KR101793498B1 - 유산균 균주, 바실러스 속 균주 및 효모 균주를 이용한 고상발효에 의한 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법 및 그에 따른 사료 첨가용 다기능 생균제 - Google Patents

유산균 균주, 바실러스 속 균주 및 효모 균주를 이용한 고상발효에 의한 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법 및 그에 따른 사료 첨가용 다기능 생균제 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주를 스타터로 이용한 고상배양 시스템을 통해 항균 활성 및 효소 활성을 가지는 사료첨가용 다기능 생균제의 최적의 고상배지 및 배양조건을 개발하였다. 따라서, 본 발명은 상기 균주들을 혼합배양할 경우 간섭으로 인해 증식이 방해되는 점을 극복한 방법으로써, 균주 각각을 배양한 후 혼합하여 사용할 경우 발생하는 시간 및 비용의 절감효과가 있어 사료 산업을 포함한 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

유산균 균주, 바실러스 속 균주 및 효모 균주를 이용한 고상발효에 의한 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법 및 그에 따른 사료 첨가용 다기능 생균제{Method for producing multi-functional probiotics for feed additive having antibacterial activity and enzyme activity through solid state fermentation using lactic acid bacteria, Bacillus sp. and yeast strain and multi-functional probiotics for feed additive thereof}
본 발명은 고체배양 배지에 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주의 혼합물을 첨가하고 고상 발효시켜 균주의 생체량을 증가시키는 단계를 포함하는 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 사료 첨가용 다기능 생균제에 관한 것이다.
종래의 사료 첨가제는 가축의 증체율 향상, 사료의 효율성 증대 및 질병 예방 등을 목적으로 합성화학 물질인 항생제 또는 항균제를 함유하도록 하여 제조되어 왔다. 그러나, 이러한 사료 첨가제를 가축사료에 배합하여 사용하는 것은 가축에 대한 약물 남용이며, 이로 인해 질병에 대한 가축의 면역력이 저하될 뿐만 아니라 항생제에 대한 내성이 증가됨으로써 보다 강한 항생제를 요구하게 되는 결과를 초래하게 된다. 또한, 항생제 등의 약물은 가축의 체내에 잔류되기 때문에 이를 섭취하는 사람들의 건강도 위협을 받을 수 있다. 따라서, 동물산업에서 소비자 및 생산자 모두를 위해 가축 및 인체에 무해한 항생제 및 항균제를 대신할 수 있는 안정성이 확보된 후보 물질의 연구 개발 및 효능 연구가 이루어지고 있다.
일반적인 생균제 발효 방법에는 고상발효(Solid State Fermentations; SSF) 및 액상발효(Liquid State Fermentations; LSF)가 있으며, 발효 형태에 따라 배양시스템 및 배양조건에 차이가 있다. 고상발효 공정은 수분함량, 수분활성도, 온도, pH, 산소 수준, 영양소와 제품의 농도와 같은 환경적 요인에 의해 미생물 생장과 제품형성에 중요한 영향을 미친다. 일반적으로 고상발효 과정에서 수분함량은 30-75%로 변이가 넓은 편이며, 최적의 수분함량은 효소, 유기산 등의 대사산물 생산을 최대로 한다. 수분활성도는 바이오매스의 발달, 대사적 반응, 물질 전달과정 등에 영향을 미치며, 물질의 물리적 구조와 화학적 성질에 따라 그 활성도가 좌우된다. 또한, 고상발효 과정에서 온도가 상승하는 것은 포자형성과 생장, 대사산물의 형성에 영향을 준다. 고상발효는 코오지(일본), 라기(인도네시아)와 같은 전통 발효스타터를 이용해 효소, 유기산, 생물농약, 바이오연료, 풍미 등과 같은 가치를 높인 제품들의 생산뿐만 아니라 생물학적 교정(bioremediation)과 생물학적 분해(biodegradation)와 같은 유해물질의 분해, 농산폐기물의 분해 등 다양한 분야에 이용되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1201337호에는 '신규한 락토바실러스속 유산균 복합 균주를 포함하는 사료첨가제'에 대해 개시되어 있으나, 본 발명의 유산균 균주, 바실러스 속 균주 및 효모 균주를 이용한 고상발효에 의한 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법 및 그에 따른 사료 첨가용 다기능 생균제에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주로 이루어진 사료첨가용 다기능 생균제의 효과적인 증체량 증가 시스템을 구축하고자 상기 유산균 균주 3종, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 2종 및 효모(yeast) 균주 2종의 총 7종의 균주를 동량으로 고체배양 배지에 혼합 접종하여 고상배양을 실시하였다. 그 결과, 액체배양의 경우보다 균체량이 현저히 증가하는 것을 확인하였고, 특히, 균주 혼합배양 결과 유해균에 대한 항균활성 및 효소 분비활성이 증가되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 균주를 혼합배양할 경우 간섭으로 인해 증식이 방해되는 점을 극복한 방법으로써, 균주 각각을 배양한 후 혼합하여 사용할 경우 발생하는 시간 및 비용의 절감효과가 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고체배양 배지에 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주를 첨가하고 고상 발효시켜 생체량을 증가시키는 단계를 포함하는 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 다기능 생균제를 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명에서는 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주를 스타터로 이용한 고상배양 시스템을 통해 항균 활성 및 효소 활성을 가지는 사료첨가용 다기능 생균제의 최적의 고상배지 및 배양조건을 개발하였다. 