KR102050019B1

KR102050019B1 - 면역증강용 사료첨가제, 이를 포함하는 배합사료

Info

Publication number: KR102050019B1
Application number: KR1020180016999A
Authority: KR
Inventors: 한만덕; 홍창일; 서영란; 이지학; 김남훈; 김홍기; 김선기
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2019-11-28
Also published as: KR20190097502A

Abstract

본 발명은 자연환경에서 분리한 K. marxianus 효모(SCHY-1)와 S. cerevisiae 효모(SCHY-21)을 고압멸균(autoclaving) 또는 파파인 효소로 처리하여 효모 자가분해물을 얻고, 여기에 스타터균(SCHY-1+SCHY21)을 접종하여 배양한 배양체를 포함하는 사료첨가제를 제조함으로써, 육계, 젖소 및 자돈에 배합사료와 함께 급여 시 백혈구 증가 등 선천성 면역반응의 향상과 사이토카인 IL-2 및 면역글로불린 IgG 생성 증가에 의한 체액성 면역반응을 향상시키는 효과가 확인되었다.
또한 상기 사료첨가제를 첨가한 배합사료는 가축의 장내 미생물 가운데 Lactobacillus 수를 유의하게 증가시키며, 특히 젖소와 자돈 모두에서 L. farciminis 균을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 사료첨가제가 면역력 향상 뿐만 아니라 가축의 장내 유익균 증식에 도움을 주고 있음을 알 수 있다.
따라서 자연환경에서 잘 적응된 생장이 우수한 야생효모를 이용한 사료첨가제는 가축산업에 활용가능성이 높을 것으로 전망된다.

Description

면역증강용 사료첨가제, 이를 포함하는 배합사료{animal feed additive for immune activity and animal feed comprising the same}

본 발명은 면역증강용 사료첨가제 및 이를 포함하는 사료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가축에 대하여 면역개선과 증강 효능을 갖는 효모배양물을 포함하는 사료첨가제, 이를 포함하는 사료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

세계보건기구(WHO)에서는 병리학에 근거하여 사료 내 성장촉진용 항생제의 사용과 사람의 내성률 간에 의학적인 관계가 있음을 보고하였으며(WHO, 2000), 사료 내 항생제 첨가를 금지하고 항생제 사용과 내성에 대한 감독을 할 수 있는 기관을 설치해야한다고 보고한 바 있다. 이에 우리 정부 역시 2011년 7월부터 모든 항생제의 배합사료 사용에 금지토록 규제가 점차 강화되고 있으므로, 항생제와는 다르게 내성이나 잔류 문제가 없으면서 가축의 능력을 최대화 할 수 있는 항생제 대체물질의 개발이 요구되고 있다.

따라서 이의 대안책으로 다양한 효모 제품들이 출시되었다. 예를 들어 미생물 자체를 사료에 첨가한 것으로 가축의 장내 세균총을 숙주동물에 유리하게 유지하거나 병원성 대장균 증식을 억제하며, 돌연변이 유발요인, 발암물질 억제와 면역반응 증진, 섭취한 영양소의 소화율 및 가축 생산성을 개선시키는 장점을 갖는다.

현재까지 혈중 콜레스테롤 농도를 저해시키는 약제인 로바스타틴을 대량 생산할 수 있는 누룩곰팡이인 아스퍼질러스 테레우스에 NTG를 처리하여 얻은 변이주를 고체배양으로 제조하고, 이를 돼지, 유계의 사료에 첨가하여 혈중 및 고기 내 콜레스테롤을 현저히 저하시킨 발명이 공지되어 있다. 허나 이는 야생균을 그자체로 이용하는 것이 아닌 변이주이기 때문에, 배양과정을 거침에 따라 효과가 저하되는 문제가 있고, 공정이 복잡하여 충분한 효과를 얻지 못하는 문제가 있다(특허문헌 1. 대한민국등록특허 제10-0775134호).

이 외에도 다양한 미생물들이 개발된 바 있으나, 미생물을 그 특성에 따른 적용 분야 외에 다른 분야에 적용되었을 경우 오히려 해가되는 일이 많고, 적용하더라도 비용이 증가됨과 동시에 이를 사용하는데 불편함이 많다.

최근에는 상기 문제점을 해소하기 위하여 자기소화 과정을 거쳐 건조된 생체성분을 갖는 효모 자가분해물을 활용한 예들이 있고, 이는 우수한 영양성 때문에 전통적으로 식품 및 동물사료의 첨가제로 제시된 바 있다. 그러나 성장 및 사료 효율 측면에서 생사료에 비해 크게 개선되지 않거나, 가격 면에서도 비싸기 때문에, 실질적 적용에 한계점이 있으며, 재료의 불안정한 공급과 이를 위한 미생물의 수급과 효모 자가분해물 제조에 막대한 비용이 수반되는 문제점이 발생되는 단점이 존재한다.

따라서 상술한 문제점을 해결하는 동시에, 다양한 가축들에 적용가능하면서도, 단순 활성효모제와는 차별화된 프리바이오틱(prebiotics)을 개발하고자 노력한 바, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 종래 생효모를 포함하는 사료의 문제점을 개선하고 면역활성을 증진시키는 효모배양물을 포함하는 사료첨가제 및 이를 포함하는 배합사료를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 제2 효모를 접종 배양시킨 효모배양물;을 포함하고, 상기 효모배양물은 고형분을 기준으로 가축사료에 0.1 내지 0.5 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제를 제공한다.

상기 사료첨가제 1 중량부를 기준으로, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생효모를 1 중량부 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 사료첨가제 1 중량부를 기준으로 효모 자가분해물 1 중량부 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 효모 자가분해물은 제1 효모를 고압멸균하거나, 가수분해효소를 처리하여 제조되는 것일 수 있다. 상기 가수분해효소는 파파인 효소인 것일 수 있다.

상기 제1 효모는 Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 제2 효모는 동일하거나 서로 상이하고, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 면역증강용 사료첨가제를 포함하는 배합사료를 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 단계를 포함하는 면역증강용 사료첨가제의 제조방법을 제공한다.

(ⅰ) 제1 효모에 고압멸균 또는 가수분해효소를 처리하여 효모 자가분해물을 제조하는 단계; 및

(ⅱ) 상기 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 제2 효모를 접종, 배양시켜 효모배양물을 수득하는 단계.

본 발명에 따른 면역증강용 사료첨가제는 섭취한 영양소의 소화율을 개선하여 발효에 필요한 기질을 감소시켜, 분변에서 생성되는 유해가스의 발생을 억제할 수 있다. 그러므로 효모 사료첨가제의 급여는 축산에서 문제가 되고 있는 악취저감에 도움이 된다. 또한 본 발명에 따른 면역증강용 사료첨가제를 급여할 경우, 가축의 성장을 촉진시키고, 장내 미생물 조성에 긍정적인 영향을 미치며 분변으로부터 발생되는 악취발생 감소에 효과적인 것으로 보고되었다.

