국장의 고유한 맛을 재현하면서 우수한 기능성을 갖는 고품질의 청국장을 제조하기 위하여 대두품종, 증자방법, 스타터(Starter), 발효기간, 부재료비를 달리하여 청국장을 제조하고 이화학적 실험을 행하여 청국장 제조 방법을 표준화하였다. 또한 상기 대두품종, 스타터(Starter), 발효기간, 부재료비를 달리하여 제조한 청국장의 Ames test와 SOS chromotest에 의한 항돌연변이 효과를 살펴보았고 MTT assay를 행하여in vitro에서 항암효과를 관찰하여 항암성이 우수한 항암 기능성 청국장 제조방법을 확립하였으며in vitro및in vivo에서 상기 항암 기능성 청국장 제조방법에 의해 제조된 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장의 항암성을 조사하고 비교하여 본 발명 방법에 의해 제조된 항암 기능성 청국장이 가장 우수한 항암성을 나타냄을 확인하므로서 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대두품종과 스타터 균주를 선정하여 증자 및 발효시킨 후 부재료를 혼합하여 맛과 풍미가 우수한 표준화 청국장과 항암 기능성이 우수한 청국장을 제조하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조한 풍미가 우수한 표준화 청국장과 항암 기능성 청국장을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 준저리, 만리콩, 황금콩 및 수입콩과 같은 4종의 대두를 다양한 방법으로 증자한 후 종균을 처리하여 발효시키므로 청국장을 제조하고제조한 청국장의 수분, pH, 아미노태 질소, 암모니아태 질소, γ-글루타밀트랜스펩티다아제의 함량과 같은 이화학적 특성을 조사하여 풍미가 가장 우수한 청국장을 표준화하였다. 이어서, 상기 제조한 청국장들의 메탄올 추출물을 각각 Ames test와 SOS chromotest 및 MTT assay하여 항돌연변이성과 항암성이 가장 우수한 청국장을in vitro에서 조사하여 항암성이 우수한 청국장으로 표준화한 후 상기 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법에 의해 제조된 청국장 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조한 청국장을 시료로 사용하여in vitro에서 항돌연변이성과 항암성을 조사하고 또in vivo에서 상기 청국장 시료들을 마우스에 투여하고 종양세포를 이식하여 세포독성효과, 고형암성장 저지효과 및 자연살해세포의 활성능을 측정하여 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장의 항암효과가 우수함을 재확인함으로서 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 다양한 대두품종을 40℃에서 3일동안 발효시켜 제조한 청국장의 아미노태 질소, 암모니아태 질소 및 γ-글루타밀트랜스펩티다아제(γ-glutamyltranspeptidase:γ-GTP)의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 다양한 증자방법에 의해 제조한 청국장의 아미노태 질소와 암모니아태 질소의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 다양한 종류의 스타터 균주를 사용하여 접종하거나 자연적으로 발효시켜 제조한 청국장의 아미노태 질소, 암모니아태 질소 및 γ-GTP의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 접종하여 40℃에서 5일 동안 발효시켜 제조한 청국장의 아미노태 질소, 암모니아태 질소 및 γ-GTP의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 3일동안 40℃에서 배양한 후 다양한 부재료를 첨가하여 5℃에서 여러 기간동안 숙성시켜 제조한 청국장의 아미노태 질소, 암모니아태 질소 및 γ-GTP의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 마우스 비장 세포의 자연살해 세포활성에 미치는 청국장의 영향을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 준저리, 만리콩, 황금콩, 수입콩 각각을 다양한 증자방법으로 증자한 후 스타터로 다양한 종균을 각각 처리하여 발효시킨 다음 부재료로 소금, 고춧가루, 마늘 등을 첨가하여 혼합·마쇄하고 후숙시켜 청국장을 제조하는 단계; 상기 제조된 청국장에 함유된 수분, pH, 아미노태 질소, 암모니아태 질소, γ-글루타밀트랜스펩티다아제의 함량 및 총균수를 대두품종별, 증자방법별, 스타터 균주별로 측정하여 청국장의 이화학적 특성을 조사하므로써 가장 양호한 풍미를 갖는 청국장을 표준화하는 단계; 대두품종별, 스타터 균주별, 발효기간별, 첨가한 부재료 비율별로 제조한 각각의 청국장 메탄올 추출물을 Ames test 및 SOS chromotest하여 가장 우수한 항돌연변이성을 나타내는 대두품종, 종균, 부재료를 조사하고 발효기간을 조사하여 항돌연변이성이 가장 우수한 청국장 제조조건을in vitro에서 결정하는 단계; 암세포에 대두품종별, 스타터 균주별, 발효기간별, 첨가한 부재료 비율별로 제조한 각각의 청국장 메탄올 추출물을 첨가하고 배양한 후 MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 첨가하고 다시 한번 배양한 후 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 세포독성을 조사하므로써 가장 항암 기능성이 우수한 청국장의 제조조건을in vitro에서 결정하여 표준화하는 단계; 상기 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장을 시료로 사용하여 항돌연변이성 및 항암성을 각각 조사하여 비교하는 단계; 다이익스클루젼(dye exclusion) 방법을 이용하여 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장 시료들의 세포독성을 조사하는 단계; 상기 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장 시료를 공급한 마우스의 서혜부에 sarcoma-180 종양세포를 이식하고 26일째 되는 날 치사시켜 각 장기의 중량을 측정한 후 생성된 고형암을 적출하고 그 무게를 측정하여in vivo에서 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장의 항암성을 조사하여 비교하는 단계 및: 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장 시료를 공급한 마우스의 비장세포를 분리하여 이펙터 세포 (effecter cell)로 준비하고 Yac-1 마우스 임파구 세포를 타겟세포로 사용하여 자연살해능을 측정함으로서 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장과 전통방법 및 전통방법을 개량한 방법에 의해 제조된 청국장의 면역활성 증강효과를 조사하여 비교하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예와 실험예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 청국장 제조방법의 표준화
제 1 공정: 청국장 제조
본 실시예에서 사용한 원료대두는 소립종인 준저리(100립중 10g, 조단백질 41%, 조지방 19%), 중립종인 만리콩(100립중 20g, 조단백질 41%, 조지방 20%), 대립종인 황금콩(100립중 25g, 조단백질 41%, 조지방 20%), 수입콩인 미국산 황색 1호(100립중 16g, 조단백질 35%, 조지방 18%)은 각각 영남 농업 시험장과 수원의 작물시험장, 장류조합에서 분양 받아 청국장 제조 재료로 사용하였다. 공시균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilisKCCM 11315)로 한국 미생물 보존센터에서 분양 받아 사용하였으며 메주에서 분리한 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115), 재래간장으로부터 분리한 바실러스 서브틸리스 CCKS-111(Bacillus subtilisCCKS-111), 전통 청국장으로부터 분리한 바실러스 서브틸리스 DC-2(Bacillus subtilisDC-2) 균주는 영남대 식품가공학과에서 분양받아 사용하였다. 균은 글루코스(glucose) 0.5%를 첨가한 NB배지(Difco, nutrient broth : beef extract 0.3%, peptone 0.5%)에 균을 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 균체 농도를 조절(흡광도 600nm = 0.8)하여 종균액으로 사용하였다.
먼저 대두를 정선 및 수세하여 1.5배의 물(15℃)에 12시간 침지하고 물빼기하였다. 이를 어렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 담아 고압 멸균기 (1.0∼1.5kg/cm2)에서 60분 동안 증자하여 50℃로 냉각하였다. 전배양한 종균액(흡광도 600nm=0.8)을 원료의 1%(v/w) 접종하고 40℃ 배양기(incubator)에서 72시간 발효시켰다. 발효가 끝난 청국장 메주에 소금을 7.6% 첨가하여 혼합·마쇄하였다. 또한 전통 청국장은 증자시 상압에서 4시간 삶고 냉각한 후 5 ∼ 7cm로 절제한 볏짚을 깐 상자에 3cm 두께로 대두를 깔고 그 위에 볏짚을 덮어 발효시켰다. 발효가 끝난후 소금 7.93%, 고춧가루1.1%, 마늘 1.1%을 첨가하여 혼합·마쇄하고 5℃에서 15일간 후숙시켰다.
