KR100437968B1 - 프로바이오틱 바실러스 메가테리움 ｐｓ352를 이용한 효소의 생산방법 - Google Patents

프로바이오틱 바실러스 메가테리움 ｐｓ352를 이용한 효소의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로바이오틱 바실러스 메가테리움 PS352(probioticBacillus megateriumPS352)의 발효 특히 고체발효를 통한 고농도의 효소 생산방법 및 고체 발효물을 사료용 첨가제로 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 프로바이오틱스(probiotics) 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)는 여러 병원성 미생물에 대해 강한 항균력이 있고, 다양한 사료 첨가용 항생제에 대해서도 내성을 지닌다. 또한 담즙산 및 인공 위액에 대해서도 내성을 지녔으며 다양한 범위의 pH 와 열에 대해서도 안정적으로 생존 가능하다. 또한 고체발효에서 전분분해효소, 단백질분해효소, 자일란분해효소, 펙틴분해효소, 글루칸분해효소와 인산분해효소를 높은 역가로 생산한다.
따라서, 본 발명에 의한 균주에 의하여 저렴하고 우수한 사료첨가용 미생물 제제를 얻는 것이 가능하게 된다.

Description

프로바이오틱 바실러스 메가테리움 ＰＳ352를 이용한 효소의 생산방법{A Method for Production of feed enzymes using a probiotic strain, Bacillus megaterium PS352}
본원 발명은 프로바이오틱 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)를 이용한 효소의 생산방법 특히 고체발효를 통한 효소의 생산방법 및 고체발효된 발효물을 동물용 사료 또는 사료 첨가제로 사용하는 방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스 또는 프로바이오틱 균주(probiotics, probiotic strain)는 숙주의 장내에서 생존·생장하면서 장내 미생물 균총의 균형을 유지시키며 숙주에 유용한 각종 대사산물을 생산함으로써 숙주의 건강증진과 사료효율을 증대시키는 등의 효과를 보이는 살아있는 미생물 제제로 현재 동물용 사료 첨가제로서 널리 사용되고 있다.
이러한 프로바이오틱 균주가 유효하게 작용하기 위해서는 사료 등에 포함된 상태에서 숙주에 의해 섭취된 후 위와 십이지장을 통하여 장에 정상적으로 도달하여 정착해야 하므로 위액 및 담즙산에 대한 내성이 있어야 한다. 또한 사료에는 통상 다양한 종류의 항생제가 첨가되므로 이들 항생제에 대해서도 내성이 있어야 할 뿐만 아니라 다양한 균총으로 이루어진 숙주의 장내에서 생장하기 위해서는 장내의 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력이 있어야 한다. 나아가 숙주에 유용한 대사산물을 생산·분비해야 하므로 고농도의 효소 분비 또한 가축의 소화율 향상및 환경 정화 측면에서 필수적인 요건이 되고 있다. 또한 통상 35~40℃에 이르는 숙주의 장내에서 우수한 생장특성을 보여야 한다.
한편 대부분 기존의 고체발효를 통한 효소의 생산은 아스퍼질러스 속(Asergillussp.), 트라이코더마 속(Trichodermasp.), 바실러스 속(Bacillussp.) 등의 효소 생산 능력에만 치중하여 생산되어졌으므로 미생물을 포함한 고체 발효산물 자체를 프로바이오틱 용도(사료용 생균제)로 사용하는 데 있어서는 그 안정성에 문제가 있었다.
따라서, 효소 생산능력이 우수하면서도 병원성 미생물에 대한 강한 항균력, 위산에 대한 내성, 내담즙산성, 항생제 내성 및 열에 대한 안정성을 지니고 있어 사료에 첨가되는 경우 장내 미생물 균형을 향상시킴으로서 숙주에 건강 증진 효과 등 좋은 영향을 끼치는 프로바이오틱스(probiotics)의 잇점과 다양한 효소를 고농도로 생산하는 효소 생산 균주의 잇점을 동시에 지닌 균주의 개발이 요구되고 있다. 이러한 균주는 통상 사료의 원료인 대두박과 말분을 그대로 배지로 사용하여 정체발효를 함으로 발효시 멸균을 위해 소모되는 전력비, 투입되는 인력비 절감 효과를 기대할 수 있으며, 발효가 완료된 후 발효배지 자체를 사료에 혼합하여 사용하므로 별도의 정제과정을 필요로 하지 않아 경제적인 측면에서도 상당한 장점을 지니게 될 것이다.