도 1은 시료를 채취한 장소를 구체적으로 표기한 것이다.
도 2는 실험예 1로부터 분리된 44종의 효모에 대하여, 18S rDNA 뉴클레오파이드 서열에 기초하여 분석된 발생계통수를 분석한 결과이다. 계통수는 MEGA 7을 사용하여 neighbor-joining method에 의해 생성하였고, 분기 위 또는 아래의 숫자는 부트 스트랩 지원 값을 의미한다.
도 3은 실시예 2의 2)로부터 확인한 15종의 효모에 대한 성장률 곡선이다. SCHY-1; Kluyveromyces marxianus SCHY-1, SCHY-21; Saccharomyces cerevisiae SCHY-21, SCHY-82; Pichia kudriavzevii SCHY-82, SCHY-155; P. kudriavzevii SCHY-155, SCHY-159, Meyerozyma caribbica SCHY-159, SCHY-161; S. cerevisiae SCHY-161, SCHY-164; M. caribbica SCHY-164, SCHY-165; P. kudriavzevii SCHY-165, SCHY-167; S. cerevisiae SCHY-167, SCHY-169; Eremothecium coryli SCHY-169, SCHY-170; S. cerevisiae SCHY-170, SCHY-171; W. anomalus SCHY-171, SCHY-172; Candida albicans SCHY-172, SCHY-178; P. kudriavzevii SCHY-178 및 SCHY-186; S. cerevisiae SCHY-186.
도 4는 선정된 효모 중에서 5종의 효모에 대한 SEM 사진이다. 도 4A, B는 야생효모(wild yeast strain) SCHY-1이고, 도 4C, D는 SCHY-161이며, 도 4E, F는 SCHY-165이며, 도 4G, H는 SCHY-171이며, 도 4I, J는 SCHY-21이다. A, C, E, G, I의 SEM 사진은 x 10000 배율로 촬영한 것이고, B, D, F, H, J의 SEM 사진은 x 1000 배율로 촬영한 것이다.
도 5는 효모 SCHY-1, SCHY-21으로 제조된 효모 자가분해물(실시예 3 내지 16)을 260 nm로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 효모 SCHY-1, SCHY-21으로 제조된 효모 자가분해물(실시예 3 내지 16)을 280 nm로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 K. marxianus SCHY-1 효모의 SEM 사진이다. 도 7A, C는 ㅧ 1000 배율로 확대한 것이고, 도 7B, D는 ㅧ 10,000 배율로 확대한 사진이다.
도 8은 K. marxianus SCHY-1 효모를 고압멸균으로 처리하여 얻은 효모 자가분해물의 SEM 사진이다. 도 8A, C는 ㅧ 1000 배율로 확대한 것이고, 도 8B, D는 ㅧ 10,000 배율로 확대한 사진이다.
도 9는 K. marxianus SCHY-1 효모를 파파인 효소로 처리하여 얻은 효모 자가분해물의 SEM 사진이다. 도 9A, C, E는 ㅧ 1000 배율로 확대한 것이고, 도 9B, D, F는 ㅧ 10,000 배율로 확대한 사진이다.
도 10은 실시예 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15에 따라 제조된 효모 자가분해물의 β-glucan, galactomannan의 농도(ppm)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15에 따라 제조된 효모 자가분해물의 protease, α-amylase 효소활성(U/g)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 대조군(CON), 제1 실험군(TRT1) 및 제2 실험군(TRT2)의 분내 가스 조성을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 13a는 초기상태의 대조군과 제1 실험군(cont-i, T1-i)에 대한 차트이고, 도 13b는 2주 후의 대조군과 제1 실험군(cont-14d, T1-14d)에 대한 차트이며, 도 13c는 4주 후의 대조군과 제1 실험군(cont-28d, T1-28d)에 대한 차트이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 면역증강활성을 갖는 효모배양물을 제조하여 닭, 소, 돼지 등의 가축들의 성장 및 생산을 위한 사료 등의 다양한 분야에 적용가능한 사료첨가제를 제공하기 위한 것이므로, 이러한 특성 및 장점을 갖는 미생물체를 발견함이 우선되어야 할 것이다.

따라서, 본 발명자는 수많은 반복실험을 통해, 생장률이 우수할뿐만 아니라, 장내 유익한 미생물의 번식을 촉진하고, 가축으로부터 얻을 수 있는 생산물의 품질과 양이 증가하며, 가축의 면역활성을 증진시키는 미생물을 발견한 것이다. 구체적으로, 종래 생효모(Live Yeast)로 불리는 단순 활성효모제와 차별화하여, 면역생리활성물질인 베타글루칸(β-glucan)과 만난(mannan)을 최적으로 생성하는 효모를 축산환경(양계장, 양돈장 및 목장)에서 선발함과 동시에 이들 효모를 액상배양한 후, 자가분해(Yeast Autolysis) 공정을 통해 최적의 β-glucan/mannan, protease, α-amylase 등을 생산하는 제조공정을 통해 최적의 "효모배양물"을 대량생산할 수 있는 시스템을 구축하였다.

상술한 효모배양물을 포함하는 사료첨가제는 육계 및 낙농 사양실험을 통해 신바이오틱 효모배양물(Yeast Culture)이 무항생제 친환경 축산물의 생산 가능성을 확인하며, 육계, 이유자돈 및 젖소의 장내 미생물 균총변화를 통해 다방면에서 면역성을 증진시키고 있음을 확인하였다.

본 발명에서 가축은 가금류 또는 반추동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 가금류란, 닭, 오리, 메추리, 칠면조 또는 타조 등 식용할 수 있는 알을 산란하는 가금류는 모두 포함할 수 있고 바람직하게는 육계일 수 있다. 또한 상기 반추동물은 소, 젖소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함하는 것으로, 바람직하게는 젖소, 돼지일 수 있음, 가장 바람직하게는 젖소일 수 있다.

본 발명에 따른 면역증강용 사료첨가제는 동물체내 흡수가 쉽지 않은 β-glucan/mannan 등의 고분자화합물을 효모의 자가분해(autolysis)를 유도함으로써, 체내 흡수가 용이한 저분자화합물로 분해한 효모 자가분해물을 얻고, 이를 배양 원료로 하여, 고상배양기법을 통해 효모를 접종 및 배양하여, 면역증강효과를 갖는 효모배양물을 개발함으로써, 가축의 질병을 예방할 수 있는 효과를 갖게 되는 것이다.

본 발명에 따른 면역증강용 사료첨가제는 무항생제인데도 불구하고 현저히 우수한 면역증강 효과를 갖기 때문에, 친환경 유기농 축산물 분야에 활용이 가능하다는 장점을 갖는다.

본 발명의 일 측면은 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 제2 효모를 접종 배양시킨 효모배양물을 포함하고, 상기 효모배양물은 고형분을 기준으로 가축사료에 0.1 내지 0.5 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제에 관한 것이다.

또한 본 발명에 따른 면역증강용 사료첨가제를 제조할 때는 (ⅰ) 제1 효모를 고압멸균하거나, 가수분해 효소로 처리하여 효모 자가분해물을 제조하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 제2 효모를 접종, 배양시켜 효모배양물을 수득하는 단계;를 포함한다.

우선, 효모 자가분해물을 제조하기 위하여, 제1 효모를 고압멸균하거나, 가수분해효소를 처리하는데, 구체적으로 고압멸균으로 처리하는 경우 제1 효모를 액체 배지를 통해 배양하고, 이의 배양액을 원심분리 및 건조하여 효모 건체물을 얻은 후, 상기 건체물을 100 내지 150 ℃, 10 내지 30 분간 고압멸균처리를 통해 자가분해시켜 효모 자가분해물을 얻을 수 있다.

파파인 효소를 처리하는 경우에는 제1 효모를 액체 배지를 통해 배양하고, 이의 배양액을 원심분리 및 건조하여 효모건체물을 얻은 후, 상기 건체물에 1 내지 3 units/mg 가수분해 효소를 첨가하여 20 내지 70 ℃, 1 내지 30 시간 배양하여 자가분해시켜, 효모 자가분해물을 얻을 수 있다. 상기 가수분해 효소는 파파인 효소인 것이 가장 바람직하다.