제 2 공정: 대두 품종별 청국장의 품질 특성
우리나라의 청국장과 비슷한 일본 낫또(Natto)의 원료 대두인 준저리, 항돌연변이, 항암효과가 우수하였던 만리콩, 민간에 장류의 원료 대두로 널리 이용되는 황금콩 그리고 수입콩인 미국산 황색 1호를 사용하여 상기 제 1 공정에서 제조한 청국장 발효 후 수분함량과 pH, 아미노태 질소와 암모니아태 질소함량, γ-GTP 활성(activity)를 조사하였다. 청국장의 일반성분은 A.O.A.C.법(Association ofofficial analytical chemists)에 준하여, 수분은 105℃ 건조법, 조단백질은 Micro-Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet 추출법으로 분석하였다. pH는 시료를 10배 희석하여 pH meter (Corning 220, USA)로 측정하였다. 아미노태 질소(NH2-N)는 청국장 시료 2g을 취하여 formol법으로 측정하였다. 암모니아태 질소(NH3-N)는 증류수를 가하여 청국장을 5배 희석, 진탕추출 후 여과지로 여과한 여액을 AM505-K(아산제약)에 의한 인돌페놀(Indophenol)법으로 측정하였다. γ-글루타밀트랜스펩티다아제 (γ-glutamyltranspeptidase;γ-GTP) 역가는 시료 10g을 취하여 증류수로 5배 희석하여 진탕추출한 다음 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 하였다. 이 조효소액을 5-ami nolicylic acid법을 이용하는 AM158-K(아산제약)를 이용하여 측정하였다. 총균수는 청국장 1g을 취하여 멸균생리식염수를 이용한 10배 희석법으로 희석하고 플레이트 카운트 아가(plate count agar)에 도말한 후 30℃에서 48시간 배양한 다음 나타난 콜로니(colony)를 계수하여 호기성균수(CFU/g)로 나타내었다.
실험결과, 표 1에서 보는 바와 같이 황금콩 청국장의 수분함량이 가장 높고 준저리가 가장 낮았다. 한편 최종 청국장 제품의 pH는 준저리가 가장 높고 수입콩이 가장 낮았다. 이는 증자 대두 발효식품의 발효기간이 경과되면 탈아미노화 현상이 일어나 이취성분의 주체인 암모니아가 생성되기 때문에 아미노태 질소와 pH가 증가되는 것으로 볼 수 있다. 국산콩이 수입콩에 비하여 발효성적이 우수한 원인은 국산콩이 수입콩에 비해 상대적으로 단백질 함량이 높아 청국장균이 자라는 배지로서의 조건이 우수하며 수입콩은 수송과정에서 발생되는 부패와 해충 방제를 위한 약제 처리 등으로 인하여 청국장균이 자라는 조건을 저하시켰다고 생각된다. 도 1에서는 청국장 제품의 NH2-N, NH3-N, γ-GTP 활성을 보여주고 있다. 청국장의 구수한 맛을 좌우하는 아미노산 성분인 아미노태 질소는 만리콩이 비교적 높은 함량을 보였고 수입콩이 제일 낮았다. 청국장 불쾌취의 원인인 암모니아태 질소함량은 만리콩이 가장 낮았고 수입콩이 가장 높았다. 청국장의 점질물 구성성분은 프럭토스(fructose)와 글루타민산(glutamic acid)이 중합된 레반태프럭탄(levan form fructan)과 폴리글루타메이트(polyglutamate;PGA)의 혼합물질이며 PGA는 γ-GTP에 의해 생성되는 것으로 γ-GTP역가는 준저리가 가장 높고 수입콩이 가장 낮았다. 이로서 청국장 원료대두로는 수입콩과 대립종인 황금콩보다는 소립종 및 중립종이 우수하였는데 특히 중립종인 만리콩이 NH2-N 생성량이 높고 NH3-N 생성량은 낮으며 점질물 생성능이 적당하였다.
다양한 대두품종을 3일 동안 40℃에서 발효시켜 제조한 청국장의 수분함량과 pH
대두품종 수분함량(%) pH
준저리 50.9±0.2c 7.52±0.04a
만리콩 53.1±0.2b 7.05±0.04b
황금콩 53.9±0.4a 6.89±0.03c
미국산 황색 1호 52.5±0.4b 6.61±0.01d
[주]a∼d: 다른문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는차이를 나타낸다(p<0.05).
제 3 공정: 증자방법을 달리하여 제조한 청국장의 품질 특성
상기 제 1 공정에서 제조한 청국장은 증자시에 침수 후 탈수 시간은 0분, 45분, 60분으로 한 후 증자방법은 전통적인 방법인 삶기(충분한 수분공급으로 상압에서 4시간)와 찌기(400cc의 수분 공급으로 0.9kg/cm2의 압력밥솥에서 15분 증자), 개량적인 방법으로 이용되고 있는 오토클래브(autoclave;1.0∼1.5kg/cm2, 60분간)를 이용하여 청국장을 제조하여 품질특성을 비교하였다. 품질특성 비교를 위한 이화학적 특성 조사는 상기 제 2 공정에서 실시한 수분함량과 pH, 아미노태 질소와 암모니아태 질소함량, γ-GTP 활성(activity)의 측정방법과 동일하게 실시하였다.
실험결과, 침수 후 탈수 시간을 0분, 45분, 60분으로 달리하고 증자 방법을 달리하여 발효시켜 제조한 청국장의 품질 특성은 표 2와 도 2에 나타난 바와 같았다. 탈수시간을 0분으로 하여 오토클래브(autoclave)시켜 제조한 청국장과 삶기와 찌기를 이용한 청국장은 수분함량이 각각 67.6%, 67.9%, 61.7%로 전통 식품 표준 규격(전통식품표준 규격집, 한국식품개발연구원, 1996.)의 55%이하에 부적합하였으며 탈수 시간을 45분과 60분으로 하여 오토클래브(autoclave)시켜 제조한 청국장은 수분함량이 각각 54.3%와 52.1%였다. pH와 청국장의 구수한 맛을 좌우하는 아미노산 성분인 아미노태 질소가 탈수 시간이 0분인 경우와 삶기의 경우 각각 7.95, 550mg%와 8.04, 497mg%로 높았다. 청국장 불쾌취의 원인인 암모니아태 질소 함량은 탈수 45분으로 하여 오토클래브를 이용한 경우 363㎍/dl로 가장 낮았다. 따라서 청국장 제조시 증자방법은 45분 탈수하고 고압살균하여 증자한 청국장이 수분함량,pH, 아미노태 질소, 암모니아태 질소함량 등을 비교할때 가장 우수하였다.
다양한 증자방법에 따른 청국장의 수분함량과 pH
샘플 수분함량(%) pH
배수시간(분) 조리방법 전-발효 후-발효
0 삶기 C1) 65.7±1.3 67.9±1.3 8.04±0.14a
0 찌기 C 58.9±0.6 61.7±3.8 7.82±0.09b
0 오토클래브 C 64.4±0.1 67.6±0.6 7.95±0.06ab
45 57.2±3.2 54.3±0.6 7.85±0.01b
60 53.8±3.2 52.1±0.6 7.87±0.07b
[주]1)C: 청국장a∼b: 다른문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는차이를 나타낸다(p<0.05)
제 4 공정: 스타터를 달리하여 제조한 청국장의 품질 특성
제 1 공정에서 제조한 청국장은 발효시에 증자·냉각된 대두를 전통적인 방법인 볏짚을 이용하여 발효시키거나 그대로 40℃ 항온기에서 3일간 발효 또는 균종을 달리하여 전배양한 종균액을 원료의 1%(v/w) 접종하여 동일조건으로 발효시켰다. 품질특성은 제 2 공정에서 실시한 수분함량과 pH, 아미노태 질소와 암모니아태 질소함량, γ-GTP 활성(activity)의 측정방법과 동일하게 실시하여 조사하였다.
실험결과, 볏짚을 이용하거나 무접종의 재래식 방법과 균을 접종하는 개량식 방법으로 제조한 청국장의 품질특성을 비교한 결과를 표 3과 도 3에 나타냈다. 수분함량은 모든 군에서 전통표준규격에 적합하였고 대두를 그대로 자연 발효시킨 청국장은 pH와 아미노태 질소함량이 낮아 전반적으로 발효가 되지 않았다. 전통적인 방법인 볏짚을 이용한 청국장은 아미노태 질소함량은 가장 많고 암모니아태 질소함량은 가장 적었는데 이는 볏짚에 부착된 고초균에 의한 것으로 보이며 특히 볏짚이 발효시 발생되는 이취를 흡수해 주는 것으로 보인다. 균종을 달리하여 발효시킨 청국장에서 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)을 종균으로 제조한 청국장의 점질능이 두드러지게 높았다. 따라서 청국장 제조시 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)을 종균으로 하였을 때 수분함량, pH, 아미노태질소, 암모니아태질소함량, γ-GTP acitivity 등 전체를 비교할때 가장 우수하였다.