따라서, 본 발명은 상기 균주들을 혼합배양할 경우 간섭으로 인해 증식이 방해되는 점을 극복한 방법으로써, 균주 각각을 배양한 후 혼합하여 사용할 경우 발생하는 시간 및 비용의 절감효과가 있어 사료 산업을 포함한 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 곡물을 원료로 한 고체 배지에서 유산균 균주 단독 배양에 따른 세포수(A) 및 pH(B) 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 유산균 균주의 배지 종류에 따른 고상배양 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 유산균 균주의 Media-3 배지에 따른 고상배양 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 곡물을 원료로 한 고체 배지에서 효모 균주 단독 배양에 따른 세포수(A) 및 pH 변화(B)를 나타낸 것이다.
도 5는 효모 균주의 배지 종류에 따른 고상배양 결과를 나타낸 것이다. (A)는 A media; (B)는 B media; (C)는 C media; (D)는 D media이다.
도 6은 곡물을 원료로 한 고체 배지에서 바실러스 속 균주 단독 배양에 따른 세포수(A) 및 포자수(B)를 나타낸 것이다.
도 7은 곡물을 원료로 한 고체 배지에서 바실러스 속 균주 단독 배양에 따른 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 동시 혼합배양에 따른 세포수(A) 및 pH 변화(B)를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고체배양 배지에 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주를 첨가하고 고상 발효시켜 생체량을 증가시키는 단계를 포함하는 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 효모(yeast) 균주는 특정한 종에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 유산균 균주는 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)이며, 바실러스 속 균주는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)이며, 효모 균주는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 총 7종의 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 7종의 균주는 고체배양 배지 g당 0.5~1.5×107 cfu로 각각 첨가된 것일 수 있고, 바람직하게는 1×107 cfu로 각각 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 항균활성은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)에 대해 항균활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase) 또는 프로테아제(protease)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 고체배양 배지는 대두박, 말분, 미강 및 인산염으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 고상발효는 (a) 고체배양 배지에 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 고체배양 배지 g당 0.5×107~1.5×107cfu로 각각을 첨가하여 수분 35~45% 및 25~35℃에서 1~4일간 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양물을 45~55℃의 온도로 건조하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 항균활성 및 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 다기능 생균제를 포함하는 사료를 제공한다. 상기 사료는 사료 전체 중량 기준으로 0.15~0.3%의 사료 첨가용 다기능 생균제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 유산균( latic acid bacteria ) 균주, 효모( yeast ) 균주 및 바실러 스 속( Bacillus sp .) 균주를 이용한 고상발효 배양
가. 유산균 균주 단독 배양
본 발명의 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici KNU1101, 이하 PA라 칭함), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum NLR1201, 이하 LP라 칭함) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus SUN001, 이하 LA라 칭함) 균주의 발효능을 조사하기 위해, 5%의 인산염이 첨가된 대두박 기초배지(수분 40%)에 PA, LP 및 LA 유산균 균주 단독 및 복합균주를 스타터로 사용하여 32℃에서 4일간 고상배양하였다. 그 결과, 도 1 및 표 1에 개시된 바와 같이 PA 단독 배양보다 PA/LA/LP 복합균주를 스터터로 사용한 경우가 2일 배양 시 4.0×109 cfu/g로 가장 배양이 높은 것으로 나타났으며, LA/LP 처리구가 배양이 저조한 것으로 나타났다. pH의 변화는 균주 간에 큰 차이를 보이지 않고 일정하게 6.5에서 4.5로 감소하는 경향을 보였다.