상기 액체 배지는 상기 제1 효모를 배양하는데 사용될 수 있는 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 효모 건체물에 접종되는 가수분해 효소, 바람직하게는 파파인 효소는 전체 배지에 대하여 1-10 중량%로 접종될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이후, 상기 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 제2 효모를 접종 배양시켜 효모배양물을 제조할 수 있다. 상기 고체 배지는 상기 효모 자가분해물을 포함하는, 제2 효모를 배양하는데 사용될 수 있는 배지라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 물 1 중량부를 기준으로 oat meal 1 내지 10 중량부, wheat gluten 1 내지 10 중량부, dry yeast 0.5 내지 5 중량부, CSL(corn steep liquor) 및 당밀 0.1 내지 1 중량부, 염 및 미네랄 0.1 내지 0.5 중량부, 효모 자가분해물 0.1 내지 0.5 중량부를 포함하는 배지인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 배지 내 성분의 함량은 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 또한 잡균의 증식을 억제하기 위하여 고온에서 멸균된 배지가 바람직할 수 있다.

상기 고체 배지에 포함되는 상기 효모 자가분해물은 전체 배지에 대하여 5 내지 20 중량%로 접종될 수 있으나, 크게 제한되는 것은 아니다.

상기 제1 효모와 상기 고체 배지에 접종되는 제2 효모는 전체 배지에 대하여 1-5 중량%로 접종될 수 있으나, 크게 제한되는 것은 아니며, 상기 제1과 제2 효모는 서로 동일하거나, 서로 상이한 균주가 사용될 수 있다. 또한 상기 제1, 2 효모는 종래 공지된 균주를 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 양계장, 돈사 및 우사로부터 얻은 효모균으로, 본 발명에 사용할 수 있는 효모균은 보통 pH 4.0-6.5의 약산성에서 잘 번식하며, 발육 최적 온도는 25℃-35℃인 것일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 제1, 2 효모는 Kluyveromyces marxianus strain TB7258, Saccharomyces cerevisiae CBS:6282 및 Saccharomyces cerevisiae strain ATCC4098로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

가장 바람직하게 제1 효모는 Kluyveromyces marxianus strain TB7258이고, 제2 효모는 Kluyveromyces marxianus strain TB7258 및 Saccharomyces cerevisiae strain ATCC4098의 혼합일 수 있다.

구체적으로 상기 효모배양물은 5 x 10⁷ 내지 1 x 10⁹ cfu/g 의 제2 효모균이 함유되어 있는, 고상배양체인 것이 바람직하다.

또한 상기 효모배양물 1 중량부를 기준으로, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생효모를 1 중량부 더 포함할 수 있다.

상기 효모배양물 1 중량부를 기준으로 제1 효모를 고압멸균으로 처리하거나, 파파인효소를 처리하여 효모 자가분해물을 제조하고, 상기 효모 자가분해물을 1 중량부 더 포함하는 것일 수 있다. 이때 첨가되는 상기 효모 자가분해물은 체내에 영양성분의 흡수력을 상승시키도록 함과 동시에 면역력을 향상시켜, 유해 환경과 질병으로부터 폐사를 방지하는 효과를 보완할 수 있ㅆ다. 다만, 본 발명의 효모 외에 다른 미생물을 사용한 것일 수 있으나, 사료첨가제에 사용된 다른 효모에 유해하지 않도록 하기 위하여, 앞서 설명한 제1 효모와 동일한 효모를 사용한 것이 바람직하다.

(ⅲ) 상기 효모배양물을 동결건조하는 단계를 더 포함하여, 분말로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 사료첨가제는 배합사료에 대하여 0.1 내지 0.5 중량%로 배합하여 가축에 급여하는 것을 특징으로 하는 급여방법을 제공할 수 있고, 상기 급여는 1일 1~10회로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 가축의 영양상태에 따라 적절하게 조절 할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 면역증강용 사료첨가제를 포함하는 동물용 배합사료에 관한 것인데, 상기 사료첨가제는 상기 전체 배합사료에 대하여 0.1 내지 0.5 중량% 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.2 중량%일 수 있다. 만약 상기 사료첨가제가 전체 배합사료에 대하여 0.1 중량% 미만일 경우 면역증강 효과를 비롯한 분변의 악취저감효과 등이 발현되지 않는 문제가 발생할 수 있다.

상기 본 발명에 따라 제조된 면역증강용 사료첨가제 또는 이를 첨가한 배합사료를 급여할 경우, 가축의 영양소 소화율을 개선하여 장내 유해가스(암모니아)의 발생을 억제함에 따라 분변의 악취를 저감시키는 효과를 가짐을 확인하였다.

또한 본 발명에 따라 제조된 면역증강용 사료첨가제 또는 이를 첨가한 배합사료를 급여할 경우, 가축의 장내에 존재하는 미생물의 긍정적인 영향을 미치는데, 구체적으로 Lactobacillus는 증가시키고, E. coli는 감소시킴을 알 수 있다.

또한 본 발명에 따라 제조된 면역증강용 사료첨가제 또는 이를 첨가한 배합사료는 설사와 폐사율에 영향을 미치지 않고, 장기나 육질에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 젖소에 적용할 경우 오히려 생산되는 우유의 품질과 양이 증가하였음을 확인하였다.

즉 본 발명에 따라 제조된 면역증강용 사료첨가제 또는 이를 첨가한 배합사료는 면역증강 외에도 다른 부가적인 효과들을 동시에 갖고 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 면역증강용 사료첨가제 또는 이를 첨가한 배합사료는 농가의 경제적 소득을 높일 수 있음을 알 수 있다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

실시예 1: 효모분리 및 동정

1) 시료 채취

야생효모를 분리하기 위해 충남의 축산 환경을 중심으로 여러 지역에서 시료를 수집하였으며, 충남 외 경기, 충북, 강원, 전남 및 광주 지역의 축사 및 동물원(경기 광명, 충북 창원, 충남 논산, 아산, 예산, 태안, 서산, 홍성, 부여 및 보령 지역)에서 시료를 수집하였다. 구체적인 지역은 하기 도 1에 표기하였다.

도 1은 시료를 채취한 장소를 구체적으로 표기한 것이다. 도 1A는 전국지도 상에서 시료 채취 장소를 표기한 것이고, 도 1B는 충청남도의 지도 상에서 시료 채취한 장소를 표기한 것이다. 도면 상에 검은 원(A ~ J)은 1차 년도(가금류 농장 및 양조장 환경) 샘플링 지점, 흰색 원(K ~ U)은 2차 년도(돈사 및 우사 환경) 샘플링 지점을 나타낸 것이다. 구체적으로 A, Gwangmyeong-si, Gyeonggi-do; B, Taean-gun, C.N.; C, Seosan-si, C.N.; D, Yesan-gun, C.N.; E, Hongseong-gun, C.N.; F, Asan-si, C.N.; G, Boryeong-si, C.N.; H, Buyeo-gun, C.N.; I, Nonsan-si, C.N.; J, Cheongju-si, Chungcheongbuk-do,; K, Yesan-gun, C.N.; L, Hongseong-gun, C.N.; M, Dangjin-si, C.N.; N, Cheonan-si, C.N.; O, Cheonan-si, C.N.; P, Asan-si, C.N.; Q, Gokseong-gun, Jeollanam-do.; R, Gwangju metropolitan city.; S, Yeongwol, Kangwon-do,; T, Nonsan-si, C.N. U, Nonsan-si, C.N. C.N.은 충청남도의 약자

2) 시료로부터 균 분리

상기 1) 에서의 채취지역에서 구체적으로 야생효모를 분리하고자 하였고, 시료는 총 2년에 걸쳐 수집하였다. 양계장에서 채취한 시료가 85개, 우사에서 채취한 시료가 28개, 돈사에서 7개, 소 내장에서 6개, 돼지 내장에서 15개, 그 외 가금장이나 동물원 등에서 채취한 시료는 25개이며, 가축의 볏집이나 곡물 등에서는 11개, 버섯에서 2개, 음료나 음식 등 9개, 막걸리 9개에서 수집하여 총 197개의 시료를 채집하였다. 각 시료로부터 분리된 균은 아래 표 1에 나타내었다.

