KR102350434B1

KR102350434B1 - 축산 악취 저감용 조성물

Info

Publication number: KR102350434B1
Application number: KR1020190137839A
Authority: KR
Inventors: 이찬호; 강정선; 조원탁; 조경진; 정재학
Original assignee: (주)진바이오텍
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2022-01-13
Also published as: KR20210052783A

Abstract

본 발명은 축사 악취 저감에 효과적인 신규 미생물 및 이를 포함하는 고상발표 생균제에 관한 것이다. 본 발명은 축사에 살포하는 식으로 사용할 수 있을 뿐 아니라, 사료첨가제로 가축에게 섭취시켜 악취를 근원적으로 저감시킬 수도 있다는 특징이 있다.

Description

축산 악취 저감용 조성물 {LIVESTOCK DEODORANT COMPOSITION}

본 발명은 가축의 생산성 향상에 도움이 되면서 동시에 축산 악취 발생을 감소시킬 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 신규 미생물은 사료 등의 조성물로 구현할 수 있다.

축산악취에 대한 민원은 지속적인 증가추세에 있다. 축산악취 피해민원에 대한 조사결과에 따르면, 소규모 영세축사나 축사 인접 지역에 민원이 집중되는 것으로 나타났으며, 이중 돈사악취로 인한 민원 발생수가 가장 많은 것으로 집계되었다.

정부는 축산악취의 저감을 위해 축사내부 미생물 분사, 안개분무시설 설치, 악취탈취제 보급, 축사주변 탈취제 살포, 퇴비공장 차폐시설, 분뇨의 하천 유입을 막기 위한 조은천 준설 등에 예산을 편성하여 운영하고 있다.

특히 유용미생물의 가치가 보고되면서 정부는 유용미생물을 활용한 다양한 방안을 촉구하고 있다. 유용미생물이란 광합성균, 유산균, 효모균 등의 다목적 미생물로서, 해로운 미생물의 증식을 억제하거나 토양환경을 좋게 하는 역할을 하는 미생물을 말한다. 특정 유용미생물을 축사에 분사했을 때 축사악취 및 유해가스의 제거에 도움이 된다는 실험보고서가 나오면서, 정부는 관련 유용미생물을 배양하고 무료로 배급하고도 있다.

유용미생물의 일예로, 대한민국 공개특허공보 제 10-2019-0067517호에서는 오시아노바실러스 계열의 균주가 축사에 분사하면 축산분뇨에서 발생하는 악취를 감소시킬 수 있다고 소개한다.

그러나 종래의 방법으로는 여전히 축산악취의 저감에 한계가 있는 실정이다.

대한민국 공개특허공보 제 10-2019-0067517호

종래는 보통 유용미생물을 축사에 분사하는 방법에 주목했다. 그러나 본 발명의 신규 미생물은 축사에 분사하는 방법으로 사용할 수 있을 뿐 아니라, 축산사료로 공급하여, 배출되는 축사의 분뇨 등의 악취를 원천적으로 저감할 수 있다는 특징이 있다.

본 발명의 구성은 다음과 같다.

1. 축사 분내 악취저감능을 가진 바실러스 아미로리쿠에파시엔스 균주(KCCM12354P). 일 구현예로는 가축이 섭취하여 가축의 분내의 악취를 저감할 수 있는 기능을 가진 바실러스 아미로리쿠에파시엔스 균주(KCCM12354P).

2. 축사 분내 악취저감능을 가진 락토바실러스 브레비스 균주(KCCM12355P). 일 구현예로는 가축이 섭취하여 가축의 분내의 악취를 저감할 수 있는 기능을 가진 락토바실러스 브레비스 균주(KCCM12355P).

3. 상기 1 또는 2 에 따른 균주를 포함하는 사료첨가제용 고상발효 생균제.

4. 상기 3 에 있어서, 소맥피 및 대두박을 포함하는 배지조성을 포함하는 것을 특징으로 하는 고상발효 생균제.

5. 상기 3 또는 4 에 있어서, 배지조성 기준으로 균주를 3% 접종하는 것을 특징으로 하는 고상발효 생균제.