또한, 유산균 고상배양 배지 선발을 위하여, 하기 표 2에 개시된 바와 같이 실험실에서 약 5kg의 대두박, 밀기울, 탈지강 및 인산염으로 구성된 3가지 고상배지에 PA, LA 및 LP 유산균 균주를 스타터로 5% 첨가하여 32℃에서 5일간 고상배양한 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 대두박 단독 배지보다 대두박, 밀기울, 탈지강 및 염이 혼합된 배지가 배양 2일째 2.7×109cfu/g으로 제일 좋은 결과를 얻었다. 이와 같은 결과를 기반으로 좋은 성적을 보인 복합유산균(PA/LA/LP)과 Media-3 배지를 사용하여 1톤 규모의 고상배양한 결과는 도 3과 같다. 실험실 스케일(3.0×109cfu/g)과 비교하면 2일 배양 후 유산균 수는 3.0×109cfu/g으로 큰 차이를 보이지 않았으나, 건조 후 2.1×108cfu/g으로 실험실 2.0×109cfu/g과 많은 차이를 보였다. 이는 규모의 차이로서(실험실 5kg : 현장 1,000kg), 50℃의 열풍으로 약 2일간 건조하였기 때문에 열을 많이 받아 유산균 특성상 사멸이 큰 것으로 판단된다.
곡물을 원료로 한 고체 배지에서 유산균 균주 단독 배양에 따른 세포수 및 pH 변화
균주 0day 1day 2day 3day 4day
세포수(cfu/g) LA/LP 1.0×107 5.0×108 7.0×108 5.0×108 3.0×108
PA 1.0×107 7.0×108 1.0×109 3.7×109 1.0×109
PA/LA/LP 1.0×107 1.0×109 4.0×109 3.4×109 2.3×109
pH pA 6.28 5.71 5.12 4.62 4.39
LA/LP 6.26 5.33 5.11 4.88 4.72
PA/LA/LP 6.24 5.34 5.06 4.78 4.58
유산균 고상배양 배지 선발을 위한 배지 조성(중량 %)
배지 대두박 밀기울 탈지강 염
Media-1 95 - - 5
Media-2 45 - 45 5
Media-3 35 30 30 5
나. 효모 균주 단독 배양
본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus SUN001, 이하 KM이라 칭함)의 발효능을 조사하기 위해, 5%의 인산염이 첨가된 대두박 기초배지(수분 40%)에 유전자은행에서 분양받은 2개의 효모 균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae , 이하 Y1, Y2라 칭함) 단독 또는 복합균주를 스타터로 사용하여 고상배양하였다. 그 결과, 표 3 및 도 4에 개시된 바와 같이 단독(KM) 배양보다 KM/Y1/Y2 복합균주를 스터터로 사용한 경우가 48시간 배양 시 2.0×108 cfu/g으로 배양이 높은 것으로 나타났으며, 나머지 처리구는 108 cfu/g으로 비슷한 결과를 보였다. pH의 변화는 균주 간에 큰 차이를 보이지 않고 일정하게 7.0에서 6.0 근처로 감소하는 경향을 보였다.