다양한 스타터 균주를 접종하거나 자연적으로 발효시킨 청국장내 함유된 수분함량, pH, 전체 생균수 및 바실러스 속 균수
샘플 수분함량(%) pH 바실러스 속(×108CFU/mL) 전체 생존균수(×108CFU/mL)
자연발효 IF1)C 46.9±0.9b 6.50±0.05e 0.81 1.2
볏짚 C 49.4±0.7a 8.22±0.02a 11 21
균주접종발효 BL2)C 51.4±1.0a 7.92±0.10b 11 11
BS-13)C 51.4±1.0a 7.85±0.01b 11 16
BS-24)C 51.3±0.9a 7.39±0.03d 7.6 7.1
BS-35)C 49.7±0.9a 7.58±0.01c 5.9 7.1
[주]1)IF: 접종하지 않음2)BL: 바실러스 리체니포미스 CN-1153)BS-1: 바실러스 서브틸리스 KCCM 113154)BS-2: 바실러스 서브틸리스 DC-25)BS-3: 바실러스 서브틸리스 CCKS-111a-e: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는 차이를나타낸다(P<0.05).
제 5 공정: 발효기간을 달리하여 제조한 청국장의 품질 특성
제 1 공정에서 제조한 청국장을 발효시에 40℃에서 0 ∼ 5일간 발효하면서 pH, 아미노태 질소(NH2-N) 함량, 암모니아태 질소(NH3-N) 함량, γ-GTP 활성(activity), 총균수를 측정하였다. 방법은 제 2 공정과 동일하게 실시하였다.
실험결과, 표 4와 도 4에 나타낸 바와 같이 pH는 발효기간 중 계속적으로 상승하였으며 아미노태 질소는 2일째 급속하게 증가하였다. 암모니아태 질소는 4일이후 급속히 증가하였으며 점질능은 발효 2일째 최고치를 기록한 후 서서히 감소하였다. 따라서, 품질 특성을 고려하였을 때 발효 2일째가 청국장의 최적발효기였다.
5일동안 40℃에서 발효시킨 청국장1)의 pH 및 생균수
발효기간(일) pH 전체 생균수(×108CFU/mL)
0 6.7 0.024
1 6.0 13
2 6.6 30
3 6.8 8.4
4 7.2 24
5 7.4 13
[주]1)바실러스 서브틸리스를 접종하여 발효시킨 청국장
제 6 공정: 부재료 첨가량에 따른 청국장 품질 특성
청국장의 부재료 첨가비 표준화를 위하여 소금, 고춧가루, 마늘의 첨가농도를 각각 달리하여 적절한 배합비를 결정하였다. 청국장 100에 대하여 소금의 농도는 7.9%로 하고 고춧가루는 0.2%, 1.1%, 2.0%로 첨가하였고 마늘은 0.2%, 1.1%,2.0%로 조절하였다. 품질특성은 제 2 공정에서 실시한 방법과 동일하게 실시하였다.
실험결과, 표 5와 도 5에 나타낸 바와 같았다. 총균수는 숙성 0일 이후 청국장의 마늘첨가 농도순으로 감소하다가 일정한 수준을 유지하였다. 아미노태 질소의 함량은 5일째까지 급속히 증가하다 다시 서서히 증가하였다. 암모니아태 질소 함량은 고춧가루 2.0%+마늘 0.2% 청국장이 숙성 5일 후 꾸준히 감소하였다. 점질능은 부재료 첨가후 감소하였으며 고춧가루 2.0%+마늘 0.2% 청국장이 숙성 10일후 증가하였다. 따라서 발효 후 부재료를 첨가하여 숙성시 아미노태 질소와 암모니아태 질소함량, 점질능을 고려했을 때 고춧가루 2.0%+마늘 0.2% 청국장이 가장 우수하였다.
상기 제 1 ∼ 6 공정의 결과를 종합하면, 원료대두로 만리콩을 사용하고 이를 정선 및 수세하여 1.5배의 물(15℃)에 12시간 침지한 후 이를 45분간 탈수하여 오토클래브(Autoclave;1.0 ∼ 1.5kg/cm2)를 사용하여 60분간 증자하고 50℃로 냉각한 다음, 전배양한 종균액 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)을 접종하여 40℃, 48시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 2.0%, 마늘 0.2%를 첨가하여 혼합 및 마쇄하고 5℃에서 15일간 후숙한 청국장이 풍미가 가장 좋은 청국장으로 표준화하였다.
40℃에서 3일동안 발효시킨 후 다양한 부재료와 함께 5℃에서 여러 기간 동안 후숙시킨 청국장내 생균수와 pH의 변화
후숙시간(일) 샘플 pH 전체 생균수(×108CFU/mL)
0 염1) 6.78 8.4
염 + 1.1% 고춧가루 + 1.1% 마늘 6.78 8.4
염 + 2.0% 고춧가루 + 0.2% 마늘 6.78 8.4
염 + 0.2% 고춧가루 + 2.0% 마늘 6.78 8.4
5 염1) 6.92 0.75
염 + 1.1% 고춧가루 + 1.1% 마늘 6.86 0.62
염 + 2.0% 고춧가루 + 0.2% 마늘 6.94 0.74
염 + 0.2% 고춧가루 + 2.0% 마늘 6.86 0.27
10 염1) 6.90 3.1
염 + 1.1% 고춧가루 + 1.1% 마늘 6.80 1.1
염 + 2.0% 고춧가루 + 0.2% 마늘 6.87 2.3
염 + 0.2% 고춧가루 + 2.0% 마늘 6.82 0.7
15 염1) 6.96 0.55
염 + 1.1% 고춧가루 + 1.1% 마늘 6.86 0.43
염 + 2.0% 고춧가루 + 0.2% 마늘 6.83 1.2
염 + 0.2% 고춧가루 + 2.0% 마늘 6.87 0.34
[주]1)7.9%
실시예 2: in vitro 에서 청국장의 항돌연변이성
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 대두품종별, 스타터 균주별, 발효기간별, 부재료별로 제조하여 품질 특성을 조사한 청국장을 시료로 사용하였다.
본 실시예에서 돌연변이원/발암원으로 간접돌연변이원인 아플라톡신 B1(Aflatoxin B1; AFB1)은 Sigma사에서 구입하여 디메틸 설폭사이드(dimethyl sufoxide;DMSO)에 녹여서 사용하였고 직접돌연변이원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine;MNNG)는 Aldrich Chemical Co.(USA)에서 구입하여 증류수에 녹여서 사용하였다.
본 실시예에서 Ames test시에 사용한 시약 D-바이오틴(D-Biotin), L-히스티딘·HCl(모노하이드레이트){L-histidine·HCl(monohydrate)}, D-글루코스-6-포스페이트(모노 소듐염){D-glucose-6-phosphate(mono sodium salt)}, NADP(sodium salt){NADP(소듐염)}는 Sigma Chemical Co.(USA)에서 구입하였으며, 박토뉴트리언트 브로쓰(디하이드레이트){Bacto nutrient broth(dehydrated)}와 비테크 아가(Bitek agar)는 Difco Laboratories (USA)로부터 구입하였다.
본 실시예에서 Ames test 시에 사용한 균주는 살모넬라 타이피무리움 LT-2 히스티딘(Salmonella typhimuriumLT-2 histidine) 영양요구성인 살모넬라 타이피무리움 TA100(Salmonella typhimuriumTA100)은 미국 캘리포니아 대학의 Ames B.N.박사로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 이들 균주는 모균의 히스티딘 오페론(histidine operon)에서 돌연변이된 것으로 돌연변이 물질을 보다 효과적으로 검출하기 위해 세포벽의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)가 부분적으로 손실된rfa(deep rough) 돌연변이와, DNA 절단 리페어 시스템(DNA excision repair system)에 대한 유전자 암호(gene coding)가 부분적으로 결여된uvrB 결손 돌연변이, 그리고 암피실린(ampicillin)에 대해 내성을 가지는 플라스미드 pKM101(plasmid pKM101)을 가지는 균주이다. 살모넬라 타이피무리움 TA100(Salmonella typhimuriumTA100)은 히스티딘(histidine) 생합성의 첫번째 효소(enzyme)를 암호화(coding)하는 his G gene에 돌연변이를 일으켜 wide type(leucine)이(proline)으로 치환되어 있다. 그러므로 살모넬라 타이피무리움 TA100(Salmonella typhimuriumTA100)은 주로 이들 G-C 쌍들의 하나에서 염기-쌍 치환(base-pair substitution)을 일으키는 돌연변이 물질을 검출하기 위해 쓰인다. 그리고 이들 실험균주들은 새로운 동결보존(frozen permanent)이 준비되었을 때나 매 실험 직전 히스티딘(histidine) 요구성,rfa(deep rough) 돌연변이, uvrB 돌연변이, R factor 등의 유전형질을 Maron과 Ames 등의 방법으로 확인하여 사용하였다.