한편 프로바이오틱 균주(probiotic strain)의 정체 고체발효를 통한 효율적인 효소의 생산에는 배지의 높이, 발효온도, 공기량, 산소압, 배지의 pH, 생균수등 여러가지 요소가 복합적으로 작용하는데 그 중 배지의 높이(깊이), 수분함량, 배지 내부온도, 투입되는 공기의 성질이 매우 중요한 요소인 것으로 알려져 있다. 예컨데, 배지의 높이가 너무 낮을 경우 수분의 감소로 인해 균주의 생장이 저해되므로 효소의 생산성이 급격히 저하되며, 배지의 높이가 너무 높을 경우 산소의 부재로 인한 생균수의 감소 및 수분의 하강 효과에 의한 곰팡이 감염이 급격히 증가한다.
따라서, 프로바이오틱 균주의 원활한 이용을 위한 적절한 고체배양 조건을 개발하는 것이 필요하다.
본 발명은 프로바이오틱스 특성을 지니는 균주를 이용하여 유용효소를 생산하는 방법, 특히 효율적인 고체배양 방법을 통해 유용효소를 생산하는 방법 및 고체배양을 통해 얻어진 배지를 동물용 사료의 첨가제로 활용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명에 의한 균주를 고체발효 과정에서의 배지의 산소압, 온도, pH, 수분함량의 변화를 나타내는 그래프.
도 2는 본 발명에 의한 균주를 고체배양하는 과정에서의 균주의 생균수, 내성포자의 수 및 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성변화를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명에 의한 균주를 고체배양하는 과정에서 배지의 두께에 따른 균주의 생균수, 내성포자의 수 및 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성변화를 나타내는 그래프.
도 4는 배지 내부열 조절에 따른 생균수 및 전분분해효소, 단백질분해효소 활성 증가 효과를 보여주는 그래프.
도 5는 고체발효시 공급공기의 수분을 조절함에 따른 균주의 생균수, 내성포자의 수 및 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성변화를 나타내는 그래프.
도 6은 생산된 효소의 건조공정의 처리온도에 따른 활성변화를 나타내는 그래프.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)(KFCC-11179) 균주를 배양하여 그 배양물로부터 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특히 전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease),자일란분해효소(xylanase), 펙틴분해효소(pectinase), 글루칸분해효소(β-glucanase) 및 인산분해효소(phytase)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 상기 균주는 한국의 전통발효식품인 된장에서 분리하였다.
재래식 시장에서 판매자가 직접 제조한 된장을 구입하여 적절한 분량의 된장을 순차희석 도말법을 사용하여 된장에 존재하는 다양한 미생물을 얻었다. 이 후 형성된 군집을 성상별로 분리하여 이를 다시 영양한천배지에 도말한 후 단일 군집을 분리하는 과정을 반복하였다.
분리된 단일 균주들 중 플레이트에서의 효소 활성 측정법을 통해 가장 높은 전분분해효소와 단백질분해효소 활성을 나타내는 균주인 PS352를 분리하였다.
분리균 PS352는 포자를 형성하는 막대형 세균으로서 운동성이 있는 그람양성균이었다. 분리한 균주에 대하여 일반적인 실험방법에 의거하여 그람염색, 산화효소, 카탈라아제, 각종 단백질의 생산 등 생화학적 특성 및 균주의 세포벽 지방산 성분을 분석한 결과, 분리균은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 속하는 신균주임을 확인하였고 이를 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)로 명명하고 한국종균협회(KFCC)에 기탁하여 균주번호 KFCC-11179를 부여받았다.
상기 분리된 바실러스 메가테리 움PS352(Bacillus megateriumPS352)는 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력이 뛰어날 뿐 아니라 다양한 사료첨가용 항생제, 담즙과 위액에 대한 내성 및 열에 대한 안정성이 우수한 미생물로 확인되었다.