구분	시료 채취 장소	시료 채취 시기		분리된 균의 수
구분	시료 채취 장소	1차년도 (2016.8~9)	2차년도 (2017.3~4)	분리된 균의 수
1	Poultry farm (faces, feed, soil etc.)	85	0	85
2	porcine guts (colon, cecum, etc.)	0	15	15
3	Swine farm (faces, feed, soil etc)	0	7	7
4	bovine guts (colon, cecum, etc.)	0	6	6
5	Cow farm (faces, feed, soil etc)	13	15	28
6	Grains (bean, rice, etc)	0	11	11
7	Mushroom (Ganoderma mushroom, Tibetan Mushrooms)	2	0	2
8	Food (sake, baker)	9	0	9
9	Brewery (Makgeolli )	8	1	9
10	Other animal feces	20	5	25
합계		148	19	197

3) 효모분리용 선택배지 선정

다양한 시료에서 효모균주를 선발하기 위해서는 진균 선택배지인 Yeast Peptone Dextrose (YPD) agar와 Yeast Mold (YM) agar를 사용하기로 했다. 구체적으로 시료를 증류수(D.W)를 이용하여 10%로 희석시킨 뒤 100 μl씩 분주하여 도말(spreading)한 후, 30 ℃ 48 시간 배양하였다. 축사 시료 중 분변에는 Candida spp가 많이 포함되어 있다. 따라서 이를 배제하고 S. cerevisiae 균주를 분리하기 위해 S. cerevisiae의 내알콜성을 이용하기로 했다. 즉, 상기 2)에서 분리된 균으로부터 효모 S. cerevisiae만을 분리할 수 있도록, 에탄올 첨가배지를 사용하는데, 구체적으로 YM broth (Becton Dickinson, USA), YM agar(BD, USA) 배지에 에탄올(Daejung, Korea) 5%, 10% 15%를 첨가하고, YPD(BD, USA) 배지에는 3%, 7% 에탄올(Daejung, Korea)을 첨가하여 제조된 에탄올 첨가배지를 준비하였다.

최종적으로 상기 에탄올 첨가 배지가 효과적으로 S. cerevisiae 균주를 분리하는지 확인하기 위하여 C, albicans , S. cerevisiae 둘의 혼합균주를 30 ℃ 48 시간 배양하여 S. cerevisiae의 선별여부를 관찰하였다.

4) 효모 분리

효모를 분리하기 위하여, 상기 3)에서 설명한 바와 같이 YM agar, 10% 에탄올, 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함하는 평판배지를 이용하였다. 상기 1) 단계로부터 채취한 각 시료 1 g을 증류수(Distilled water) 10 ml로 희석한 후, 이를 상기 준비된 평판배지에 100 μl 씩 분주하여, 30 ℃ 배양기(incubator)에서 48 시간동안 배양하였다.

배양이 완료된 후, 상기 배지에 형성된 각 콜로니(colony)를 관찰하여 형태학적 표현형이 독특하면서, 효모(yeast)라 추정되는 균주를 분리하였다. 선별된 균은 2회 계대배양을 통해 순수분리 하였다.

양계장 내 분변, 토양, 볏짚 및 사료 등 85가지의 샘플들로부터 9종의 콜로니를 분리하였으며, 돈사 및 우사에서 각각 7개, 28개의 샘플을 채취하여 그 중 2개와 6개의 콜로니를 분리. 그 외 오리, 꿩 등 가금류 농장. 동물원 내 염소, 타조 우리 등 25가지 샘플로부터 11종의 콜로니를 분리하였다. 또한 11종의 곡물로부터 10종의 콜로니를 분리하였고, 버섯 2가지 샘플에서 1종의 콜로니, 발효빵 등 음식 9종에서 5종 콜로니, 양조장 내 막걸리 9종에서 각 9종의 콜로니를 분리하였다. 그 결과 최종 197개의 시료로부터 총 53종의 효모 콜로니를 분리하였고, 이는 하기 표 2에 정리하였다.

구분	시료 채취 장소	총 시료 수	시료로부터 분리된 효모의 수
1	Poultry farm	85	9
2	Porcine guts	15	0
3	Swine farm	7	2
4	bovine guts	6	0
5	Cow farm	28	6
6	Grain	11	10
7	Mushroom	2	1
8	Food	9	5
9	Makgeolli	9	9
10	Other animal feces	25	11
총 합계		197	53

5) 분리된 야생효모 동정

상기 4) 단계를 통해 분리된 총 53종의 야생효모의 18S rRNA를 프라이머(primer) ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 및 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3')로 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하고 전기영동(Electrophoresis)한 후, 에탄올(ethanol) 침전으로 18S RNA서열을 얻어 시퀀싱(sequencing)한 다음 이를 기반으로 NCBI BLAST search (National Center for Biotechnology InformationBasic Local Alignment Search Tool)를 통해 검색하여 각 야생효모를 동정하였다.

동정한 결과, 총 53 종의 효모 중에서 44종이 동정되었고, 이는 표 3에 정리하여 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이, Ganoderma lucidum 버섯으로부터는 Kluyveromyces marxianus가 분리되었으며, Makkoli로부터는 Saccharomyces cerevisiae YJM1592 가 분리되었다. 와인이나 사케 및 베이커에서는 다른 균주명의 S. cerevisiae가 분리되었음을 확인하였고, 양계, 가금, 소 및 돼지 등 동물 분변으로부터는 주로 Pichia kudriavzevii가 분리되었다. 이외 가축 사료 및 곡물 등에서 S. cerevisiae뿐만 아니라, Meyerozyma caribbica, Eremothecium coryli 및 Wickerhamomyces anomalus도 분리되었음을 확인하였다. 또한 본 실험예로부터 분리되고 동정된 효모 44종은 MEGA 7 program을 통하여 Texa analyses 확인하였고, 그 결과는 하기 도 2에 나타내었다.