본 실시예에서 SOS chromotest에서 사용한 실험균주는 에스케리키아 콜리 GC4436(Escherichia coliGC4436)으로부터 유래된 에스케리키아 콜리 PQ37/플라스미드 pKM101(PQ37){Escherichia coliPQ37/plasmid pKM101(PQ37)}로써lacZgene을sfiAgene에 삽입하고 정상적인lacZgene은 제거되어 β-갈락토시다아제(β-galactosidase;β-G)의 활성은sfiA의 발현에 의해서만 나타날 수 있다. 또한 Ames test의 균주에서 처럼 uvrB 돌연변이(mutation)과rfa돌연변이(mutation)이 되어 있어 SOS 반응이 증폭되고 돌연변이원이 용이하게 균체내로 침투할 수 있다.
이하, 청국장의 항돌연변이성 실험은 하기 공정과 같이 실시하였다.
제 1 공정: 청국장 시료 조제 및 추출
상기 제 1 실시예에서 제조하여 동결건조시킨 시료를 마쇄하여 시료에 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 후 여과하여 회전식 진공 농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japen)로 농축하여 메탄올 추출물(methanol extract)을 얻었다. 이들 추출물들은 증류수에 희석하여 실험에 사용하였다.
제 2 공정: Ames test
본 공정에서는 먼저 간접적 돌연변이원(Indirect mutagen)을 활성화시키기 위하여 Maron과 Ames의 방법에 따라 간의 마이크로좀 효소 혼합물(microsomal enzyme mixture)인 S9 혼합물(mixture)을 조제하였다. 약 200g의 웅성 Sprague-Dawley rat의 간 효소의 도입(induction)을 위하여 폴리크로리네이트 바이페닐 (polychlorinated biphenyl;PCB) 혼합물(mixture)인 Aroclor 1254를 옥수수 오일(corn oil) 1mL당 200mg의 농도로 희석하여 1회 복강 주사하고(500mg/kg) 5일 후에 간을 적출하였다. 4℃ 무균 상태에서 적출한 간을 0.15M KCl로 수회 세척하고 간 무게의 3배량의 0.15M KCl 용액을 가하여 균질기(homogenizer;Potter-Elvehiem apparatus, USA)로 균질화하였다. 이것을 9000×g에서 10분간 원심분리하여 상등액인 S9 분획(fraction)을 얻었으며 Cryo tube에 1∼2mL씩 분주하여 드라이 아이스(dry ice)에서 급속동결한 후 -80℃ 급속 동결(deep freezer)하여 보관하면서 실험에 사용하였다. 상기 S9 분획(fraction;10%)을 MgCl-KCl 염(salts;2%), 1M 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate;0.5%), 1M NADP(4%), 0.2M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer;pH 7.4) 및 멸균수를 역순으로 혼합하여 S9 혼합물을 조제하였다. 이어서, S9 혼합물 0.5mL(간접돌연변이인 경우), 하룻밤 배양된 균주(1 ∼2×109cells/mL) 0.1mL, 희석된 시료(50㎕)와 돌연변이 유발물질(50㎕)을 아이스 배스(ice bath)에 담긴 캡 튜브(cap tube)에 넣고 가볍게 볼텍스(vortex)한 후 37℃에서 30분간 예비배양하였다. 45℃의 상층 아가(top agar) 2mL씩을 각 튜브(tube)에 붓고 3초간 볼텍스(vortex)하여 최소 글루코스 아가 플레이트(minimal glucose agar plate)에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 숫자를 계수하였다. 한편 실험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험(dose response 및 독성실험)을 통하여 결정하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 하기 식에 의해 계산하였다.
억제정도(%) = 100×[(a­b)/(a­c)]
여기서 a는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이수, b는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이의 수이며, c는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연 복귀돌연변이의 수이다.
실험결과, 대두의 품종을 달리하였을 때에는 표 6에 나타낸 바와 같이 항돌연변이 효과는 큰 차이를 보이지 않았으나, 만리콩으로 제조한 청국장이 54%의 높은 항돌연변이 효과를 보였다. 스타터 균주를 달리하였을 때에는 표 7에 나타낸 바와 같으며 모든 청국장의 메탄올 추출물은 살모넬라 타이피무리움 TA100 (Salmonella typhimuriumTA100) 균주에서 AFB1에 대한 돌연변이 유발을 50%이상 억제하였으며, 균종을 달리하였을 때의 항돌연변이 효과는 큰 차이를 보이지 않았으나, 점질능이 우수하였던 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)을 사용하여 제조한 청국장의 항돌연변이 효과가 가장 뛰어나 63%의 돌연변이 유발억제효과를 나타내었다. 발효기간을 달리하여 제조한 청국장의 메탄올 추출물은 표 8에 나타낸 바와 같이 3일 발효시킨 청국장의 항돌연변이 효과가 가장 뛰어나 54%의 돌연변이 유발억제효과를 나타내었으며, 5일 발효시킨 청국장과 3일 발효 후 15일 후숙한 청국장은 항돌연변이 효과를 나타내지 못했다. 부재료를 달리하여 제조한 청국장의 메탄올 추출물은 표 9에 나타낸 바와 같이 항돌연변이 효과는 큰 차이를 보이지 않았으나 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%를 첨가하여 제조한 청국장이 44%의 돌연변이 유발억제효과를 나타내었다.