또한 상기의 바실러스 메가테리움 PS352은 전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 인산분해효소(phytase) 등 다양한 효소를 고농도로 분비하였다.
따라서, 상기 분리된 바실러스 메가테리움 PS352은 프로바이오틱 균주로서의 특성을 모두 가지는 우수한 균주로서, 사료용 첨가제로 사용되거나 사료에 첨가되어 사용될 수 있을 것이다.
이때 상기 균주를 배양하는 방법으로는 고체배양을 선택할 수 있는데, 이때 고체배양은, 두께 5∼10cm, 초기 수분함량 40∼50%인 대두박과 말분을 주재료로 하는 혼합배지에 상기 균주를 접종하여 25 ~ 35℃에서 60 ~ 84시간 배양하면서 발효 중 배지 중심부의 온도가 32 ~ 38℃, 배지의 최종 수분함량이 20∼30%로 되도록 조절하면서 0.6 ~ 1.0 vvm의 건조 공기를 배지에 공급하는 것이 효소의 효과적인 생산을 위해 중요하다.
상기와 같이 최적화된 방법으로 고체배양하는 경우 전분분해효소, 단백질분해효소, 자일란분해효소, 펙틴분해효소, 글루칸분해효소과 인산분해효소의 효소 활성은 각각 500,000, 200,000koU/g, 7,800, 15,600, 53,900, 20,620koU/g에 이르는 등 고활성의 다양한 효소를 생산할 수 있다.
이렇게 생산된 각종 효소는 필요에 따라 통상 알려져 있는 단백질 분리방법에 의해 개별 또는 복합 효소로 분리할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기위한 예일 뿐이며 이에 의하여 본 발명의 기술적 범위가 축소되거나 변경되는 것은 아니며 또한 본 발명의 개념이 실시예에만 국한되는 것은 아니다.
설명의 편의를 위해 본 실시예에서 사용된 효소의 활성 측정방법을 먼저 설명한다.
대두박과 말분 배지(1:1)에 각각 1.0×107CFU/g 농도로 균주 PS352를 접종하여 고체발효(30℃, 72시간 45% (v/w) 수분함량)를 진행한 후 발효가 완료된 발효산물 10g을 멸균된 증류수 900ml에 현탁하여 30℃에서 약 10분간 진탕한 후 6,000rpm의 속도로 원심분리하여 얻은 상등액을복합효소액(이하 단순히 "효소 추출액", "효소액" 또는 "효소 용액"이라 함)으로 사용하여 효소의 역가를 측정하였다.
전분분해효소의 활성은 0.1% 전분 용액 900㎕에 균주 배양액 혹은 효소 추출액을 100㎕ 첨가하여 30℃에서 30분간 반응시킨 후 동량의 DNS(dinitro salicylic acid)용액을 혼합하여 물에 15분간 끓인 후 570nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 계산하였다. 대조구에서는 효소액 대신 멸균수를 100㎕ 첨가시켜 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
자이란분해효소, 글루칸분해효소, 펙틴분해효소의 효소 활성은 0.1% 전분 용액 대신 1% xylan, 0.5% glucan, 1% pecin을 사용하여 측정하였다. 이상 탄수화물 분해효소의 단위 활성(Unit)은 기질 용액과 30℃에서 30분간 반응하여 효소가 첨가되지 않은 대조구와 비교할 때 0.001의 흡광도 값의 차이를 나타나게 하는 효소의 량으로 정의하였다.
단백질분해효소의 활성은 1% 아조카제인(Azocasein) 100㎕을 반응용액 400㎕에 첨가한 후 효소액을 100㎕을 처리하여 30℃에 반응시켰다. 이후 동량의 10% TCA(trichloro acetic acid)를 처리하여 얼음에 5분간 방치하고 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 390nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 계산하였다.