또한, 효모 고상배양 배지 선발을 위하여, 하기 표 4와 같이 대두박, 말분, 미강 및 인산염으로 구성된 4가지 고상배지에 단독(KM, Y1 및 Y2) 및 복합(Mix) 균주를 스타터로 각각 5%씩 첨가하였으며, 스타터 첨가량은 1.0×107cfu/g이 되도록 조정하였으며, 고상배지의 수분은 40%, 배양온도는 32℃에서 배양하였다. 그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 4개의 배지조성에 따른 고상배양 결과에서도 모든 배지에서 단독 균주보다 복합균주(KM/Y1)를 사용한 것이 가장 좋은 결과를 얻었으며, 배지조성에 따른 고상배양 결과는 대두박, 말분, 미강 및 인산염이 혼합된 배지가 배양 3일째 8.1×108cfu/g으로 제일 좋은 결과를 얻었다. 이와 같은 결과를 볼 때 효모는 복합효모(KM/Y1)와 고상배지(Media-D)를 사용한 것이 8.1×108cfu/g 으로 가장 좋은 성적을 얻었다.
곡물을 원료로 한 고체 배지에서 효모 균주 단독 배양에 따른 세포수 및 pH 변화
균주 0hr 24hr 48hr 72hr
세포수
(cfu/g) 		KM 1.0×107 7.0×107 9.0×107 6.0×107
Y1 1.0×107 3.4×107 1.0×108 6.0×107
Y2 1.0×107 4.9×107 4.3×107 8.0×107
MIX(KM/Y1) 1.0×107 7.0×107 2.0×108 2.7×108
pH KM 6.94 6.11 5.98 5.98
Y1 6.94 5.97 6.18 5.99
Y2 6.94 6.12 5.92 6.00
MIX(KM/Y1) 6.94 5.99 5.91 5.96
효모 고상배양 배지 선발을 위한 배지 조성(중량 %)
구분 배지 A 배지 B 배지 C 배지 D
대두박 95 45 45 50
말분 - 50 - 25
미강 - - 50 20
인산염 5 5 5 5
합계 100 100 100 100
다. 바실러스 속 균주 단독
본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SUN001(이하 BS1이라 칭함) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SUN001(이하 BS2라 칭함) 균주의 발효능을 조사하기 위해, 5%의 인산염이 첨가된 대두박 기초배지에 단독(BS1 및 BS2) 또는 복합균주(BS1/BS2)를 스타터로 사용하여 고상배양 및 50℃ 이하에서 2일간 건조하였으며, 바실러스의 경우는 포자형성도 중요한 부분이기에 세포(cell)와 포자(spore)도 함께 조사하였으며, 포자(spore)는 시료(sample)를 80℃에서 30분간 열처리 후 카운트(count)를 실시하였다. 그 결과, 표 5 및 도 6 에 개시된 바와 같이 단독 배양(BS1 및 BS2) 보다 복합균주(mix)를 스터터로 사용한 경우가 건조 2일 후에도 4.0×109 cfu/g으로 가장 배양이 높은 것으로 나타났으며, BS1 및 BS2 처리구간에 큰 차이가 없었다. pH의 변화는 균주 간에 큰 차이를 보이지 않고 건조 시 pH 7.0 정도로 증가하는 경향을 보였다(도 7).
선발된 바실러스 속 균주(BS1 및 BS2)의 배지 선발을 위해 실험실에서 약 5kg의 대두박, 대두박+미강+등외밀가루 및 대두박+미강+등외밀가루+염으로 구성된 3가지 고상배지(수분 40%)에 BS1/BS2 혼합균주를 스타터로 5% 첨가하여 32℃에서 2일간 고상배양한 결과, 하기 표 6에 개시된 바와 같이 대두박 단독배지보다 혼합배지(대두박+미강+등외밀가루+염)에서 배양 2일째 세포(cell) 3.3x108cfu/g 및 포자(spore) 5.5x108cfu/g으로 제일 좋은 결과를 얻었다.