본 발명에 따른 신규 미생물은 종래처럼 축사에 분사하여 배출된 분뇨 등의 악취를 저감시킬 수 있을 뿐 아니라, 축산사료로 공급하여 배출되는 분뇨 등의 악취를 저감할 수도 있다. 즉 본 발명에 따른 신규 미생물은 축산 악취 저감용 사료첨가제로 이용될 수 있다는 특징이 있다.

본 발명에 따른 신규 미생물은 악취를 유발하는 것으로 알려진 Streptococcus anginosus 및 Clostridium perfringens 균주에 대해 항균활성을 갖는다.

본 발명에 따른 신규 미생물은 황 관련 유전자를 보유하고 있으며, 악취 저감에 효과가 있다.

본 발명에 따른 신규 미생물은 가축 장내 pH 에 안정성을 갖추고 있어 사료첨가제로 활용이 가능하다.

본 발명에 따른 신규 미생물을 포함하는 사료첨가제는 가축의 생산성은 저하시키지 않고, 또한 섭취하더라도 부작용 등 가축 내 안전성에 영향을 미치지 않으면서, 악취를 저감할 수 있다. 참고로 본 발명과 같이 안전성이 확인되지 않은 균주는 축사에 분사하는 식으로 사용할 수는 있어도, 사료첨가제로의 사용은 제한된다.

도 1 은 스킴밀크를 이용한 G10 균주의 유기물 분해능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 2 는 M10 균주의 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 클로스트리디움(Clostridium)에 대한 항균활성평가를 나타낸 것이다.
도 3 은 가스 측정 검지관이다.
도 4 는 가스 측정 검지관 및 기체측정기이다.
도 5 는 G10 균주의 pH 조건에 따른 pH 안정성 평가 결과를 나타낸 것이다. 좌측부터 우측으로 순서대로 pH 5, pH 7, pH 9 의 결과이다.
도 6 은 M10 균주의 pH 조건에 따른 pH 안정성 평가 결과를 나타낸 것이다. 좌측부터 우측으로 순서대로 pH 3, pH 5, pH 7, pH 9 의 결과이다.
도 7 은 사양시험에 따른 분내 악취물질 결과를 나타낸 것이다. 분으로부터 발생하는 황화수소를 측정한 것으로서, 8주차(WK8)와 12주차(WK12) 각각 좌측부터 우측으로 순서대로 CON, TRT1, TRT2, TRT3, TRT4 의 결과이다.

사료 내 단백질은 대사과정을 통해 아미노산으로 가수분해되면서 휘발성 지방산류, 페놀류, 인돌류, 암모니아 및 휘발성 아민류 등으로 분해되는데, 이러한 분해산물이 가축분뇨로 배출되면서 악취를 유발한다.

가축분뇨에서 발생하는 악취는 복합악취 물질로서, 축종, 사양관리 방법, 분뇨처리 기술 등에 따라 다양하다. 예컨대 양돈장의 주요 악취물질은 복합악취의 형태로 지정악취물질 7종과 비지정악취물질 3종 등이 있다.

지정악취물질에는 암모니아, 트리메틸아민, 황화수소, 메틸머캅탄, 프로피온산, 부틸산, 이소-발레르산이 있고, 비지정악취물질에는 아세트산, p-크레졸, 인돌 등이 있다.

양돈의 단백질 대사과정에서는 사료 내 질소 함유량을 100% 라 했을 때, 체내에 축적되는 질소가 30% 이며, 이중 분과 뇨로 각각 20%, 50% 가 배출된다. 이때 돈사 슬러리 내에 쌓이는 질소가 57% 이고, 휘산되는 질소가 13% 이다. 돈사 슬러리의 질소 중 퇴액비화 과정을 통해 농경지에 살포되는 과정에서 18% 정도가 휘산되며, 최종적으로 농경지에 환원되는 질소의 양은 39% 정도가 된다.