인산분해효소(phytase)의 활성은 5mM 인산나트륨(sodium phytate) 용액 600㎕에 효소 용액 150㎕를 가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 15% TCA 용액 750㎕를 가하여 반응을 종결한 후 위 반응액 100㎕를 멸균증류수 900㎕와 혼합한 후 발색시약(2g ascorbic acid, 0.5g ammonium molybdate, 95% H2SO4 5.7ml/ 100ml 증류수) 1ml을 가하여 50℃에서 20분간 반응시키고 파장 820nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 측정 후 인산 용액(K2HPO4) 표준 곡선과 비교하여 최종 환원된 인의 값을 환산하였따. 효소의 단위 활성은 분당 1μM의 인을 유리시키는 효소의 량으로 정하였다.
실시예 1. 미생물의 분리·동정 및 특성조사
재래식 시장에서 구입한 된장을 0.95% 생리식염수에 10배씩, 최종적으로 107배까지 희석하였다. 희석된 용액을 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에 도말 하여 37℃에서 48시간배양하였다. 형성된 군집을 계속 새로운 영양한천배지에 계대배양 하면서 23개의 단일균종을 확보한 후 플레이트에서 전분 분해효소 및 단백질 분해효소 활성을 측정하여 가장 높은 활성을 보이는 균주 PS352를 분리하였다. 즉, 전분(soluble starch)이 1% 포함된 영양한천배지 (소고기 추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 한천 1.5%)에 멸균된 이쑤시게를 이용하여 단일균종을 접종한 뒤 30℃에서 24시간 배양한 후 요오드 용액으로 염색하여 생기는 투명환의 크기가 큰 5종의 단일균종을 선택하였다. 이어서 탈지분유(skim milk)가 1% 포함된 영양한천배지(소고기 추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 한천1.5%)에 멸균된 이쑤시게를 이용하여 상기 선택된 5종의 단일균종을 접종한 뒤 30℃에서 24시간 배양한 후 생기는 투명환의 크기가 가장 큰 것을 선택하여 PS352로 명명하였다.
다양한 생화학적 시험 및 Biolog. system(Biolog Microlog 3 4.01A)을 사용하여 최종 분리된 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여 하기 표 1에 나타내었다.
분석 결과 분리균주는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 속하는 신균주인 것으로 동정되어 이 균주를 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352) 로 명명하였고 한국종균협회(KFCC)에 기탁번호 KFCC-11179로 기탁하였다.
분리균주의 병원성 미생물에 대한 항균력, 각종 사료첨가용 항생제에 대한 내성, 담즙산 인공위액에 대한 안정성, 열 및 pH 안정성 등을 조사하였다.
(1) PS352의 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력
교차배양 및 2단 배양을 통하여 본 발명의 균주인 바실러스 메가테리움PS352의 병원성 미생물에 대한 항균력을 조사하였다.
교차 배양법을 통하여 항균력을 시험하기 위하여 새균오염의 지표가 되는 대장균(Eschelichia coli), 식중독 원인균인 스트렙토 코커스(Streptococcussp.), 살모넬라 타이피뮤리움(Samonella typhimurium), 살모넬라 콜레래시어스(Samonella choleraesuis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 비브리오패혈증의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus)를 병원성 미생물로 선택하였다.
먼저 분리된 균주를 영양한천배지 (beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에서 30℃로 24시간 동안 진탕 배양한 후 1% 사료 한천 배지(양계용사료 2%, agar 1.5%)에 백금이를 사용해 상기 선택한 병원성 미생물을 교차도말한 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.
상기의 교차배양에서 PS352는 비브리오 파라헤모라이티커스를 제외한 모든 병원성 미생물에 대한 강한 항균력을 지니고 있는 것을 보여주었다.
한편 2단 배양을 위해 영양배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%)에서 12시간 배양된 대장균, 락토코커스 속(Lactococcussp.), 살모넬라 타이피뮤리움 및 스타필로코커스 아우레우스 각각을 한천이 0.6% 포함된 겔 형태의 영양배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%)한 후, PS352가 점 배양된 MRS(DeMan Rogosa and Sharpe broth) 상면에 부은 후 37℃에서 배양하였다. 24시간 배양 후 모든 실험구에서 투명환이 형성되어 본 균주가 피검체에 대한 강한 항균력을 보유하고 있음을 확인하였다.
교차 배양 및 2단 배양법을 통한 PS352의 항균력 시험 결과를 표2에 자세히 나타내었다.