구분	분리 및 동정된 효모명	시료 채취 장소	추정종류 (Putative species)	관련 유전자은행 시퀀스 (Related Genebank sequence)	상동성 (Identity)(%)
1	SCHY-1	Ganoderma lucidum	Kluyveromyces marxianus strain TB7258	JQ425345.1	696/697 (99%)
2	SCHY-2	Jangsoo (Draft) Makkoli	Saccharomyces cerevisiae YJM1592	CP006433.1	807/807 (100%)
3	SCHY-6	Chicken feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10190	KU095862.1	493/493 (100%)
4	SCHY-8	Chicken feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	491/491 (100%)
5	SCHY-9	Pool water	Candida glabrata strain M356B	KP675589.1	844/845 (99%)
6	SCHY-14	Poultry feces	Tilletia ayresii strain CBS482.91	KP322985.1	511/511 (100%)
7	SCHY-15	Poultry feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	495/495 (100%)
8	SCHY-17	Sake	Saccharomyces cerevisiae strain P1	KU131578.1	818/818 (100%)
9	SCHY-19	Baker	Saccharomyces cerevisiae strain P1	KU131578.1	776/777 (99%)
10	SCHY-20	Wine	Saccharomyces cerevisiae strain ATCC4098	KU729087.1	817/817 (100%)
11	SCHY-21	Wine	Saccharomyces cerevisiae strain ATCC4098	KU729087.1	811/813 (99%)
12	SCHY-24	Sake	Saccharomyces cerevisiae strain P1	KU131578.1	786/786 (100%)
13	SCHY-35	Chicken feces	Pichia kudriavzevii strain ATCC14243	KU729098.1	500/500 (100%)
14	SCHY-59	Chicken feces	Pichia kudriavzevii strain ATCC14243	KU729098.1	493/493 (100%)
15	SCHY-69	Bovine feces	Pichia manshurica strain PMM10-206L	KP132515.1	451/451 (100%)
16	SCHY-120	Chicken feces	Pichia kudriavzevii strain ATCC 14243	KU729098.1	492/492 (100%)
17	SCHY-123	Chicken feces	Pichia kudriavzevii strain PMM10-138L	KP132510.1	494/494 (100%)
18	SCHY-124	Duck feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	493/493 (100%)
19	SCHY-125	Duck feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	494/494 (100%)
20	SCHY-127	Pheasant feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	493/493 (100%)
21	SCHY-128	Pheasant feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	491/491 (100%)
22	SCHY-141	Asan Rice Draught Makkoli	Saccharomyces cerevisiae YJM1592	CP006433.1	792/796 (99%)
23	SCHY-142	Jangsoo (Draft) Makkoli	Saccharomyces cerevisiae YJM1592	CP006433.1	801/801(100%)
24	SCHY-143	Rice Draught Makkoli	Saccharomyces cerevisiae YJM1592	CP006433.1	787/792 (99%)
25	SCHY-82	Porcine feed	Pichia kudriavzevii CBS:5590	KY104596.1	511/512 (99%)
26	SCHY-155	Bovine feces	Pichia kudriavzevii strain AUMC10288	KX218263.1	489/489 (100%)
27	SCHY-159	Bovine feed	Meyerozyma caribbica CBS:2022	KY104217.1	584/585 (99%)
28	SCHY-161	Bovine feces	Saccharomyces cerevisiae strain GITA14	KY630581.1	815/815 (100%)
29	SCHY-164	Bovine feces	Meyerozyma caribbica CBS:11118	KY104224.1	591/591 (100%)
30	SCHY-165	Feed grains	Pichia kudriavzevii CBS:6799	KY104583.1	504/504 (100%)
31	SCHY-167	Feed grains	Saccharomyces cerevisiae strain GITA14	KY630581.1	813/813 (100%)
32	SCHY-168	Feed grains	Saccharomyces cerevisiae strain GITA14	KY630581.1	807/807 (100%)
33	SCHY-169	Feed grains	Eremothecium coryli CBS:5749	KY103389.1	648/649 (99%)
34	SCHY-170	Feed grains	Saccharomyces cerevisiae strain GITA14	KY630581.1	824/824 (100%)
35	SCHY-171	Feed grains	Wickerhamomyces anomalus strain P42B001	JX188245.1	600/600 (100%)
36	SCHY-172	Ostrich feces	Candida albicans strain CBS:6426	KY101918.1	521/521 (100%)
37	SCHY-178	Bovine feces	Pichia kudriavzevii CBS:6799	KY104583.1	505/505 (100%)
38	SCHY-186	Makkoli (pre-sale)	Saccharomyces cerevisiae CBS:6282	KY105061.1	751/752 (99%)

6) 결론

표 3 및 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 시료들 중에서 축사 및 양조장 환경에서 채취된 시료에서 분리된 효모들은 대다수 Pichia 혹은 Saccharomyces 속에 속하였으며, Meyerozyma, Wickerhamomyces, Candida, Kluyveromyces 및 Eremothecium 속은 Pichia 속보다는 Saccharomyces 속에 가까운 근연관계로 분석되었다. 그러나 그 속에서도 시퀀스 유사도(sequence similarity)가 84% 정도로 낮아 다소 간의 유전적 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.

Kluyveromyces 및 Eremothecium 속은 sequence similarity가 97% 수준으로 유전적 동질성을 보여주었으며, Meyerozyma 및 Wickerhamomyces 속의 경우에도 시퀀스 유사도(sequence similarity)가 96% 수준으로 유전적 동질성을 가지고 있음을 확인하였다. 한편 Candida albicans로 추정되는 SCHY-172 및 Candida glabrata로 추정되는 SCHY-9의 경우, 동일한 속이니 만큼 상당한 유전적 거리를 가지고 있음을 확인하였다. 이는 과거에 염기서열(sequence)을 이용한 분자유전학적으로 분류하는 것이 아닌, 형태학적으로 위균사를 형성하는 특징을 갖는 효모 균주를 Candida 속으로 묶어 분류하였기 때문이라 여겨진다.

실시예 2. 성장률이 우수한 2종의 효모 선정

1) 성장률 분석

상기 실험예 1로부터 분리된 38종의 효모들 중에서, 고체배지에서 활발한 성장이 육안으로 확인되는 하기 표 4의 20종의 효모들의 성장률을 평가하고, 이로부터 구체적인 성장률을 비교하여 선별하였다. 구체적으로 상기 실시예 1로부터 분리된 20 종의 효모를 YM broth 500 ㎖에서 30 ℃ 48 시간 배양하고, 이의 건체량을 확인하기 위해 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 효모별로 침전물의 중량을 측정하였다. 침전물을 3차 증류수로 희석하고, 다시 원심분리하여 배지성분을 제거한 다음, 침전물과 3차 증류수를 1:2(w/w)로 혼합하여, -70 ℃에서 냉동한 후 동결건조기로 건조하여 중량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 이때, 각각의 효모에 대하여 3번의 반복실험을 수행하였고, 각각의 실험에서 얻은 건체량은 1차, 2차, 3차로 표기하여 나타내었다.

효모번호	1차 건체량 (㎎/500ml)	2차 건체량 (㎎/500ml)	3차 건체량 (㎎/500ml)	평균 수율 (㎎)
SCHY-1	983	1067	1025	1025±34.29
SCHY-2	884.7	870.3	877.5	877.5±5.88
SCHY-17	750.6	701.1	721.8	724.5±20.30
SCHY-19	756.9	750.6	756.9	755.1±2.97
SCHY-20	856.8	756.9	806.4	806.4±40.78
SCHY-21	998.1	762.3	880.2	880.2±96.26
SCHY-24	884.7	756.9	820.8	820.8±52.17
SCHY-82	818	922	870	870±42.46
SCHY-141	877.5	771.3	828	825.3±43.39
SCHY-142	806.4	721.8	764.1	764.1±34.54
SCHY-143	856.8	785.7	820.8	820.8±29.03
SCHY-152	905	930	918	918±10.21
SCHY-155	848	841	848	845±3.3
SCHY-159	805	870	838	837±26.54
SCHY-161	892	882	887	887±4.08
SCHY-164	811	810	811	811±0.47
SCHY-165	834	745	790	790±36.33
SCHY-167	812	905	859	859±37.97
SCHY-169	762	810	786	786±19.6
SCHY-170	514	425	470	470±36.33
SCHY-171	786	851	819	819±26.54
SCHY-172	1091	910	1,001	1001±73.89
SCHY-178	672	518	595	595±62.87
SCHY-179	1015	940	978	978±30.62
SCHY-182	756	822	789	789±26.94
SCHY-183	512	490	501	501±8.98
SCHY-184	820	858	839	839±15.51
SCHY-185	798	771	785	785±11.03
SCHY-186	921	935	928	928±5.72
총 합계	817.75	815.1	817	817±1.1

표 4에 나타난 바와 같이, 우사 혹은 돈사로부터 분리된 SCHY-1, SCHY-152, SCHY-172, SCHY-179, SCHY-186 균주의 바이오매스(Biomass)량이 900 ㎎이상으로 높게 유지되고 있음을 확인하였다. 또한, SCHY-2, SCHY-21, SCHY-82, SCHY-155, SCHY-159, SCHY-161, SCHY-167, SCHY-171, SCHY-184 균주가 가장 생장이 우수하고, 높은 수율을 나타내고 있음을 확인하였다.