종래는 배출된 분뇨의 악취물질을 저감시키기 위해, 유용미생물을 발굴하고 이를 살포하는 방식에 주목해왔다. 그러나 상기와 같이 대사과정 후 주요 악취 원인 물질은 다양할 수 밖에 없기 때문에, 이미 발생된 악취를 제거하는 방식은 악취 저감에 한계가 있을 수 밖에 없었다.

이에 본 발명자는 축산악취의 근본적인 해결을 위해 가축의 단백질 물질대사과정에 주목했고, 악취원인물질의 발생을 저감할 수 있는 유용미생물의 개발에 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이하 본 발명의 효과를 입증한 실시예를 소개한다. G10 과 M10 이 본 발명에 따른 미생물에 해당한다. G10 (기탁번호 KCCM12354P) 과 M10 (KCCM12355P) 은 각각 기탁기관에 기탁된 미생물이다.

본 발명자는 유용미생물을 활용한 축산 분뇨 내 악취 유발 물질의 농도를 효과적으로 억제하기 위하여 다양한 샘플들을 대상으로 균주 특성이 우수한 후보 균주들을 선발하였다.

양돈장 악취 제거를 목적으로 균주 선발용 샘플링 대상을 돼지의 사육단계별(육성전기, 육성후기, 비육전기, 비육후기) 분과 슬러리 및 퇴비장 주변 토양 샘플을 위주로 균주를 선발하였다.

다양한 균주 중 사료첨가제로 활용가능한 후보 균주로서, 유산균 및 바실러스 균주를 위주로 선발 배지를 활용하여 균주를 선발하였다.

균주 선발은 BCP 배지 (Casein Enzymic Hydrolysate 5 g/L, Yeast Extract 2.5 g/L, Dextrose 1 g/L, Agar 15 g/L), MRS 배지 (Proteose Peptone No.3 10 g/L, Beef Extract 10 g/L, Yeast Extract 5 g/L, Dextrose 20 g/L, Polysorbate80 1 g/L, Ammonium Citrate 2 g/L, Sodium Acetate 5 g/L, Magnesium Sulfate 0.1 g/L, Manganese Sulfate 0.05 g/L, Dipotassium Phosphate 2 g/L, Agar 15 g/L) 및 LB 배지 (Tryptone 10 g/L, Yeast Extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L, Agar 15 g/L)를 이용하였다.

샘플링한 각각의 시료들을 멸균 생리식염수 (0.85% NaCl)로 희석하여 MRS, BCP 및 LB 배지에 각각 도말한 후 33℃에서 24시간 이상 배양한 후 외관상 유산균 및 바실러스로 판정되는 균주를 우선 선발하였다.

선발된 균주를 15% glycerol stock을 제조하여 -70℃ deep freezer에 보관하면서 추가 실험에 활용하였다.

선발균주에 대하여 유기물 분해능을 평가하기 위하여 protease 및 amylase에 대한 효소활성을 평가하였다.

프로테아제(Protease) 효소 활성의 경우 스킴밀크(skim milk) 배지 (skim milk 10 g/L + Agar powder 15 g/L)를 만들어서 이용하였으며, 아밀라제(amylase) 효소 활성의 경우 스타치(starch) 배지 (starch 5 g/L + Agar powder 15 g/L)를 만들어 실험에 사용하였다.

실험을 위해 LB 배지에서 선발된 미생물을 LB 브로스(broth)에서 액상으로 24시간 배양하였으며, 스킴 밀크 배지 및 스타치 배지에 페이퍼 디스크(paper disk)를 올린 후 액상 배양액 200㎕를 접종하였다.

각 배지는 33℃에서 24시간동안 배양한 후 페이퍼 디스크를 중심으로 생기는 둥근 환의 지름을 측정하였다.

스타치 배지의 경우 아이오딘 솔루션(iodine solution) 10x를 제조하여 20초간 염색 한 후 투명 환 (clear zone)의 지름을 측정하여 각 선발균주의 유기물 분해능을 평가하였다.

실험 결과 일부 균주에서 효소 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히 본 발명에 따른 미생물의 경우 단백질 및 전분 분해능이 우수한 균주로 판명되어 축산 악취 원인물질 저감에 효과가 있을 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 미생물에 대해 항균활성 평가를 추가로 실시하였다.