살모렐라 타이피무리움 TA100 균주를 아플라톡신 B1에 의해 돌연변이를 유발시킴에 있어서, 다양한 대두품종을 발효시킨 청국장 메탄올 추출물의 영향
농도(mg/plate)처리물 복귀돌연변이수/플레이트
1.25 2.5
자발적 141 ± 23
AFB1(대조군) 996 ± 56a
AFB1+준저리-C1) 681±70c(37)2) 572±51c(50)
AFB1+만리콩-C 683±65c(37) 532±11c(54)
AFB1+황금콩-C 915±13b(9) 763±48b(27)
AFB1+미국산 황색 1호-C 898±83b(11) 792±7b(24)
[주]1)청국장2)괄호안의 값은 저해비율(%)a∼c: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
살모렐라 타이피무리움 TA100 균주를 아플라톡신 B1에 의해 돌연변이를 유발시킴에 있어서, 다양한 스타터 균주를 이용하여 발효시킨 청국장 메탄올 추출물의 영향
농도(mg/플레이트)처리물 복귀돌연변이수/플레이트
1.25 2.5
자발적 141 ± 23
AFB1(대조군) 996 ± 56a
AFB1+접종하지 않음 C 886±53b(13)4) 819±21b(21)
AFB1+볏짚 C 752±137bc(29) 567±119c(50)
AFB1+BS1)C 683±65c(37) 532±11c(54)
AFB1+BL2)C3) 629±21c(43) 454±7c(63)
[주]1)BS: 바실러스 서브틸리스 KCCM 113152)BL: 바실러스 리체니포미스 CN-1153)청국장a∼c: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
살모렐라 타이피무리움 TA100 균주를 아플라톡신 B1(AFB1, 0.5㎕/플레이트)에 의해 돌연변이를 유발시킴에 있어서, 다양한 발효기간에 따라 발효시킨 청국장 메탄올 추출물의 영향
농도(mg/plate)처리물 복귀돌연변이수/플레이트
1.25 2.5
자발적 141 ± 23
AFB1(대조군) 996 ± 56a
AFB1+ 생대두 761 ± 114bc(27)2) 678 ± 142d(37)
AFB1+ 0일 발효 C1) 861 ± 38b(16) 762 ± 39d(27)
AFB1+ 3일 발효 C 683 ± 65c(37) 532 ± 11d(54)
AFB1+ 5일 발효 C 691 ± 76c(36) 1383 ± 287b(-)
AFB1+ 3일 발효 및 15일 후숙 C 723 ± 8c(32) 1073 ± 46c(-)
[주]1)청국장2)괄호안의 값은 저해비율(%)a∼d: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의해 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
살모렐라 타이피무리움 TA100 균주를 아플라톡신 B1(AFB1, 0.5㎕/플레이트)에 의해 돌연변이를 유발시킴에 있어서, 다양한 부재료를 첨가하여 발효시킨 청국장 메탄올 추출물의 영향
농도(mg/plate)처리물 복귀돌연변이수/플레이트
1.25 2.5
자발적 141 ± 23
대조군(AFB1) 996 ± 56a
염1)C2) 773 ± 8c(26)4) 1073 ± 46b(-)
염 + 1.1% 고춧가루 + 1.1% 마늘 C 760 ± 20c(28) 621 ± 25c(44)
염 + 2.0% 고춧가루 + 0.2% 마늘 C 770 ± 12c(27) 648 ± 31c(41)
염 + 0.2% 고춧가루 + 2.0% 마늘 C 861 ± 47b(16) 680 ± 57c(37)
[주]1)7.9%2)청국장3)괄호안의 값은 저해비율(%)a∼c: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의해 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
제 3 공정: SOS chromotest
SOS chromotest는 구조 이동 돌연변이(Frame shift mutation)와 점 돌연변이(point mutation)를 동시에 측정할 수 있다. 냉동 보관된 균주 50㎕를 5mL의 L medium에 접종하고 37℃에서 12 ∼ 18시간 진탕배양시켰다. 이를 다시 5mL의 L medium에 접종하고 37℃에서 흡광도 660nm에서의 측정치가 0.3 ∼ 0.4에 이를 때까지 2시간동안 진탕배양시켰다. 여기서 얻은 균주를 L medium에 1/10로 희석하여 각 농도별로 준비된 시료와 돌연변이 유발물질에 혼합된 것을 20㎕를 미리 분주해 둔 96well 플레이트(plate)의 각 well에 100㎕씩 분주하고 90분간 37℃에서 진탕후 SOS 반응을 유도하고 한쪽에는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase;β-G)의 활성측정을 위해 ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) 100㎕, 다른쪽에서는 알카린 포스파타아제(alkaline phosphatase;A-P)의 활성 측정을 위해 PNPP (p-nitrophenyl phosphate disodium) 100㎕를 첨가하였다. 발색시간은 30분으로 하였으며 β-갈락토시다아제는 1.5M Na2CO3100㎕로 알카린 포스파타아제(alkaline phosphatase)는 1M HCl 50㎕로서 효소에 의한 발색반응을 정지시키고 5분 후 알카린 포스페이트(alkaline phosphate)쪽에 50㎕의 2M 트리스 버퍼(Tris buffer)를 첨가하여 HCl을 중화하고 분광광도계(spectrophotometer)로 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 O.D.값은 Miller의 공식에 의해 효소 단위(enzyme unit;Eu) 값을 구하였다.
Eu = (1000×A420)/t(min)
실험결과, MNNG에 대한 대두 4종류의 청국장의 SOS 반응 억제효과는 표 10에 나타낸 바와 같이 SOS chromotest에서도 Ames 실험계에서와 유사한 효과를 보였다. 만리콩으로 제조한 청국장이 높은 SOS 반응 억제효과를 보였고, 또한 준저리로 제조한 청국장도 높은 저해효과를 보였다(p＜0.05). MNNG에 대한 스타터 균주 4종류의 청국장 SOS 반응 억제효과는 표 11에 나타낸 바와 같이 균종을 달리하였을 때 큰 차이를 보이지 않았다. MNNG에 대한 발효기간별 청국장의 SOS 반응 억제효과는 표 12에 나타낸 바와 같이 3일 발효 후 SOS 반응 억제효과는 큰 차이를 보이지 않았다. MNNG에 대한 부재료의 양을 달리한 4종류의 청국장의 SOS 반응 억제효과는 표 13에 나타낸 바와 같이 Ames 실험계에서와 유사한 효과를 보였으며 부재료의 종류를 달리하였을 때의 SOS 반응 억제효과는 큰 차이를 보이지 않았다.
E.coliPQ37 균주내 MNNG(70ng/assay)에 대한 다양한 대두품종을 사용하여 발효시킨 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 SOS 억제반응효과
처리물 β-갈락토시다아제(β) 알카린 포스페이트(a) β/a R2) 저해비율(%)
OD420 단위 OD420 단위
자발적 0.359±0.030 12.0 0.234±0.008 7.80 1.53 1.0 -
대조군(MNNG) 0.896±0.028 29.9 0.233±0.006 7.77 3.84 2.51 -
준저리-C1) 0.784±0.054 26.1 0.274±0.006 9.13 2.86 1.87 42
만리콩-C 0.756±0.016 25.2 0.271±0.034 9.03 2.79 1.82 46
황금콩-C 0.808±0.120 26.9 0.228±0.001 7.60 3.54 2.31 13
미국산 황색 1호-C 0.785±0.025 26.2 0.233±0.044 7.77 3.37 2.20 21
[주]1)청국장2)
E.coliPQ37 균주내 MNNG(70ng/assay)에 대한 다양한 스타터 균주를 사용하여 발효시킨 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 SOS 억제반응효과
처리물 β-갈락토시다아제(β) 알카린 포스페이트(a) β/a R2) 저해비율(%)
OD420 단위 OD420 단위
자발적 0.359±0.030 12.0 0.234±0.008 7.80 1.53 1.0 -
대조군(MNNG) 0.896±0.028 29.9 0.233±0.006 7.77 3.84 2.51 -
자연발효 IF1)C 0.720±0.016 24.0 0.239±0.008 7.97 3.01 1.97 36
RS2)C 0.784±0.039 26.1 0.271±0.028 9.03 2.89 1.89 41
스타터균주 BS3)C 0.756±0.016 25.2 0.271±0.034 9.03 2.79 1.82 46
BL4)C5) 0.686±0.027 22.9 0.249±0.021 8.30 2.76 1.80 47
[주]1)IF: 접종안함2)RS: 볏짚3)BS: 바실러스 서브틸리스 KCCM 113154)BL: 바실러스 리체니포미스 CN-1155)청국장6)
E.coliPQ37 균주내 MNNG(70ng/assay)에 대한 다양한 발효기간동안 발효시킨 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 SOS 억제반응효과
처리물 β-갈락토시다아제(β) 알카라인 포스페이트(a) β/a R2) 저해비율(%)
OD420 단위 OD420 단위
자발적 0.359±0.030 12.0 0.234±0.008 7.80 1.53 1.0 -
대조군 0.896±0.028 29.9 0.233±0.006 7.77 3.84 2.51 -
생대두 0.769±0.032 25.6 0.224±0.012 7.47 3.43 2.24 18
0일 발효 C1) 0.852±0.037 28.4 0.258±0.006 8.60 3.30 2.16 14
3일 발효 C 0.756±0.016 25.2 0.271±0.034 9.03 2.79 1.82 46
5일 발효 C 0.654±0.060 21.8 0.241±0.018 8.03 2.71 1.77 49
3일 발효 및 15일 후숙 C 0.803±0.054 26.8 0.281±0.003 9.37 2.86 1.87 42
[주]1)청국장2)
E.coliPQ37 균주내 MNNG(70ng/assay)에 대한 다양한 부재료를 사용하여 발효시킨 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 SOS 억제반응효과
처리물 β-갈락토시다아제(β) 알카린 포스페이트(a) β/a R4) 저해비율(%)
OD420 단위 OD420 단위
자발적 0.359±0.030 12.0 0.234±0.008 7.80 1.53 1.0 -
대조군 0.896±0.028 29.9 0.233±0.006 7.77 3.84 2.51 -
염1)C2) 0.803±0.054 26.8 0.281±0.003 9.37 2.86 1.87 42
염 + 1.1% 고춧가루 +1.1% 마늘 C 0.716±0.025 23.9 0.270±0.002 9.00 2.65 1.73 52
염 + 2.0% 고춧가루 +0.2% 마늘 C 0.749±0.038 25.0 0.265±0.009 8.83 2.83 1.85 43
염 + 0.2% 고춧가루 +2.0% 마늘 C 0.773±0.053 25.8 0.264±0.003 8.80 2.93 1.92 39
[주]1)7.9%2)청국장3)
실시예 3: in vitro 에서 청국장의 항암성
본 실시예에서는 상기 실시예 2와 같이 대두품종별, 스타터 균주별, 발효기간별, 부재료별로 제조하여 품질 특성을 조사한 청국장을 시료로 사용하였다.