2) 효모 성장곡선 측정을 통한 효모 15종 선발

상술한 바와 같이 바이오매스(Biomass) 량이 많고 생장이 우수한 15종의 균주에 대하여, 성장률을 확인하기 위해 YM broth 15 ㎖에 접종(n=3)하여 0, 6, 12, 24시간 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3은 실시예 2의 1)로부터 1차 선정된 15종의 효모에 대한 성장률 곡선이다. SCHY-1; Kluyveromyces marxianus SCHY-1, SCHY-21; Saccharomyces cerevisiae SCHY-21, SCHY-82; Pichia kudriavzevii SCHY-82, SCHY-155; P. kudriavzevii SCHY-155, SCHY-159, Meyerozyma caribbica SCHY-159, SCHY-161; S. cerevisiae SCHY-161, SCHY-164; M. caribbica SCHY-164, SCHY-165; P. kudriavzevii SCHY-165, SCHY-167; S. cerevisiae SCHY-167, SCHY-169; Eremothecium coryli SCHY-169, SCHY-170; S. cerevisiae SCHY-170, SCHY-171; W. anomalus SCHY-171, SCHY-172; Candida albicans SCHY-172, SCHY-178; P. kudriavzevii SCHY-178 및 SCHY-186; S. cerevisiae SCHY-186.

도 3에 나타난 바와 같이 24 시간 배양 기준, 흡광도 2.0 이상인 효모는 SCHY-1, SCHY-21, SCHY-186이 확인되었고, 흡광도가 1.8 이상인 효모는 SCHY-82, SCHY-161, SCHY-165, SCHY-171, SCHY-172, SCHY-179로 확인되었다. 이는 앞서 측정한 바이오매스 및 건체량을 통해 선발된 균주와 경향이 유사함을 알 수 있다.

3) 형태학적 분석

우선 상기 선발된 효모를 주사전자현미경(Scanning electron microscopy, SEM)으로 관찰하기 위하여, sodium cacodylate trihydrate (Sigma, USA), glutaraldehyde (Daejung, Korea), hexamethyldisilazane (Sigma, USA), paraformaldehyde (Sigma, USA) 및 osmium tetroxide (Electron microscopy sciences, USA)를 사용하여 표본을 제작하였다. 주사전자현미경은 FM-SEM (JSM-7401F, JEOL, Japan)으로 촬영하였고, 구체적으로 동결건조된 효모를 Karnosky 고정액(0.1M sodium cacodylate buffer에 2% paraformaldehyde 및 2.5% glutaraldehyde, 4℃)에서 3시간 동안 전 고정한 후, 완충액(0.1M cacodylate buffer, pH 7.4)으로 10분씩 3회 세척한 다음, 1% osmium tetroxide (pH 7.2, 0.1M phosphate buffer, 4℃)에 2시간 동안 후고정 하였다. 이어서 완충용액으로 3회 세척하고, 50%, 70%, 80%, 90% 그리고 100%의 미리 냉각된 4℃ 에탄올 용액에서 탈수시킨 후, 표본을 준비한다. 준비된 표본은 hexamethyldislazene로 건조시키고, 이를 백금 스퍼터링을 이용하여 코팅한 후 FM-SEM으로 관찰하였다.

도 4는 선정된 효모 중에서 5종의 효모에 대한 SEM 사진이다. 도 4A, B는 야생효모(wild yeast strain) SCHY-1이고, 도 4C, D는 SCHY-161이며, 도 4E, F는 SCHY-165이며, 도 4G, H는 SCHY-171이며, 도 4I, J는 SCHY-21이다. A, C, E, G, I의 SEM 사진은 x 10000 배율로 촬영한 것이고, B, D, F, H, J의 SEM 사진은 x 1000 배율로 촬영한 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이 생장률이 우수하다고 선정된 효모의 형태학적 분석을 위해, 상기 15종의 효모 중에서 서로 종이 다른 효모 3개와 2 종류의 S. cerevisiae 효모를 선정하여 주사전자현미경(SEM)을 통해 외형구조의 세포벽, 크기, 미세구조 및 출아흔 등의 구조를 확인하였다. 동일한 배율에서 야생 효모의 특징을 비교한 결과, S. cerevisiae SCHY-161 및 S. cerevisiae SCHY-21는 구의 형태로 크기는 지름이 약 5 ㎛이었으며, K. marxianus SCHY-1은 타원체로 약 4 ㎛ 이하였다. Pichia kudriavzevii SCHY-165는 약 4 ㎛이었으며 Wickerhamomyces anomalus SCHY-171은 약 2.5 ㎛임을 확인하였다.

4) 결론

총 29종의 효모에서 생장률 측정 실험을 통해, 가장 성장이 우수하여 바이오매스(Biomass)량이 900 ㎎/ml이상으로 높게 유지되면서 24 시간 배양시 흡광도 2.0 이상인 2가지 균주인 SCHY-1 (Kluyveromyces marxianus strain TB7258)과 SCHY-21 (Saccharomyces cerevisiae ATCC4098)를 선정하였다.

실시예 3 내지 16. 다양한 방법을 통한 SCHY-1, 21의 효모 자가분해물 제조

효모(S. cerevisiae)의 최적 추출조건을 확인하기 위하여, SCHY-17 효모를 통해 다양한 물리화학적 및 효소적 처리한 후, 현미경으로 관찰하는 실험을 수행하였고, 그 결과 고압멸균, 균질화, 초음파, pH 조정, 가수분해효소 또는 파파인 효소 처리를 통해 제조된 효모 자가분해물에서, 유효한 자가분해가 발생하였음을 확인하였다. 이에 상기 선정된 2종의 효모에 대하여 상기 7가지 방법들을 각각 적용함으로써, 가장 최적의 효모 자가분해물을 얻을 수 있는 추출방법을 선정하고자 하였다.

우선, 다양한 방법으로 효모 자가분해물을 제조하기 전에, 이의 원재료가 되는, 상술한 과정을 통해 선정된 2종의 효모(SCHY-1 (Kluyveromyces marxianus strain TB7258), SCHY-21 (Saccharomyces cerevisiae ATCC4098)) 각각의 건체물을 준비한다. 구체적으로 효모를 YM broth에서 48시간 배양 후 1500 ㅧ g로 10분 동안 원심분리하고 상등액을 버렸다. 이후 남아있는 배지 성분을 제거하기 위해 30 ㎖ 증류수를 넣고 vortexing한 후에 다시 원심분리하고 상등액을 버렸다. 그리고 물 30 ㎖를 다시 넣은 후 freezing dryer (Hanil, Korea)를 통해 동결건조하여 효모 건체물을 얻었다. 상기 회수한 효모 건체물을 후술하는 각각의 방법으로 파쇄하여 효모 자가분해물을 제조하였고, 이는 하기 표 5에 정리하였다. 각각의 방법에 대해서는, 아래에 보다 상세하게 서술하였다.