곡물을 원료로 한 고체 배지에서 바실러스 속 균주 단독 배양에 따른 세포수(cfu/g), 포자수(cfu/g) 및 pH 변화
균주 0day 1day 2day 건조1day 건조2day
BS1-세포수 1.0×107 8.0×107 2.0×108 3.0×108 2.1×108
BS1-포자수 1.0×107 5.0×107 1.0×108 1.0×108 1.0×108
BS1-pH 6.70 6.74 6.71 6.95 7.00
BS2-세포수 1.0×107 5.0×107 3.0×108 2.0×108 2.0×108
BS2-포자수 1.0×107 1.0×108 2.0×108 1.6×108 6.0×107
BS2-pH 6.74 6.80 6.75 6.94 7.14
mix(BS1/BS2)-세포수 1.0×107 3.4×108 5.1×108 5.0×108 4.0×108
mix(BS1/BS2)-포자수 1.0×107 2.0×108 2.0×108 1.6×108 3.0×108
mix(BS1/BS2)-pH 6.77 6.8 6.8 6.9 6.9
바실러스 속 균주의 고상배양 배지에 따른 세포수(cfu/g) 및 포자수(cfu/g)
배양시작 1 day 2 day
대두박(세포수) 1.0×107 5.0×107 7.1×107
대두박(포자수) 1.0×107 3.3×107 5.2×107
대두박+미강+말분(세포수) 1.0×107 5.4×107 9.1×107
대두박+미강+말분(포자수) 1.0×107 3.4×107 2.1×108
대두박+미강+말분+염(세포수) 1.0×107 2.0×108 3.3×108
대두박+미강+말분+염(포자수) 1.0×107 2.5×108 5.5×108
라. 유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 동시 고체 혼합배양
유산균 균주는 3종인 PA/LP/LA(P. acidilactici KNU001, L. plantarum NLRI201 및 L. acidophlius SUN001), 바실러스 속 균주는 2종인 BS1/BS2(Bacillus subtilis SUN001 및 Bacillus amyloliquefaciens SUN002), 효모 균주는 2종인 KM/Y1(Kluyveromyces marxianus SUN001, Saccharomyces cerevisiae Y1)를 LBY(Lactobacillus, Bacillus, Yeast) 배양을 위한 스타터로 사용하였다. 실험실 스케일에서 두 균주를 혼합 균주로 사용하여 최적의 배지를 선발하기 위해 대두박(32%), 말분(31%), 미강(32%) 및 인산염(5%)을 혼합한 배지(5kg)를 사용하고, 수분 40% 및 32℃에서 간헐적으로 공기를 주입하면서 2일간 고상배양한 결과, 도 8 및 표 7에 개시된 바와 같이 LY 혼합균주로 고상배양 시 유산균(Lab)의 경우, 2일 배양 시 1.1×109 cfu/g으로 유산균 단독 배양할 때와 큰 차이 없이 배양되었으며, 효모의 경우, 2일째에 3.0×108 cfu/g로 효모 단독배양시와 거의 유사한 결과를 얻었다. 바실러스의 경우도 2일 배양 시 5.5×108 cfu/g으로 바실러스 단독 배양할 때와 큰 차이 없이 배양되는 것을 확인하였다. pH의 변화는 균주 간에 큰 차이를 보이지 않고 일정하게 6.5에서 4.5로 감소하는 경향을 보였다.