본 실시예에서 사용한 사용시약 및 기기는 세포배양을 위해 DMEM(Dulbeco's modified Eagle's medium), FBS(Fetal bovine serum), 0.05% 트립신(trypsin)-0.02% EDTA 그리고 100units/mL 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin- Streptomycin)을 GIBCO사(USA)로 부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 CO2배양기(incubator;Sanyo, model MCO96, Japan)를 사용하였으며 암세포형태의 조직학적 관찰은 Olympus사의 inverted microscope(Olympus, model PM-10AK, Japan)를 이용하여 실험하였다.
본 실시예에서 실험에 사용된 암세포인 인체 위암세포(AGS, human gastric adenocarcinoma cell)는 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. 암세포 배양 AGS 위암세포는 100units/mL의 페니실린-스트렙토마이신(Penicilin-Streptomycin)과 10%의 FBS가 함유된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2배양기에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2∼3회 재급여(refeeding)하고 6∼7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신(trypsin)-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75mL 세포 배양 플라스크(cell culture flask)에 5mL씩 일정수 분할하여 주입하고 계속 6∼7일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 상기 배양된 암세포는 96 well plate에 well당 1×104mL이 되게 180㎕씩 분주하고 시료를 일정농도로 제조하여 20㎕ 첨가하여 37℃, 5% CO2배양기에서 72시간 배양하였다. 여기에 인산생리식염수에 5mg/mL의 농도로 제조한 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 20㎕를 첨가하여 동 배양조건에서 4시간 더 배양하였다. 이를 550×g에서 10분간 원심분리하여 상징액을 제거하고, 각 well 당 DMSO 150㎕를 가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 하기의 식으로 구하였다.
실험결과, AGS 인체 위암세포를 이용하여 대두 품종을 달리하여 제조한 청국장의in vitro항암효과는 표 14에 나타낸 바와 같이 만리콩으로 제조한 청국장이 MTT assay에서 AGS 인체 위암세포의 생존을 가장 크게 억제하여 각각 61%, 76%의 생존 저해효과를 나타내었다. 또한 준저리로 제조한 청국장도 AGS 인체 위암세포의 생존 저해효과가 다소 높아 50㎕/assay와 100㎕/assay에서 각각 51%, 64%의 저해효과를 보였다. 이상의 결과로부터 기능성의 측면에서 가장 우수한 청국장의 원료 대두로는 대립종보다는 소립 및 중립종이 우수하였는데 그중 만리콩이 가장 효과가 좋았다. AGS 인체 위암세포를 이용하여 스타터(Starter)의 종류를 달리하여 제조한 청국장의in vitro항암효과는 표 15에 나타낸 바와 같이 볏짚을 사용하여 제조한 청국장이 MTT assay에서 AGS 인체 위암세포의 생존을 가장 크게 억제하여 각각 74%, 79%의 생존 저해효과를 나타나 자연발효시는 볏짚사용이 우수하였다. 또한 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)로 제조한 청국장도 AGS 인체 위암세포의 생존 저해효과가 다소 높아 50㎕/assay와 100㎕/assay에서 각각 63%, 72%의 저해효과를 보였다. 이상의 결과로부터 기능성의 측면에서 가정 적절한 청국장의 종균으로 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)이 우수함을 알 수 있었다. AGS 인체 위암세포를 이용하여 발효기간을 달리하여 제조한 청국장의in vitro항암효과는 표 16에 나타내었다. 3일 발효 이후의청국장 메탄올 추출물의 처리농도가 50㎕/assay일 때는 대개 AGS 인체 위암세포의 생존을 50%정도 억제하였으며, 100㎕/assay의 처리농도에서 60%이상의 생존 저해효과를 보였다. 특히 5일 발효한 청국장이 MTT assay에서 AGS 인체 위암세포의 생존을 가장 크게 억제하여 각각 55%, 79%의 생존 저해효과를 나타내었다. 한편 발효 이후 후숙과정에서 암세포의 생존 저해효과는 큰 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로부터 기능성의 측면에서 가장 적절한 청국장의 발효기간은 3일이 가장 적절함을 알 수 있었다. AGS 인체 위암세포를 이용하여 부재료를 달리하여 제조한 청국장의in vitro항암효과는 표 17에 나타내었다. 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%를 첨가하여 제조한 청국장이 MTT assay에서 AGS 인체 위암세포의 생존을 가장 크게 억제하여 각각 59%, 64%의 생존 저해효과를 나타내었고 부재료 첨가를 달리하여 제조한 청국장의 암세포의 생존 저해효과는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로부터 기능성의 측면에서 청국장의 부재료 첨가 비율은 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%가 가장 우수함을 알 수 있었다.
따라서, 상기 실시예 2와 실시예 3의 결과에 따라 본 발명 항암 기능성 청국장은 만리콩을 정선 및 수세하여 1.5배의 물에 12시간 침지한 후 45분간 물빼기를 하고 이를 오토클래브(Autoclave)를 이용하여 60분 증자하고 50℃에서 냉각한 다음 전 배양한 종균액 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115)를 접종하여 40℃에서 72시간 발효하여 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%를 첨가하여 혼합 및 마쇄한 청국장을 항암 기능성이 가장 우수한 청국장으로 표준화하였다.
다양한 대두품종을 발효시켜 얻은 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 AGS 인간 위암세포에 대한 MTT 분석결과
처리물(mg/mL) OD540
0.05 0.1
대조군(PBS) 1.066±0.04a 1.066±0.04a
준저리-C1) 0.519±0.04d(51)2) 0.379±0.02c(64)
만리콩-C 0.414±0.04e(61) 0.254±0.05c(76)
황금콩-C 0.844±0.01b(21) 0.576±0.14b(46)
미국산 황색 1호-C 0.722±0.05c(32) 0.677±0.04b(36)
[주]1)청국장2) 3) a∼e: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
다양한 스타터 균주를 발효시켜 얻은 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 AGS 인간 위암세포에 대한 MTT 분석결과
처리물(mg/mL) OD540
0.05 0.1
대조군(PBS) 1.066±0.04a 1.066±0.04a
자연발효 접종안함 C 0.582±0.05e(45)4) 0.413±0.06b(61)
볏짚 C 0.273±0.03d(74) 0.229±0.09d(79)
스타터 BS3)C 0.519±0.04b(51) 0.379±0.02bc(64)
BL4)C5) 0.393±0.05c(63) 0.298±0.03cd(72)
[주]1)BS: 바실러스 서브틸리스 KCCM 113152)BL: 바실러스 리체니포미스 CN-1153)청국장4) 5) a∼d: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는차이를 나타낸다(P<0.05)
다양한 발효기간동안 발효시켜 얻은 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 AGS 인간 위암세포에 대한 MTT 분석결과
처리물(mg/mL) OD540
0.05 0.1
대조군(PBS) 1.066 ± 0.04a 1.066 ± 0.04a
생대두 0.0645 ± 0.09c(39)2) 0.552 ± 0.01b(52)
0일-발효 C1) 0.809 ± 0.08b(24) 0.609 ± 0.05b(43)
3일-발효 C 0.519 ± 0.04cd(51) 0.379 ± 0.02c(64)
5일-발효 C 0.481 ± 0.06d(55) 0.221 ± 0.04d(79)
3일-발효 및 15일 후숙 C 0.581 ± 0.10cd(45) 0.334 ± 0.02c(69)
[주]1)청국장2) 3) a∼d: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
다양한 부재료를 첨가하여 발효시켜 얻은 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 AGS 인간 위암세포에 대한 MTT 분석결과
처리물(mg/mL) OD540
0.05 0.1
대조군(PBS) 1.066±0.04a 1.066±0.04a
염1)C2) 0.681±0.10b(36)4) 0.534±0.02b(50)
염 + 1.1% 고춧가루 + 1.1% 마늘 C 0.438±0.04c(59) 0.386±0.02c(64)
염 + 2.0% 고춧가루 + 0.2% 마늘 C 0.561±0.06b(47) 0.459±0.08bc(57)
염 + 0.2% 고춧가루 + 2.0% 마늘 C 0.655±0.03b(39) 0.482±0.05bc(55)
[주]1)7.9%2)청국장3) a∼c: 다른 첨자는 Duncan's multiple range test에 의해 유의성 있는 차이를나타낸다(p<0.05)
실시예 4: in vitro 에서 청국장의 항암효과
본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 항돌연변이성과 항암성이 있는 것으로 확인되어 표준화한 본 발명 항암 기능성 청국장과 전통방식으로 제조된 청국장, 개량된 방식으로 제조된 청국장 및 낫또(Natto)의 항돌연변이효과와 항암효과를in vitro에서 조사하여 비교하였다. 이때, 전통적 방법은 상압에서 시루에 물을 넉넉히 하여 4시간 푹 삶고 이를 50℃로 식혀 볏짚을 깐 시루에 넣고 볏짚을 덮어서 축축한 면보자기나 담요를 쒸워 따뜻한 방아랫목(습도 80∼90%, 40℃)에서 3일 발효시키고 발효가 끝난 청국장 메주는 소금 7.9%, 마늘 1.1%, 고춧가루 1.1%를 첨가하여 절구에 굵고 균일하게 찧어 항아리에 담아 서늘한 곳(5∼10℃)에서 15일간 후숙시켰다. 개량적 방법은 stainless steel용기에 1.0∼1.5 kg/cm2에서 60분 증자한 뒤 50℃로 식혀Bacillus subtilis종균을 원료무게의 1% 접종하여 40℃에서 72시간 발효시킨다. 발효가 끝나면 소금만을 첨가하여 혼합·마쇄한 후 숙성과정을 생략하였다.