항균활성 평가는 가축 분뇨 내에서 악취를 유발한다고 알려져 있는 Streptococcus anginosus 및 Clostridium perfringens 균주를 지표균주로 하여 항균활성을 가지는 후보 균주를 찾기 위하여 agar well diffusion 법을 사용하였다.

두 종의 지표균주를 nutrient 액체배지에 접종한 뒤 37℃ 항온 진탕 배양기에서 200 rpm으로 24시간 배양한 후 nutrient 한천 배지에 1% 첨가하여 유해균주가 포함된 한천 배지를 제조하였다.

제조된 배지에 천공기를 이용하여 배양액이 첨가될 부위를 천공한 후 선발균주 배양액을 첨가하여 각 균주별 지표균주에 대한 항균활성을 평가하였다.

균주 배양액의 제조는 균주를 MRS 액체배지를 이용하여 37℃의 온도조건에서 24시간 배양한 후 배양액을 제조하였으며, 0.45 ㎛ filter로 제균한 제균액 200 ㎕를 유해균이 포함된 천공배지에 첨가 하여 4℃에서 12시간 동안 냉장 보관 하여 배양액이 agar에 충분히 퍼지도록 한 후 37℃ 항온 배양기에서 12시간 동안 배양하여 투명환의 생성 유무를 확인하였다.

실험 결과 표 1 과 같이 본 발명에 따른 균주가 Streptococcus 및 Clostridium 에 대하여 항균활성이 있는 것으로 확인되었다.

지표균주 (유해미생물)		Streptococcus	Clostridium
Strain	M10	+++	++

선발된 미생물들에 대하여 악취 유발 가스 저감 능력을 실험하기 위한 실험을 수행하였다.

실험은 악취의 큰 원인물질이라고 알려진 ammonia, amines, hydrogen sulfide 및 total mercaptans의 4종의 검지관을 활용하여 가스 측정으로 진행하였다.

가스 측정은 카운터 부착 검지관식 기체측정기 (GV-110S, GASTEC CORPORATION, JAPAN)를 이용하여 측정하였으며, 각 가스의 측정은 ammonia (No. 3La, GASTEC), amines (No. 70L, GASTEC), hydrogen sulfide (No. 180, GASTEC) 및 total mercaptans (No. 4LK, GASTEC)의 검지관을 이용하였다(도 3 및 도 4).

실험 시작 전 균주를 35℃에서 24시간동안 배양하였다.

실험에 이용된 가스발생원으로는 돈분을 이용하였으며, 액상 배양한 균을 각각 2%씩 접종하고, 대조구에는 증류수를 동일한 양만큼 처리하였다.

가스 측정은 실험 개시시 (initial), 실험시작 24시간 및 48시간째에 이루어졌다.

가스 발생 시간을 고려하여 initial은 실험 시작 2시간 후에 측정하였다.

실험은 2반복으로 측정하였으며, 대조구의 측정값을 100점으로 상대적인 index score를 계산하였다.

	24Hour				48Hour
Trt	Ammonia	Amine	H₂S	TM	Ammonia	Amine	H₂S	TM	SUM
대조구	100	100	100	100	100	100	100	100	800
G10	70	80	0	0	254	182	0	88	674

	24Hour				48Hour
No.	Ammonia	Amine	H₂S	TM	Ammonia	Amine	H₂S	TM	SUM
대조구	100	100	100	100	100	100	100	100	800
M10	80	60	0	100	133	33	0	250	657

위 실험과 같이 본 발명에 따른 미생물인 G10 과 M10 은 분뇨에 분사하는 방식으로 사용하더라도 악취 저감에 효과가 있다. 즉 본 발명에 따른 미생물은 사료첨가제로 사용할 수도 있고, 분뇨에 살포하는 방식으로도 사용할 수 있다.

본 발명은 유기물 분해능 평가 결과 및 사료첨가제로의 활용가능성에서 탁월한 효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 미생물 균주의 명확한 동정을 위하여 16S rRNA sequencing을 실시하였다.