(2) PS352의 항생제 내성
사료 첨가용 항생제에 대한 본 발명의 균주인 바실러스 메가테리움 PS352의 내성을 조사하였다.
타이로썰파(tyrosulfa), 플라보마이신(flavomycin), 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline), 젠타마이신(gentamycin), 노플라쎄신(norflaxacins), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 클로로테트라사이클린(chlorotetra- cycline), 콜리스틴(colistin), 카시트라신(cacitracin), 암모시실린(amoxicillin), 퓨라조리딘(furazolidine)을 각각 0∼500 ppm 포함하는 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에 본 발명에 의한 균주를 도말하여 30℃로 24시간 배양 후 균의 성장 여부를 조사함으로써 항생제 내성을 판단하였다.
그 결과 PS352는 플라보마이신(flavomycin), 카시트라신(cacitracin)을 제외한 모든 항생제에 대하여 내성을 가지고 있음이 확인되었다. 각 항생제에 대한 자세한 내성 한계농도를 표 3에 나타내었다.
(3) PS352의 담즙과 인공 위액에 대한 내성
바실러스 메가테리움 PS352의 담즙과 인공 위액에 대한 내성을 조사하였다
담즙을 0%에서 3%까지 0.5%(w/v) 단위로 함유하는 MRS 평판 배지에 PS352를 도말하여 30℃에서 24시간 배양 후 균의 성장 여부를 보았다. 본 발명에 의한 균주는 담즙 농도 3.0%에서도 활발히 생존함으로써 강한 내담즙산성을 보였다.
인공 위액에 대한 내성 판단은 0%에서 1%까지 0.2%(w/v) 단위의 pepsin으로2시간 처리한 균주배양액을 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 균의 생존 여부를 확인하였다. 그 결과 본 균주는 1% 펩신(pepsin) 처리 후에도 정상적인 생육을 함으로써 인공위액에 대한 강한 내성을 나타내었다.
표 4에 PS352의 담즙 및 펩신 농도에 따른 내성 시험 결과를 나타내었다.
(4) PS352의 pH 및 열 안정성
분리된 균주바실러스 메가테리움 PS352의 pH 및 열에 대한 안정성을 조사하였다.
pH 2 ∼ pH 12까지의 완충용액(20mM citrate-phosphate buffer for pH 2.0-6.0; 20mM potassium phosphate buffer for pH 6.0-8.0; 20mM glycine-NaOH bufferfor pH9.0-12.0)에 분리된 균주 배양액을 4시간 방치한 후 영양배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 생균수(콜로니 수)의 상대비를 조사하였다. 실험 결과 PS352는 pH 4 ∼ pH 9의 넓은 범위에서 안정적으로 생존함을 알 수 있었다.
열에 대한 안정성은 배양액을 10℃에서 70℃까지의 수조에 15분간 처리한 뒤 상기와 같은 방법으로 생균수를 측정하여 판단하였으며 PS352는 전 범위에서 안정적으로 성장하는 것으로 나타났다.
실시예 2. 고체배양에 영향을 미치는 요소의 조사
25cm두께로 제조된 대두박과 말분(1:1) 배지에 24시간 배양된 바실러스 메가테리움 PS352 균주를 약 10% (1.0×107CFU/g 생균수)의 양으로 접종하여 최종 수분함량을 45%로 조절한 후 30℃에서 72시간까지 발효를 실시하였다.
발효가 진행되는 동안 매 24시간마다 산소압, 배지의 pH, 배지 중앙부의 온도, 배지의 수분함량을 조사한 결과 산소의 요구량과 내부의 온도 상승은 발효 48시간째 최대를 나타내다가 그 후 완만하게 떨어지는 것을 확인하였다. pH의 경우에 있어서는 발효가 진행됨에 따라 약간의 pH 상승을 나타내었고 수분함량은 발효가 종료된 후 약 25∼35%로 감소해 있었다. 도 1에 자세한 결과를 나타내었다.
실시예 3. 균주의 성장에 따른 효소의 생산성
상기 실시예 2의 조건으로 발효를 진행하면서 생균수, 내성 포자수 및 전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease) 활성 변화를 조사하였다.