상기와 같이 제조방법에 따른 청국장의 항돌연변이성 조사는 실시예 2와 동일하게 실시하였고 항암성은 실시예 3의 방법과 동일하게 실시하였다.
실험결과, 표 18에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 2에서 항돌연변이성이 확인된 기능성 청국장 메탄올 추출물이 첨가농도 2.5mg/plate에서 31% 정도로 AFB1의 돌연변이성을 저해하였고 첨가농도 5mg/plate에서는 63% 정도로 유사한 항돌연변이 효과를 관찰할 수 있었다. AGS 인체 위암세포를 이용하여 기능성 청국장, 전통식과 개량식으로 제조된 청국장 및 낫또(Natto)의 메탄올 추출물의in vitro항암효과는 표 19에 나타낸 바와 같이 기능성 청국장이 MTT assay에서 AGS 인체 위암세포의 생존을 억제하여 각각 44%, 67%의 생존 저해효과를 나타내었다.
따라서 본 실시예의in vitro실험결과로부터 표준화한 본 발명 항암 기능성 청국장이 전통식 또는 개량식으로 제조된 청국장 및 일본의 낫또(Natto)보다 항돌연변이 및 항암효과가 우수함을 알 수 있었다.
본 발명 항암 기능성 청국장과 전통식 및 개량식으로 제조된 청국장의 항돌연변이성 조사결과
농도(mg/plate)처리물 복귀돌연변이수/플레이트
1.25 2.5
자발적 141±23
대조군(AFB1) 996±56a
T1)청국장 831±69bc(19)4) 650±51c(40)
M2)청국장 915±13b(9) 763±48b(27)
F3)청국장 729±21cd(31) 454±7d(63)
낫또(Natto) 777±118bc(26) 504±59d(58)
[주]1)T: 전통방법2)M: 개량방법3)F: 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장 제조방법4)저해비율(%)a∼d: 다른 첨자는 Duncan's multiple range test에 의해 유의성 있는차이를 나타낸다(p<0.05)
본 발명 항암 기능성 청국장과 전통식 및 개량식으로 제조된 청국장으로부터 얻은 메탄올 추출물의 AGS 인간 위암세포에 대한 MTT 분석결과
샘플(mg/mL) OD540
0.05 0.1
대조군(PBS) 1.489±0.088a 1.489±0.09a
T1)청국장 1.062±0.04b(29)4) 0.876±0.14b(41)
M2)청국장 1.019±0.04b(32) 0.759±0.02b(49)
F3)청국장 0.833±0.05c(44) 0.498±0.03c(67)
낫또(Natto) 0.962±0.04b(35) 0.706±0.14b(53)
[주]1)T: 전통방법2)M: 개량방법3)F: 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장 제조방법4) a∼c: 다른 문자는 Duncan's multiple range test에 의한 유의성 있는차이를 나타낸다(p<0.05)
실시예 5: in vivo 에서 청국장의 항암효과
본 실시예에서는 상기 실시예 4에 의해in vitro에서 확인된 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장 제조방법에 의해 제조된 본 발명 항암 기능성 청국장의 항암효과를in vivo에서 조사하기 위해 먼저 청국장의 세포독성실험을 행한 후 고형암 성장저지실험과 자연살해세포 활성조사 실험을 차례로 실시하였다. 실험동물은 웅성 Balb/c mouse(한국화학연구소, 대전)로, 체중이 25g 전후의 것을 사용하였으며, 사료는 표준사료로 사육하였다. 사육시 물과 사료는 충분한 양을 공급하였고, 동물실험실은 온도 22±1℃, 습도 55±5%를 유지하였으며, 12시간 간격으로 명암주기(light-dark cycle)를 유지하였다.
종양세포는 Balb/c mouse의 복강내에 1주일 간격으로 계대배양하여 보존하고 있는 sarcoma-180 세포를 실험용 종양세포로 사용하였다. 즉 실험동물의 복강내에서 1주일간 배양된 sarcoma-180세포를 복수와 함께 취하고 포스페이트 버퍼 사린(phosphate buffered saline;PBS)과 함께 원심분리(1,200 rpm, 10min.)하여 종양세포를 분리하였다. 분리된 세포를 다시 PBS에 부유시켜 재차 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1.0×106cells/mL가 되도록 종양세포 부유액을 만들어 1mL씩을 복강주사하여 이식 보존하면서 실험에 사용하였다. 사용한 청국장 시료는 멸균된 PBS를 사용하여 조제하였으며 투여량은 마우스 ㎏당, 1㎎으로 하고, 대조군은 멸균 PBS만 투여하였으며, 투여하지 않을 때는 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
제 1 공정: 세포독성실험
항암효과를 나타낸 시료의 직접적인 세포 독성작용의 유무를 알아보기 위해서 다이 익스클루젼법(dye exclusion method)를 이용하여in vitro에서 생존시험(viability test)을 행하였다. 1회용 24well plate에 조제한 종양세포 부유액 1mL(2.0 ×105cells)과 최종 농도 20% HFCS(heat inactivated fetal calf serum: Gibco Lab., USA)의 RPMI 배지 1mL를 가하였다. 여기에 100㎕의 시료를 넣어서 37℃, 5% CO2배양기(incubator)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 세포 50㎕를 0.2% 트립신 블루(trypan blue) 용액 50㎕와 잘 섞어 헤모사이토메터 (hemocytometer)를 사용하여 전체의 세포수와 염색되어진 세포(non-viable cell)및 염색되지 않은 세포(viable cell)의 수를 측정한 다음, 시료를 넣지 않은 대조 세포군과 비교하여 생존(viability) 비율을 계산하였다.
실험결과, 표 20에 나타낸 바와 같이 모든 시료가 1.0mg/mL까지 독성이 없었으므로 1.0mg/kg의 시료를 마우스 복강에 투여하여 고형암성장저지 효과를 조사할 수 있음을 알 수 있었다.
다양한 종류의 청국장으로부터 메탄올 추출한 추출물을 함유하는 배양배지내 sarcoma-180 세포의 생존성
샘플 최종농도(mg/mL) 총세포수(×104) 생존세포(%)
대조군 21.7±0.5 97
T1)청국장 0.250.51.02.5 22.0±0.821.7±0.521.0±0.820.0±0.8 92898683
M2)청국장 0.250.51.02.5 22.0±0.821.0±0.819.3±0.918.3±0.9 92867973
F3)청국장 0.250.51.02.5 23.7±0.521.7±0.521.0±0.820.0±0.8 98898683
낫또 0.250.51.02.5 21.7±0.521.0±0.819.3±0.917.3±0.6 89867975
[주]1)T: 전통방법2)M: 개량방법3)F: 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장 제조방법
제 2 공정: 고형암 성장저지 실험
실험동물을 각 군당 6마리씩으로 하여 실험실에서 1주일 간격으로 계대 보관 중인 종양세포부유액 0.2㎖(6×106cells/mouse)씩을 실험동물의 왼쪽 서혜부(left groin)에 피하 이식한 후 24시간 후부터 20일간 매일 1회씩 시료 용액를 복강으로 투여하였다. 종양세포 이식 26일째 되는 날 치사시켜 간, 비장 등의 장기의 중량변화를 조사하고 생성된 고형암을 적출하여 그 무게를 측정한 후 하기 식에 따라 종양 성장 저지 백분율( tumor growth inhibition ratio, I.R.: %)을 계산하였다.