균주 동정 결과는 표 4 및 표 5 에 나타내었다.

Sample No.	Strains
G10	Bacillus amyloliquefaciens
M10	Lactobacillus brevis 3

Sample	동정 결과	Homology (%)	Sequence
G10	*Bacillus amyloliquefaciens*	99%	TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCG
M10	*Lactobacillus brevis*	98%	GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGCTTCCGTTGATTGACGTGCTTGCACTGATTTCAACAATGAAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAACTTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAACAAAAACCGCATGGTTTTTGTTTGAAAGGTGGTTTCGGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCCCACCAAGACAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACTCCTGAGAGTAACTGTTCAGGAGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAATCTTAGAGATAAGACGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAAGTCGTGAGGCCAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATG

균주 동정 결과 G10은 Bacillus amyloliquefaciens 로 확인되었으며, M10은 Lactobacillus brevis 균주로 확인되어 사료첨가제로 활용 가능한 균주로 판정되었다.

본 발명에 따른 미생물 균주의 사료첨가제로의 활용을 위해 가축이 섭취한 이후 균주가 역할을 하기 위해서는 낮은 pH 조건의 위장을 통과하여 안전하게 장까지 도달할 수 있어야 하기 때문에 낮은 pH부터 높은 pH까지 환경에서 균주의 안정성을 조사하였다.

이를 위하여 MRS 배지 및 LB 배지각 선발된 균주들을 접종하여 35℃에서 200rpm으로 24시간 진탕 배양하여 배양액을 제조하였으며, 1N HCl 및 1N NaOH를 이용하여 pH를 3, 5, 7, 9로 보정한 MRS 및 LB 액체 배지를 준비하였다.

이후 pH가 보정된 액체 배지에 선발된 균주 배양액을 균주별로 2%씩 접종한 후 35℃에서 200rpm으로 24시간동안 배양한 후 생균수 분석을 통해 pH별 안정성을 확인하였다.

실험 결과는 도 5 및 6 에 나타내었다.

실험 결과 G10이 pH 안정성이 높은 것으로 나타났으며, M10도 pH 안정성이 우수한 것으로 나타났다.

유기물 분해능 평가(효소 활성 평가), 악취 유발 가스 저감 능력 평가, 열안정성 평가, pH 안정성 평가 결과를 종합적으로 판단하여 사료첨가제로서 효과가 있는 G10 및 M10 균주의 in vivo 조건에서의 효능평가를 추가로 실시하였다.

균주들에 대한 육성돈 사양실험용 사료첨가제 시제품을 제조하기 위하여 기초적인 고체발효조건을 조사하였다.

고체발효조건으로는 기본적인 수분함량 및 균주별 발효온도, 발효시간에 대한 기초 발효공정을 토대로 배지조성 및 종균 접종량 조건을 확립하였다.

선발 균주의 최적 성장을 위한 배지조성은 G10 및 M10 균주를 대상으로 하였으며, 고체 발효 조건에서의 배지조성에 따른 균수 변화를 조사하였다.

고체 발효 배지조성은 용이하게 구할 수 있는 원료를 대상으로 발효실험을 진행하였으며, 총 5개의 조성으로 실험을 진행하였다.

배지조성은 표 6 에 나타내었다.

고체발효를 위하여 우선 각 균을 MRS 및 LB 액상배지에 접종하여 35℃, 200rpm에서 24시간동안 진탕 배양하여 균주 배양액을 제조하였다.

제조한 배양액을 각 배지조건 별로 1% 및 3% 씩을 각각 접종을 한 후 36℃의 발효조건에서 24시간 동안 배양 후 균수 분석을 통해 최적 발효용 배지조성을 선정하였다.