구분	효모	처리조건	추출 및 자가분해 조건	pH	온도 (℃)	압력 (atm)	첨가량	처리시간
실시예 3	SCHY-1	물리적	고압멸균	5.0	121	1.5	-	80 min
실시예 4	SCHY-21
실시예 5	SCHY-1		균질화	5.0	4	1	-	15 min
실시예 6	SCHY-21
실시예 7	SCHY-1		초음파	5.0	4	1	-	10 min
실시예 8	SCHY-21
실시예 9	SCHY-1	화학적	pH 4.0	4.0	50	1	-	24 hr
실시예 10	SCHY-21
실시예 11	SCHY-1		pH 5.0	5.0	50	1	-	24 hr
실시예 12	SCHY-21
실시예 13	SCHY-1	생물학적	파파인 효소	6.0	50	1	0.5%	24 hr
실시예 14	SCHY-21
실시예 15	SCHY-1		단백질 분해효소	5.0	50	1	0.5%	24 hr
실시예 16	SCHY-21

1) 고압멸균(autoclave)

고압멸균기(autoclave)를 이용해 효모 자가분해물의 제조방법으로 효모 건체량 70 ㎎에 멸균한 탈이온수 5 ㎖(pH 5.0)를 넣고 완전히 혼합될 때까지 교하여 효모 현탁액을 제조하였다. 이때 상기 멸균 탈이온수는 121℃ 20분간 멸균(AC-12, autoclave, HYSC, Germany)하여 사용하였다. 산도는 NaOH 또는 HCl 용액을 사용하여 조정하였다. 이후 상기 효모 현탁액을 멸균(AC-12, Jeiotech, Korea)로 121℃ 15분간 autoclaving하여, 효모 자가분해물을 얻었다.

2) 균질화(homogenizering)

균질기(homogenizer)를 이용한 효모 자가분해물의 제조방법으로 상기 효모 건체량 70 ㎎에 멸균한 탈이온수 5 ㎖(pH 5.0)에 넣어 희석하고, 완전히 혼합될 때까지 교반하여 효모 현탁액을 제조하였다. 이후 상기 효모 현탄액을 Polytron PT 2100 호모게나이저(Kinematica AG Co., Switzerland)를 사용하여 15,000 rpm에서 15분간 균질화하여, 효모 자가분해물을 얻었다. 이때, 상기 효모 현탁액이 든 용기를 얼음욕조에 약 2.5 cm 정도 잠기도록 넣은 후, 일정한 온도(4 ℃)가 유지되도록 하였다.

3) 초음파( ultrasonicating )

초음파분쇄기(ultrasonicator)를 이용한 효모 자가분해물의 제조방법으로 효모 건체량 70 ㎎에 멸균 탈이온수 5 ㎖(pH 5.0)를 넣고 완전히 혼합될 때까지 교반하여 효모 현탁액을 제조하였다. 상기 효모 현탁액을 초음파 처리하기 위하여, ULH-700S 초음파파쇄기(Jeiotect Co., Korea)와 초음파를 발생시키는 티타늄 터미널(직경 19.1 mm)을 사용하였다. 구체적으로 4 ℃가 유지되도록 상기 효모 현탁액을 얼음욕조에 약 2.5 cm 정도 잠기게 담근 후, 초음파 파쇄기를 통해, 효모 현탁액을 주파수 20 kHz에 노출시켰다. 노출 조건은 1 초간 초음파처리와 9 초간 정지를 1 cycle로 총 10분간 반복 수행하였다.

4) pH 4.0을 통한 화학적 처리

화학적 처리를 통한 효모 자가분해물의 제조방법으로 pH 4.0 용액을 사용하였다. 구체적으로 효모 건체량 70 mg에 멸균 탈이온수 5 ㎖(pH 4.0)을 넣고 완전히 혼합될 때까지 교반하여 효모 현탁액을 제조하였다. 상기 효모 현탁액을 50 ℃, 150 rpm, 24시간 자가분해(autolysis)시켜, 효모 자가분해물을 제조하였다.

5) pH 5.0을 통한 화학적 처리

화학적 처리를 통한 효모 자가분해물의 제조방법으로 pH 5.0의 용액을 사용하였다. 구체적으로 효모 건체량 70 mg에 멸균 탈이온수 5 ㎖(pH 5.0)을 넣고 완전히 혼합될 때까지 교반하여 효모 현탁액을 제조하였다. 상기 효모 현탁액을 50 ℃, 150 rpm, 24시간 자가분해(autolysis)시켜, 효모 자가분해물을 제조하였다.

6) 가수분해효소 처리

가수분해효소(Protease, Streptomyces caespitosus 유래 단백질가수분해효소(Sigma, USA; Cat no. P-0384) 처리를 통한 효모 자가분해물의 제조방법으로, 효모 건체량 70 mg을 멸균 탈이온수 5 ㎖(pH 5.0)에 넣고 완전히 혼합될 때까지 교반하여 효모 현탁액을 제조하였다. 상기 효모 현탁액에 0.7 Unit/mg의 가수분해효소(protease)를 최종 농도 0.5%(250 mg)가 되도록 처리하고, 50 ℃ 150 rpm, 24 시간 반응시켜 효모 자가분해물을 제조하였다.

7) 파파인 효소 처리

파파인(Papain) 효소 처리를 통한 효모 자가분해물의 제조방법으로, 효모 건체량 70 mg을 멸균 탈이온수 5 ㎖(pH 5.0)에 넣고 완전히 혼합될 때까지 교반하여 효모 현탁액을 제조하였다. 상기 효모 현탁액에 1.8 units/mg의 파파인 효소를 최종 농도 0.5%(250 mg)가 되도록 처리하고, 50 ℃ 150 rpm, 24 시간 반응시켜 효모 자가분해물을 제조하였다.

실시예 17 내지 20. 사료첨가제(고상의 효모배양체)

1) 스타터-액체 배지

스타터를 개발하기 위하여 아래 표 6에 표기한 A-F의 조성을 하는 액체배지에서 균주를 배양한 결과, 성장이 가장 우수한 것은 B 조성의 액체배지였으며, 이를 스타터로 선발하여 고체배지에 첨가하였다.

구분 (unit; g)	액체 배양배지 (unit ; g)
구분 (unit; g)	A (PD Broth)	B (SUN broth)	C (NL broth)	D (ANT broth)	E (AA broth)	F (CM broth)
yeast extract		5	10	4	5	2.5
Soluble starch (potato)	4					5
Skim milk powder				10		2.5
peptone			5		10
Glucose	20	10	15	15	20	5
Malts		3				5
Salts		2	2	2	2	2
Minerals		2	2	2	2	2
total	24	22	34	33	39	24
스타터 (SCHY-1, SCHY-21)	5	5	5	5	5	5
Water	1000ml	1000ml	1000ml	1000ml	1000ml	1000ml

2) 스타터-고체 배지

효모의 고체배지의 조성은 아래 표 7과 같이 EP 옥수수, 대두박, 탈지분유, CSL (Corn steep liquor), 당밀, 포도당, 염 등을 적절하게 조성하여 G~M까지 배지조성을 한 후, 효모를 배양한 결과 I 고체배지가 가장 우수한 성장을 하여 효모배양체를 위한 고체배지로 선발하였다.