Cw : 대조군의 평균 종양무게
Tw : 처리군의 평균 종양무게
실험결과, 표 21에 나타낸 바와 같이 종양세포만 이식한 대조군은 정상마우스보다 비장, 간의 중량비가 크게 증가하였고 청국장 시료를 투여한 군에서 이들의 중량비가 감소하였다. 종양이 무게는 표 22에 나타낸 바와 같이 종양세포만 이식한 대조군은 종양의 무게가 7.1g이었으나 전통식 청국장 투여군은 종양의 무게가 5.0g으로 감소하여 30%의 종양생성억제효과를 나타내었다. 개량식청국장 투여군은 전통식 청국장보다 높은 35%의 종양형성억제효과를 보였고, 표준화한 본발명 항암 기능성 청국장 투여군은 종양의 무게가 3.1g으로 56%의 종양형성 억제효과를 보여 청국장 중에서는 가장 높은 고형암 성장저지효과를 나타내었다.
Sarcoma-180 세포를 이식하고 청국장 시료를 투여한 후 26일째의 Balb/c마우스의 비장, 간, 심장, 신장 무게를 측정한 결과
샘플 Dose(mg/kg) 체중wt.(g) 비장/몸wt.(%) 간/몸wt.(%) 심장/몸wt.(%) 신장/몸wt.(%)
대조군 25.9±0.7 0.5±0.1 6.9±0.8 0.4±0.1 1.6±0.2
S-180+PBS 28.8±1.5 1.0±0.1 8.0±0.6 0.4±0.1 1.5±0.1
S-180+T1)청국장 1.0 28.7±1.1 1.0±0.1 7.3±0.5 0.3±0.1 1.4±0.2
S-180+M2)청국장 1.0 29.9±0.6 0.8±0.1 7.4±0.7 0.4±0.1 1.4±0.1
S-180+F3)청국장 1.0 29.0±0.7 0.8±0.1 7.6±0.4 0.3±0.1 1.4±0.1
S-180+낫또 1.0 28.5±1.0 0.8±0.1 7.7±0.3 0.4±0.1 1.5±0.1
[주]1)T: 전통방법2)M: 개량방법3)F: 본 발명에서 표준화한 항암 기능성 청국장 제조방법
Balb/c 마우스에 sarcoma-180 세포를 이식한 후 청국장 시료를 투여하고 종양세포 이식후 26일째 치사하여 측정한 고형암무게 측정
샘플 Dose(mg/kg) 고형암무게(g) 저해비율(%)
S-180+PBS 1.0 7.1±0.6
S-180+T1)청국장 1.0 5.0±0.4 30
S-180+M2)청국장 1.0 4.6±0.4 35
S-180+F1)청국장 1.0 3.1±0.8 56
S-180+낫또 1.0 5.0±0.6 30
[주]1)T: 전통방법2)M: 개량식방법3)F: 기능적방법
제 3 공정: 면역활성 증강 실험
표준화한 본 발명 항암 기능성 청국장의 면역활성 증강실험을 실시하기 위해먼저 마우스 비장 림프구의 분리하여 이펙터 세포(Effector cell)를 제조하였다. 즉, Balb/c 마우스의 비장을 clean bench 내에서 무균적으로 적출하여 penicillin(100 U/mL), 스트렙토마이신(streptomycine;100㎍/mL)를 함유한 5mL의 RPMI 1640 배지로 3회 세척한 후 곱게 마쇄하였다. 이 세포부유액을 70㎛ nylon mesh로 여과하고 원심분리하여 림프구를 모은 다음 배지에 부유시킨 후 histopaque-1077을 이용하여 원심분리(500×g, 30 min, 18℃)하여 림프구를 분리하였다. 준비된 세포를 10% FCS, 2mM L-glutamine, penicillin(100 U/㎖), streptomycin(100㎍/㎖)를 함유한 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 이것을 37℃, CO2incubator에서 1∼2시간 배양시켜서 세포가 배양 플라스크(60㎜ dish)에 부착되도록 하였다. 비부착성 자연살해(natural killer;NK) 세포를 원심분리를 통해서 수집하여 배양배지에 재현탁시킨 다음 적정 세포수를 계수하여 사용하였다. 이어서, 자연살해세포의 활성을 측정하였다. Yac-1 마우스 임파구 세포(mouse lymphoma cell)를 타겟세포(target cell)로 사용하였는데, Yac-1 세포는 10% FCS, 2mM L-glutamin, penicillin(100 U/mL), streptomycin(100㎍/㎖)를 함유한 RPMI 1640 배지에 5×104cells/mL의 밀도가 되도록 희석한 후, 각 well에 50㎕씩 첨가하였다. NK cell은 1×107cells/mL의 밀도로 현탁시켜 50㎕씩을 96well plate-bottomed microtire plate에 첨가하였다. 이것을 37℃, CO2incubator 안에서 3일간 배양시킨 후 MTT(5㎎/㎖)용액을 10㎕씩 각 well에 가한 다음 37℃에서 4시간 배양하였다. 여기에 SDS(10% in 0.02N HCl)을 25㎕ 첨가하여 실온에서 30분간 발색시킨 후에 540nm에서 OD를 측정하였다. 세포독성 백분율(Cell cytolysis percentage)는 하기 식에 의해서 계산하였다.
실험결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 Yac-1 세포에 대한 세포파괴 활성이 전통방법으로 제조한 청국장 투여군은 40%, 전통방법을 개량한 방법으로 제조한 청국장과 표준화한 본 발명 항암 기능성 청국장을 투여한 군은 각각 44%와 64%로 기능성 청국장 투여군이 청국장 투여군 중에서는 NK cell의 면역활성이 가장 높았다. 또한 청국장 투여군들은 모두 낫또(37%)보다는 높은 세포파괴활성을 보였다.
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 원료대두로 중소립콩을 정선 및 수세하고 1.5배의 15℃ 물에 12시간 침지한 후 탈수시간을 45분으로 하고 1.0∼1.5㎏/㎠ 오토클래브(Autoclave)를 사용하여 60분간 증자하고 전배양한 종균액을 접종하여 40℃에서 48시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 2.0%, 마늘 0.2%를 첨가하여 혼합 및 마쇄하고 5℃에서 15일간 후숙하여 제조한 청국장은 풍미가 우수한 뛰어난 효과가 있고 또 중소립콩을 위와 같은 방법으로 처리하고 오토클래브를 사용하여 60분 증자하고 전배양한 종균액을 접종하여 40℃에서 72시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%를 첨가하고 혼합 및 마쇄하여 바로 제조한 청국장은 항암 기능성이 우수한 항암 기능성 청국장으로 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 중소립콩을 정선 및 수세하여 1.5배의 15℃ 물에 침지한 후 45분간 탈수하여 1.0∼1.5㎏/㎠ 오토클래브를 사용하여 60분간 증자하고 50℃로 냉각한 다음, 전배양한 종균액을 접종하여 40℃, 48시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 2.0%, 마늘 0.2%를 첨가하여 혼합 및 마쇄하고 5℃에서 15일간 후숙하여 풍미가 우수한 청국장으로 표준화한 것을 특징으로 하는 기능성 청국장 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 종균액은 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 볏짚 고초균 임을 특징으로 하는 기능성 청국장 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 중소립콩은 만리콩 임을 특징으로 하는 기능성 청국장 제조방법.
  4. 상기 제 1 항 기재의 방법에 의해 제조된 기능성 청국장.
  5. 중소립콩을 정선 및 수세하여 1.5배의 15℃ 물에 12시간 침지한 후 45분간 물빼기를 하고 이를 1.0∼1.5㎏/㎠ 오토클래브를 이용하여 60분 증자하고 50℃로 냉각한 다음 전 배양한 종균액을 접종하여 40℃에서 72시간 발효시킨 후 소금 7.9%, 고춧가루 1.1%, 마늘 1.1%를 첨가하여 혼합 및 마쇄하여 항암 기능성이 있는 것으로 표준화한 것을 특징으로 하는 기능성 청국장 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 종균액은 바실러스 리체니포미스 CN-115(Bacillus licheniformisCN-115), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 볏짚 고초균 임을 특징으로 하는 기능성 청국장 제조방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 중소립콩은 만리콩임을 특징으로 하는 기능성 청국장 제조방법.
  8. 제 5 항 기재의 방법에 의해 제조된 기능성 청국장.
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