배지조성 (%)	A	B	C	D	E
소맥피	40	37.5			45
대두박	60	57.5	100	95
옥수수					50
당밀		5		5	5

배지조성	G10		M10
배지조성	1%	3%	1%	3%
A	6.00E+06	4.20E+07	1.50E+07	3.40E+08
B	3.00E+06	5.00E+06	5.00E+06	1.79E+08
C	2.10E+05	4.20E+05	9.00E+06	1.80E+07
D	4.10E+05	7.80E+05	1.00E+06	2.85E+08
E	3.10E+05	2.00E+06	2.30E+07	1.36E+08

24시간 발효 후 균수 확인 결과 배지조성 A에서 3% 접종하였을 때 G10 및 M10 모두 가장 높은 균수를 나타냈으며, 표 7 과 같이 최적 배지조성은 배지조성 A 이고 종균접종량은 3%가 발효조건상 효과가 우수하였다.

M10 및 G10 균주에 대하여 사양시험용 생균제 시제품을 제조하기 위하여 각 균주를 MRS 및 LB 액상배지에 접종하여 35℃, 200rpm에서 24시간동안 진탕 배양하여 배양액을 제조하였다.

제조한 배양액을 A 배지조성 3%씩을 각각 접종하여 발효를 진행하였다.

시제품 생산을 위한 고체발효는 30kg씩의 배지조성 A를 원료로 하고 초기 가수량을 45%로 조정한 후 121℃에서 30분간 멸균하여 배지 내부의 오염균을 완전히 제거한 후 실온까지 냉각하여 각 종균을 3%씩을 접종하여 36℃의 발효온도에서 30시간 발효를 진행하였다.

발효 후 각 샘플은 45℃의 조건에서 12시간의 건조하여 각각 20kg 이상씩의 발효물을 회수하고 사양시험에 활용하였다.

시제품의 분쇄 후 최종 균수는 다음 표 8 에 제시하였다.

균주	균수 (CFU/g)
G10	9.2E+08
M10	3.5E+08

균주의 genomic DNA를 추출하여 유전체 분석을 실시했다. PacBio RS II와 Illumina Highseq을 이용하여 genome sequencing을 실시하였으며, PacBio sequencing 결과로 얻은 reads들을 RS HGAP assembly version 3.0(SMRT Portal version 2.3, Pacific Biosciences)을 사용하여 assembly하였다.

Illumina 데이터를 사용하여 de novo assembly된 contig의 시퀀스 보정(sequence compensation)을 통하여 incorporation bias와 에러율을 최소화하였다.

BLASTP를 기본으로 Eggnog database를 이용하여 annotation하였다.

유전체 서열분석 자료를 genome data visualization software를 이용하여 분석하였다.

Sequencing을 통하여 확보된 유전체 정보에서 미생물 각각 ORF의 annotation을 확인한 후에, 유전체들 간을 상호비교하고 균주별 유용유전자를 발굴하였다.

B. amyloliquefaciens G10의 유전체의 크기는 총 3,929,653bp였으며, 46.5%의 G+C 함량, 3,750개의 단백질 코딩 유전자, 86개의 tRNA-인코딩 유전자, 27개의 rRNA-인코딩 유전자를 포함하고 있었다.

그 중 약 7.6%에 해당하는 287개의 유전자는 아미노산 운반과 대사에 관여하는 것으로 분석되었다.

예비실험을 통하여 황과 암모니아 저감 효과가 있었던 B. amyloliquefaciens G10 유전체에서 악취저감효과 관련 유전자를 발굴하기 위하여 유전체 annotation 결과의 황 및 암모니아 관련 유전자는 표 9 에서 보는 바와 같다.