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 동시 고체 혼합배양에 따른 세포수(cfu/g) 및 포자수(cfu/g)
구분 0 hr 24 hr 48 hr 건조24hr 건조48hr
유산균(Lab) 1.0×107 3.5×108 1.1×109 5.0×108 2.0×108
효모(Y) 1.0×107 6.3×107 3.0×108 9.5×107 7.8×107
바실러스(BS)-세포수 1.0×107 7.7×107 5.5×108 3.1×108 9.0×107
바실러스(BS)-포자수 1.0×107 4.1×107 1.1×108 1.1×108 1.1×108
마. 유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 혼합배양후 냉동건조 공정
본 발명의 복합균주(LBY)를 스타터로 활용하여 냉동건조를 통한 고농도 생균제를 개발하고자 하였으며, 다음의 조건에 따라 냉동건조 공정을 실시하였다(표 8). 자 발효조(Jar fermenter)에서 LBY(유산균+효모, 바실러스) 혼합균주를 1ℓ를 32℃에서 공기를 0.5vvm 주입하면서 24시간 배양하였다. 그 결과, 표 9에 개시된 바와 같이 LBY 혼합균주로 24시간 배양한 후 유산균(PA/LA/LP)은 1.5x108 cfu/㎖, 바실러스(BS1/BS2)는 1.0x108 cfu/㎖, 효모(KM/Y1)는 5.5x107 cfu/㎖을 얻었다. 이를 1.0L로 환산하면 LBY 배양체 각각 유산균은 1.5x1011 cfu/1ℓ, 바실러스는 1.0x1011cfu/1ℓ, 효모는 5.5x107cfu/1ℓ을 얻었다.
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 동시 액체 혼합배양 배지 조성
배지조성 Yeast Extract 5.0g, Soypeptone 5.0g, Glucose 10.0g, K2HPO4 1.0g, KH2PO4 1.0g, (NH4)2SO4 5.0g, NaCl 2.0g, Distilled Water 1L
배양기 Jar Fermenter (KF-7L, Kobiotech, Korea)
배양 1.0L, 32℃ in 48hrs, 100rpm, air injection 0.5vvm.
농축 centrifuge(Mega 21R, Hanil Scientific), 4℃ at 8000rpm. 10 min.
동결건조 C.P(냉동보호제) ; Skim milk powder, MSG, Vit. C, Deep freezer at -75℃ Freeze dryer ; OPERON DFC-400CE, Operon Co., Korea
유산균 균주(LAB), 효모 균주(Y) 및 바실러스 속 균주(BS)의 동시 액체 혼합배양에 따른 세포수
균주 cell culture
(cfu/ml)		 total
volume
(cfu/1L)
LAB 1.5x108 1.5x1011
BS 1.0x108 1.0x1011
Y 5.5x107 5.5x1010
실시예 2. 유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 혼합배양에서 얻은 건조 배양체의 효소 활성 및 항균 활성 분석
가. 최적 배지 선발
본 발명의 유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주 혼합배양에 쓰일 배지들을 제조 후 멸균하여 유산균(LAB) 및 효모(Yeast) 균주는 배양을 시작할 때 동시 접종을 하였고, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 12시간이 지난 후에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 pH 측정 및 CFU를 진행하였다. 실험군에 쓰인 유산균(LAB) 균주는 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 효모(Yeast) 균주는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis Ba4), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens BS) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens NLH)를 사용하였다. 유산균 균주 및 효모 균주를 각각 1.5㎖씩 동시 접종한 후 12시간 후에 바실러스 속 균주를 각각 15㎖씩 접종하는 방법으로 접종 후 24시간 동안 배양한 후 멸균된 펩톤 워터(Peptone water)로 1.0×106~108로 희석하여 유산균 균주는 BCP 배지, 바실러스 속 균주는 NA 배지, 효모 균주는 YPD 배지에 도말한 후 24시간 동안 배양하여 cfu를 측정한 결과, 하기 표 10 및 표 11에 개시된 바와 같이 5가지 배지 중 4번 배지를 하기 효소활성 및 항균활성 측정을 위한 배지로 사용하였다.