발효 48시간까지 생균수와 내성 포자수는 각각 약 1.0×1010, 1.0×1010CFU/g까지 계속적으로 증가하다가 이 후 정지기로 유지되었고 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성은 발효시간 96시간째 최대를 나타내었는 바, 이때 각 효소의 활성은 26,600, 30,400koU/g였다. 도 2에 균주의 성장에 따른 효소 활성을 도식화하여 나타내었다.
실시예 4. 배지의 두께가 효소 활성에 미치는 영향
5, 10, 15, 20, 25, 30cm 두께로 제조된 대두박과 말분(1:1) 배지에 24시간 배양된 바실러스 메가테리움 PS352 균주를 상기 실시예 2에서와 같은 양으로 접종하여 최종 수분함량을 45%로 조절한 후 30℃에서 72시간까지 발효를 실시하였다.
전분분해효소와 단백질분해효소의 활성은 배지의 두께가 감소할수록 증가하는 경향을 보였고 5cm 배지 두께일 때 가장 높은 활성을 보였다. 그러나 이 효소 활성은 표면 발효와 비교해 볼 때 전분분해효소의 경우에는 약 4.6배, 섬유소 분해효소의 경우에는 약 10배, 단백질분해효소의 경우는 약 5.7배 정도 낮은 수치였다. 이는 바실러스가 효소를 생산할수 없는 상태인 포자 형태로 다량 존재했기 때문으로 판단되었다. 도 3은 배지의 두께에 따른 균의 성장 경향 및 효소의 활성 경향을 도식화하여 나타낸 바, 최적의 배지의 높이는 5∼10 cm임을 알 수 있다.
실시예 5. 발효 내부열이 효소 활성에 미치는 영향
실시예 4에서 가장 좋은 결과를 나타낸 5 cm의 배지두께를 적용하여 발효가 진행되는 동안 내부열의 상승을 막기 위해 2시간 단위로 배지를 뒤집어주는 실험을 진행하였다.
뒤집기 작업을 하지 않은 발효에서는 내부의 온도가 50℃까지 증가하였고 뒤집기의 경우는 거의 35℃정도로 유지되었다. 내성 포자수에 대한 생균수의 비율은 뒤집기 작업을 한 쪽이 발효에서 현저하게 증가하였으며 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성도 현저하게 증가하였다. 내부열 상승을 막기 위해 뒤집기 작업을 한 발효의 효소 활성을 그렇지 않은 실험구의 효소 활성 결과를 도 4에 나타내었다.
실시예 6. 수분함량 및 수분함량 감소율이 효소 활성에 미치는 영향
실시예 5까지에서 밝혀진 최적의 조건에 따라 고체발효를 하면서 투여되는 공기의 종류를 달리하여 발효를 진행하였다.
하나의 실험구는 수분이 포함된 공기를 투여하였고 다른 하나의 실험구는 건조한 공기를 투여하여 수분함량이 초기 상태를 유지하도록 하였다. 발효 72시간 후 건조한 공기를 투여한 실험구에서의 배지 수분 함량은 25∼30%가 되었고 수분이 포함된 공기를 투여한 실험구에서의 배지 수분 함량은 40% 이상을 유지하였다. 내성 포자수에 대한 생균수의 비율은 건조한 공기를 투여한 실험구에서 그렇지 않은 실험구에 비해 월등히 높은 비율로 나타났고 효소 활성 또한 높게 나타났다.
이때 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성은 각각 500,000koU/g,200,000kU/g로 나타나 표면발효에서와 유사한 효소 활성을 나타내었다. 또한 최종 수분함량이 15% 이하가 될 경우는 건조 속도가 너무 빨라 균이 충분히 자라지 못했으며 35% 이상일 경우는 곰팡이에 의한 오염이 심각한 것으로 나타났다. 투여되는 공기의 종류에 따른 균 성장 경향과 효소 활성 경향을 도 5에 나타내었다.
실시예 7. 생산된 효소의 열풍건조시 안정성
열풍건조시 효소의 열 안정성을 조사하였다.