Gene name	Product	Locus tag
Ammonia - related genes
sugE	Quaternary ammonium compound-resistance protein	G10-1_1_00152, G10-1_1_00153
aspA	Aspartate ammonia-lyase	G10-1_1_02429
nrgA	Ammonium transporter	G10-1_1_01197
hutH	Histidine ammonia-lyase	G10-1_1_00924
Sulfur - related genes
tusA	Sulfurtransferase	G10-1_1_00218, G10-1_1_00220
moeZ	putative adenylyltransferase/sulfurtransferase	G10-1_1_00221, G10-1_1_02311
csd	putative cysteine desulfurase	G10-1_1_00458,
glpE	Thiosulfate sulfurtransferase	G10-1_1_00480
salA	Iron-sulfur cluster carrier protein	G10-1_1_00571, G10-1_1_03514
dmsA	Dimethyl sulfoxide reductase	G10-1_1_00768, G10-1_1_02725
fdhD	Sulfurtransferase	G10-1_1_01176
bdbD	Disulfide bond formation protein D	G10-1_1_01512
bdbC	Disulfide bond formation protein C	G10-1_1_01513
cysJ	Sulfite reductase [NADPH] flavoprotein alpha-component	G10-1_1_01517
cysI	Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component	G10-1_1_01518
SGL	6-deoxy-6-sulfogluconolactonase	G10-1_1_01545
sufS	Cysteine desulfurase	G10-1_1_01600
sufU	Zinc-dependent sulfurtransferase	G10-1_1_01601
erpA	Iron-sulfur cluster insertion protein	G10-1_1_01653
msrP	Protein-methionine-sulfoxide reductase catalytic subunit	G10-1_1_01672
yuaD	Putative metal-sulfur cluster biosynthesis proteins	G10-1_1_01770
ssuC	Putative aliphatic sulfonates transport permease protein	G10-1_1_01820, G10-1_1_03719
ssuB	Aliphatic sulfonates import ATP-binding protein	G10-1_1_01821, G10-1_1_03721
glpE	Thiosulfate sulfurtransferase	G10-1_1_01854
msrC	Free methionine-R-sulfoxide reductase	G10-1_1_01918
IscS	Cysteine desulfurase	G10-1_1_01923, G10-1_1_02118
thiI	putative tRNA sulfurtransferase	G10-1_1_01924
frdB	Fumarate reductase iron-sulfur subunit	G10-1_1_02028
nifS	Putative cysteine desulfurase	G10-1_1_02085
resA	Thiol-disulfide oxidoreductase	G10-1_1_02470, G10-1_1_02813
petC	Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit	G10-1_1_02527
msrA	Peptide methionine sulfoxide reductase	G10-1_1_02615
msrB	Peptide methionine sulfoxide reductase	G10-1_1_02616
cysC	putative adenylyl-sulfate kinase	G10-1_1_03055
sat	Sulfate adenylyltransferase	G10-1_1_03056
cysP	Sulfate permease	G10-1_1_03057
cysH	Phosphoadenosine phosphosulfate reductase	G10-1_1_03058
moaD	Molybdopterin synthase sulfur carrier subunit	G10-1_1_03187
thiS	Sulfur carrier protein / adenylyltransferase	G10-1_1_03191, G10-1_1_03458, G10-1_1_03460
ykuV	Thiol-disulfide oxidoreductase	G10-1_1_03195
stoA	Sporulation thiol-disulfide oxidoreductase A	G10-1_1_03233
ssuD	Alkanesulfonate monooxygenase	G10-1_1_03718
ssuA	Putative aliphatic sulfonates-binding protein	G10-1_1_03720

총 4개의 암모니아 관련 유전자가 발굴되었으며 그 중에서 Ammonium transporter가 암호화 되어있는 nrgA는 nrgAB유전자군(operon)으로 존재하는 것으로 알려져 있다.

기존보고에 따르면 B. subtilis가 질소원으로 주로 사용하는 glutamine이 부족할 경우 암모니아를 질소원으로 사용하는데, nrgA는 암모니아 흡수에서 중요한 유전자이다(Christian detsch et al., 2003).

또한, Quaternary ammonium compound-resistance protein은 고농도의 독성 암모니아에 노출되었을 때 내성을 갖게 해주는 유전자로 알려져 있다(Chung and Saier.Jr., 2002).

한편, Sulfurtransferase, Iron-sulfur cluster carrier protein, Sulfite reductase, Cystein desulfurase, Sulfate permease 등 총 39개의 황 관련 유전자가 발굴되었으며(Auger et al., 2002) 황화물 감소와 관련된 메커니즘에서 각 유전자의 기능은 전사체 및 대사체와 같은 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결과적으로 유전체 분석결과에서 G10 은 황 관련 유전자를 보유하고 있으며, 이것이 악취 저감에 효과를 보인 것으로 생각된다.