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 동시 혼합배양을 위한 배지 조성
No. 원료명 1번 배지 2번 배지 3번 배지 4번 배지 5번 배지
1 Yeast Extract 4.0g 4.0g 3.0g 3.0g 3.0g
2 Soypeptone 4.0g 5.0g 3.0g 10g 10g
3 Glucose 8.0g 7.0g 8.0g 10g 10g
4 K2HPO4 1.0g 0.6g 0.4g 0.14g 2.0g
5 KH2PO4 0.2g 0.6g 2.0g 1g 0.5g
6 (NH4)2SO4 0.8g 1.2g 0.6g 0.6g 0.6g
7 NaCl 2.0g 1.6g 3.0g 3.0g 3.0g
8 MgSO4 - - - 0.1g 0.1g
총(g/ℓ) 20 20 20 20 20
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주의 동시 혼합배양을 위한 배지별 CFU 측정
배지 CFU(cfu/㎖)
유산균(LAB) 바실러스(Bacillus) 효모(Yeast)
P.A Ba4 BS NLH K.M
1번 2.9×108 <106 <106 <107 4.7×107
2번 3.5×107 <106 <106 <107 5.7×107
3번 1.0×108 <106 <106 <107 7.3×107
4번 2.8×108 7.7×107 2.0×106 1.0×108 6.7×107
5번 3.1×107 6.7×107 1.0×106 1.1×107 4.8×107
나. 효소 활성 분석
알파-아밀라아제(α-amylase) 활성은 원심 분리(14,000rpm, 10min.)한 조효소액(Sample) 1㎖ 및 1% 전분용액 1㎖을 테스트 튜브에 넣어 항온수조에서 40℃에서 30분간 반응시켰다. 대조구의 경우, 0.02M phosphate 완충액 1㎖ + 1% 전분용액 1㎖을 테스트 튜브에 넣어 항온수조에서 40℃에서 30분간 반응시켰다. 그런 다음, 1M 아세트산(acetic acid) 10㎖을 넣어 반응을 정지시킨 뒤 1/3000N 요오드 용액 1㎖을 넣어 정색반응이 일어나면 660nm에서 흡광도를 측정하였다(사료공정서. 2004. α-Amylase, 전분당화력시험법). 단백질 분해효소(protease) 활성측정은 조효소액(Sample) 50㎕를 15㎖ 테스트 튜브에 넣고 40℃에서 5분간 정치한 후 40℃로 미리 데워진 기질 용액(0.6% Hammersten casein) 450㎕를 첨가하였다. 그런 다음, 40℃에서 60분간 정치하여 10% TCA 용액 500㎕를 첨가해서 효소 반응을 중지시켜 원심분리(10,000rpm에서 10분)한 후 상등액을 취하여 1.5㎖ 튜브에 넣고 0.55M NaCO 용액 350㎕를 첨가하여 혼합하였다. 15분간 상온에서 방치한 다음, 1N-폴린 시오콜테어스 페놀(folin ciocalteus phenol) 용액 200㎕를 첨가하여 상온에서 30분간 방치한 후 660nm ELISA 리더에서 측정하였다. 효소활성 단위는 37℃에서 효소액 1㎖을 1분에 1μg의 타이로신(tyrosine)을 유리시키는 것을 1 유닛(unit)으로 하였다(사료공정서. 2004. Acid Protease, 단백질소화력시험법 제2법).