상기의 결과들로 밝혀진 최적의 조건으로 발효를 실시한 후 최종산물을 각각 20, 30, 40, 50, 60, 70℃에서 72시간 동안 열풍건조하여 각 건조물의 전분분해효소 및 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
전분분해효소와 단백질분해효소의 경우는 모두 60℃까지 안정한 것으로 나타났으며 70℃이상에서는 전분분해효소의 경우는 약 77%, 단백질분해효소의 경우는 약 49%의 활성을 상실하는 것으로 나타났다. 도 6에 건조 온도별 생산된 효소의 잔존 활성을 도식화하여 나타내었다.
실시예 8. PS352의 고체배양을 통한 다양한 효소의 생산
최적의 고체발효 조건으로 생산된 효소제는 전분분해효소, 단백질분해효소 뿐만 아니라 펙틴분해효소, 글루칸분해효소, 자일란분해효소, 인산분해효소도 높은 활성으로 생산함을 확인하였다. 이때 얻은 펙틴분해효소, 글루칸분해효소, 자일란분해효소, 인산분해효소의 활성은 각각 15,600, 54,000, 7,800, 20,629koU/g였다.또한 상기의 모든 효소활성은 60℃ 이하의 열과 pH4∼pH10까지의 조건에서 안정한 것으로 나타났다. 표 5에 생산된 효소의 최적 온도, 최적 pH, 열안정성 및 pH 안정성에 대한 결과를 나타내었다.
본 발명에서 이용되는 프로바이오틱스(probiotics) 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)는 여러 병원성 미생물에 대해 강한 항균력이 있고, 다양한 사료 첨가용 항생제에 대해서도 내성을 지닌다. 또한 담즙산 및 인공 위액에 대해서도 내성을 지녔으며 다양한 범위의 pH 와 열에 대해서도 안정적으로 생존 가능하다. 상기 균주는 고체발효에서 전분분해효소, 단백질분해효소, 자일란분해효소, 펙틴분해효소, 글루칸분해효소와 인산분해효소를 높은 역가로 생산한다.
따라서, 본 발명에 의한 균주에 의하여 저렴하고 우수한 각종 효소 또는 사료첨가용 효소제제를 얻는 것이 가능하게 된다.
또한, 본 발명에 의한 고체발효 과정은 그 운영과 조절이 용이하기 때문에인건비 및 동력비를 절감할 수 있다. 나아가 사료용 재료로 사용되는 대두박과 말분을 그대로 배지로 사용함으로써 별도의 정제과정을 거치지 않고도 바로 동물 사료에 첨가될 수 있는 장점을 갖는다.

Claims (7)

  1. 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352) KFCC 11179 균주를 배양하여 그 배양물로부터복합효소액을제조하는 방법.
  2. 제 1 항에의한 복합효소액으로부터전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 자일란분해효소 (xylanase), 펙틴분해효소(pectinase), 글루칸분해효소(β-glucanase) 및 인산분해효소(phytase)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 효소를분리제조하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 균주를,두께 5∼10cm, 초기 수분함량 40∼50%인 대두박과 말분을 주재료로 하는 혼합배지에 접종하여 25 ~ 35℃에서 60 ~ 84시간 배양하면서 발효 중 배지 중심부의 온도가 32 ~ 38℃, 배지의 최종 수분함량이 20∼30%로 되도록 조절하면서 0.6 ~ 1.0 vvm의 건조 공기를 배지에공급하면서 배양하는 것을특징으로 하는,복합효소액을제조하는 방법.
  5. 삭제
  6. 바실러스 메가테리움 PS352( Bacillus megaterium PS352)(KFCC-11179) 균주를,두께 5∼10cm, 초기 수분함량 40∼50%인 대두박과 말분을 주재료로 하는 혼합배지에 25 ~ 35℃에서 60 ~ 84시간 배양하면서 발효 중 배지 중심부의 온도가 32 ~ 38℃, 배지의 최종 수분함량이 20∼30%로 되도록 조절하면서 0.6 ~ 1.0 vvm의 건조 공기를 배지에 공급하여 고체배양한 최종 배양물을 동물용 사료 또는 사료 첨가제로 사용하는 방법.
  7. 삭제
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