3원교잡종 [(Landrace × Yorkshire) × Duroc] 육성돈 150두를 공시하였고, 시험 개시시 체중은 50.78 ± 1.83 kg이었으며, 사양시험은 12주간 실시하였다.

시험설계는 1) 대조구 (Basal diet), 2) TRT1 (Basal diet + 0.15% G10), 3) TRT2 (Basal dioet + 0.30% G10), 4) TRT3 (Basal diet + 0.15% M10) 및 5) TRT4 (Basal diet + 0.30% M10) 처리, 처리당 6반복, 반복당 5두씩 완전임의 배치하였다.

사양시험은 세종시에 위치한 단국대학교 시험농장에서 실시하였다.

시험사료는 NRC(2012) 요구량에 따라 배합한 옥수수-대두박 위주의 사료를 사용하였다.

시험사료는 시험농장에 위치한 배합기를 이용하여 배합하여 준비하였고 자유 채식토록 하였으며, 물은 자동급수기를 이용하여 자유로이 먹을 수 있도록 조절하였다.

생산성 평가의 경우 일당증체량, 사료섭취량 및 사료요구율은 시험 개시시 및 종료시 (12주)에 각 개체별로 체중을 측정하였다.

사료섭취량은 체중 측정시 사료급여량에서 잔량을 제하여 계산하고, 사료요구율은 사료섭취량을 증체량으로 나누어 산출하였다.

분내 악취물질 분석의 경우 분내 악취물질은 시험 종료 시 (12주) 각 처리구에서 동일한 시간 동안 배설된 분을 채취한 후, 신선한 분 300g을 취하여 2,600mL의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 실온에서 7일간 발효 및 보관한 후 Gastec (Model GV-100, GASTEC, Japan)을 사용하여 분으로부터 발생하는 암모니아 (NH₃), 황화수소 (H₂S)및 총메캅탄 (Total mercaptans)을 측정하였다.

균주별 사양실험 결과 생산성에 있어서 전체 시험기간 동안의 비육돈의 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료요구율에 있어 처리구간 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

하지만 분내 악취물질은 시험 8주차 비육돈의 분내 황화수소 수치에 있어 유산균 M10 0.15% 및 유산균 M10 0.3% 처리구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났고, 시험 종료 시 (12주) 황화수소 수치에 있어 유산균 M10 0.3% 처리구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다 (P < 0.05).

혈액 특성 및 영양소 소화율에 있어서는 전체 시험기간 동안 처리구간 차이가 나타나지 않았다.

아이템	대조구 (CON)	TRT1	TRT2	TRT3	TRT4	SEM
4주차
ADG, g	583	615	610	590	602	16
ADFI, g	1464	1504	1492	1475	1492	20
FCR	2.515	2.460	2.448	2.505	2.488	0.037
8주차
ADG, g	722	734	739	727	746	19
ADFI, g	2138	2176	2169	2164	2195	25
FCR	2.964	2.977	2.937	2.982	2.962	0.046
12주차
ADG, g	831	849	857	837	862	26
ADFI, g	2842	2867	2869	2862	2873	30
FCR	3.428	3.384	3.350	3.423	3.367	0.074
총
ADG, g	712	735	737	725	738	19
ADFI, g	2148	2182	2177	2167	2187	22
FCR	3.022	2.981	2.953	2.994	2.983	0.053

SEM 은 평균표준오차이다(Standard error of means).

ADG 는 일당평균증체량이다(Average daily gain).

ADFI 는 일당평균사료섭취량이다(Average daily Feed Intake).

FCR 은 사료요구율이다(ADFI/ADG).

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12354P

20181030

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12355P

20181030

Claims

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축사 분내 악취저감능을 가진 락토바실러스 브레비스 균주 KCCM12355P 를 포함하는 사료첨가제용 고상발효 생균제로서, 소맥피 및 대두박을 40% : 60% 의 비율로 포함하는 배지조성을 포함하고, 배지조성 기준으로 균주를 3% 접종하는 것을 특징으로 하는 고상발효 생균제.
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