그 결과, 하기 표 12 및 13에 개시된 바와 같이 유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 균주의 단독배양 및 이들의 혼합배양에서 알파-아밀라아제(α-amylase) 및 단백질 분해효소(protease) 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주 혼합배양에서 얻은 건조 배양체의 알파-아밀라아제 활성 측정
균주 이름 unit/ml
페디오코커스 악시딜락티시 66.7
클루이베로마이세스 마르시아누스 72.4
바실러스 서틸리스 Ba4 72.4
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 BS 71.6
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 NLH 72.4
*Co Ba4 72.4
*Co BS 72.4
*Co NLH 72.4
*Co Ba4: 페디오코커스 악시딜락티시(L) + 클루이베로마이세스 마르시아누스(Y) + 바실러스 서틸리스 Ba4, *Co BS: L + Y + 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 BS, *Co NLH: L + Y + 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 NLH
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주 혼합배양에서 얻은 건조 배양체의 단백질 분해효소 활성 측정
균주 이름 unit/ml
페디오코커스 악시딜락티시 1558.72
클루이베로마이세스 마르시아누스 968.94
바실러스 서틸리스 Ba4 1193.62
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 BS 940.85
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 NLH 1011.06
*Co Ba4 870.64
*Co BS 786.38
*Co NLH 716.17
*Co Ba4: 페디오코커스 악시딜락티시(L) + 클루이베로마이세스 마르시아누스(Y) + 바실러스 서틸리스 Ba4, *Co BS: L + Y + 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 BS, *Co NLH: L + Y + 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 NLH
다. 항균 활성 분석
항균 활성 분석은 페이퍼 디스크 확산법(Paper disc diffusion assay)으로 진행하였으며, 5종의 시험균주(Staphylococcus aureus KCCM 11335, Bacillus cereus ATCC 11778, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Salmonella enteritidis, Escherichia coli KCCM 12181)에 대해 항균 활성을 진행하였다. 양성 대조군으로 쓰인 항생제로는 BD에서 제조한 항생제 페이퍼 디스크(paper disc, Neomycin 및 Streptomycin)를 사용했으며, 음성 대조군으로는 멸균된 펩톤워터(Peptone water)를 사용하였다. L + Y + Ba4(Co Ba4), L + Y + BS(Co BS) 및 L + Y + NL H(Co NLH)의 경우, 24시간 경과된 공동 배양액을 취하여 페이퍼 디스크(paper disc, 6mm)에 10㎕를 흡수시킨 후 5종의 유해 세균(Staphylococcus aureus KCCM 11335, Bacillus cereus ATCC 11778, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Salmonella enteritidis, Escherichia coli KCCM 12181)에 대해 항균테스트를 진행하였다. 그 결과, 표 14에 개시된 바와 같이 본 발명의 유산균, 바실러스 속 및 효모 균주는 각각 5가지의 유해 세균에 대해 항균 활성을 나타내었으며, 특히 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 및 대장균(Escherichia coli)에 복합 균주(유산균/바실러스 속/효모)를 처리하였을 때 단독 균주(유산균, 바실러스 속 및 효모)보다 더 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
유산균 균주, 효모 균주 및 바실러스 속 균주 혼합배양에서 얻은 건조 배양체의 항균 활성 측정
균주 억제환(mm)
PC NC *P.A *Ba4 *BS *NLH *K.M *Co Ba4 *Co BS *Co NLH
*N *S 펩톤 워터
스타필로코커스 아우레우스 13 19 - 20 0 13 15 0 15 14 16
바실러스
세레우스		 15 23 - 19 0 12 12 0 14 14 15
리스테리아 모노사이토제니스 14 19 7 0 0 0 10 9 10 10
살모넬라 엔테리티디스 19 21 - 17 0 17 13 0 10 10 13
대장균 7 14 - 12 0 0 0 0 11 11 12
PC(Positive Control): *N: 네오마이신, *S: 스트렙토마이신, NC(Negative Control): PW(Peptone Water), *P.A: 페디오코커스 악시딜락티시 단독, *Ba4: 바실러스 서틸리스 Ba4 단독, *BS: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 BS 단독, *NLH: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 NLH 단독, *K.M: 클루이베로마이세스 마르시아누스, Co Ba4: 페디오코커스 악시딜락티시 + 클루이베로마이세스 마르시아누스 + 바실러스 서틸리스 Ba4, *Co BS: 페디오코커스 악시딜락티시 + 클루이베로마이세스 마르시아누스 + 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 BS, *Co NLH: 페디오코커스 악시딜락티시 + 클루이베로마이세스 마르시아누스 + 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 NLH

Claims (10)

  1. (a) 대두박, 말분, 미강 및 인산염으로 이루어진 고체배양 배지에 페디오코커스 악시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 상기 고체배양 배지 g당 0.5~1.5×107 cfu로 각각을 첨가하여 수분 35~45% 및 25~35℃에서 1~4일간 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 배양물을 45~55℃의 온도로 건조하는 단계를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균활성 및 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)의 효소활성을 가지는 사료 첨가용 다기능 생균제의 제조방법.
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