구분 (unit; g)	고체배지 조성
구분 (unit; g)	G	H	I	J	K	L	M
corn EP	800	800	800	800	800	800	800
soybean meal	800	800	800	800	800	800	800
SMP (Skimm Milk Powder)					25	25	25
CSL	-	25	25	25	-	25	25
molasses	-	-	25	25	-	25	25
glucose	-	-	-	25	-	-	25
salts	-	-	-	-	-	-	25
Minerals	10	10	10	10	10	10	10
스타터(SCHY-1, SCHY-21)	700	700	700	700	700	700	700

표 7에서 선발된 고체 발효 배지의 조성에서 효모 자가분해물(Yeast autolysate)을 첨가할 경우, 스타터와의 최적조성을 찾아 하기 표 8의 1 내지 12의 배지조성으로 배양한 결과, 최종적으로 하기 표 9에서의 고체발효배지 조성을 선발하였다.

구분 (unit; kg)	효모배양체를 위한 고체배지 조성
구분 (unit; kg)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
효모 자가분해물	-	30	-	30	-	30	-	30	-	30	-	30
Oat meal	500	500	500	500	1,000	1,000	1,000	1,000	-	-	-	-
Wheat gluten	500	500	500	500	-	-	-	-	1,000	1,000	1,000	1,000
Dry yeast	-	-	100	100	-	-	100	100	-	-	100	100
CSL/molasses	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
Salts/Minerals	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20
Steam or water	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
Starter	200	200	200	200	200	200	200	200	200	200	200	200

	구분(unit; kg)
	효모 자가분해물	oat meal	wheat gluten	dry yeast	CSL/ molasses	salts/ minerals	steam or water	* 스타터
실시예 17	SCHY-1을 고압멸균한 것(실시예 1)	500	500	100	50	20	100	200
	30
실시예 18	SCHY-1을 파파인 효소로 처리한 것(실시예 13)	500	500	100	50	20	100	200
	30
실시예 19	SCHY-21를 고압멸균한 것(실시예 2)	500	500	100	50	20	100	200
	30
실시예 20	SCHY-21 파파인 효소로 처리한 것(실시예 14)	500	500	100	50	20	100	200
	30
* starter ; Km(K. marxianus SCHY-1), Sc(S. cerevisiae SCHY-21), 복합균주(Km/Sc)를 사용함

발명에 따른 사료첨가제는 실시예 1, 2, 13, 14로부터 제조된 효모 자가분해물을 10% 첨가한 곡물 고체배지에 SCHY-1 및 SCHY-21 (Saccharomyces cerevisiae ATCC4098)을 혼합한 스타터를 10% 접종하여 2 일간 32 ℃에서 배양시켜, 건조시켜 제조된 고상배양체를 사용하였다. 그 구체적인 조성은 상기 표 6에 나타내었다.

실험예 1. 실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물에 대한 자가분해율 분석

우선, 효모의 자가분해정도를 분석하기 위하여, 세포 내 물질의 방출에 따른 파장을 측정하여, 이를 기반으로 분석한다. 구체적으로 각기 다른 방법으로 얻은 실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물을 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하고, 처리하기 전의 효모 현탁액 1 ㎖에서의 260 nm와 280 nm 흡광도를 대조군으로 하여, 비교하였다. 이때 효모 자가분해물은 원심분리(5000 ㅧ g, 5분, MiniSpin plus, Eppendorf, Hamburg, Germany) 한 후, 상등액을 분리하고, 여기에 물 또는 Tris-HCl 완충액으로 8배 희석한 다음 260 및 280 nm (UV-1800 UV / VIS, Rayleigh, Beijing, China)에서 흡광도를 측정하여 기록하였다. 각 파장에서 대조군과 효모 자가분해물의 흡광도 차이가 클수록 자가분해율이 상승한 것으로 볼 수 있다. 이때 260 nm는 핵산 흡광도이고, 280 nm는 수용성 단백질의 흡광도이다.

1) 260 nm 흡광도 분석 결과

앞서 설명한 실시예 3 내지 16으로부터 제조된 효모 자가분해물에 대하여 8)의 자가분해율 측정법으로 분석한 결과를 표 10과 도 5에 나타내었다. 도 5는 효모 SCHY-1, SCHY-21으로 제조된 효모 자가분해물(실시예 3 내지 16)을 260 nm로 측정하여 나타낸 그래프이다.

구분	흡광도	구분	흡광도
대조군 (Control)	0.51±0.00	대조군 (Control)	0.46±0.00
실시예 7	0.81±0.00	실시예 8	0.66±0.02
실시예 5	1.58±0.01	실시예 6	0.60±0.01
실시예 3	1.72±0.00	실시예 4	1.67±0.01
실시예 15	1.76±0.02	실시예 16	2.90±0.12
실시예 13	2.94±0.10	실시예 14	3.42±0.18
실시예 11	1.46±0.01	실시예 12	1.30±0.00
실시예 9	1.70ㅁ0.02	실시예 10	0.69ㅁ0.03

도 5 및 표 10에 나타난 바와 같이, SCHY-1 또는 SCHY-21 효모를 통해, 상술한 다양한 방법으로 효모 자가분해물을 제조하고, 이에 대하여 자가분해율을 분석한 결과, 고압멸균 처리를 통해 제조된 효모 자가분해물(실시예 3, 4)의 260 nm에서 흡광도가 1.7로 가장 높았고, 파파인 효소 처리를 통해 제조된 효모 자가분해물(실시예 13, 14) 역시 흡광도 약 3.28로 매우 높은 것을 확인하였다. 다만 효모의 종류에 따라서는 대부분 유사하였으나, SCHY-1 효모를 처리하여 제조된 효모 자가분해물(실시예 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15)의 자가분해율이 SCHY-21 효모를 처리하여 제조된 효모 자가분해물(실시예 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16)보다 높음을 확인하였다.

2) 280 nm 흡광도(자가분해율) 분석 결과

앞서 설명한 실시예 3 내지 16의 방법으로 제조된 효모 자가분해물에 대하여 상기 자가분해율 측정법으로 분석한 결과를 표 11과 도 6에 나타내었다. 도 6은 효모 SCHY-1, SCHY-21으로 제조된 효모 자가분해물(실시예 3 내지 16)을 280 nm로 측정하여 나타낸 그래프이다.

구분	흡광도	구분	흡광도
대조군 (Control)	0.31±0.00	대조군 (Control)	0.22±0.00
실시예 7	0.48±0.00	실시예 8	0.27±0.00
실시예 5	0.26±0.00	실시예 6	0.62±0.00
실시예 3	1.41±0.00	실시예 4	0.69±0.00
실시예 15	1.59±0.00	실시예 16	0.71±0.02
실시예 13	1.87±0.37	실시예 14	2.17±0.14
실시예 11	0.53±0.00	실시예 12	0.53±0.00
실시예 9	0.23±0.01	실시예 10	0.23±0.01

도 6 및 표 11에 나타난 바와 같이, SCHY-1 또는 SCHY-21 효모를 통해, 상술한 다양한 방법으로 효모 자가분해물을 제조하고, 이에 대하여 자가분해율을 분석한 결과, 고압멸균 처리를 통해 제조된 효모 자가분해물(실시예 3, 4)의 280 nm에서 흡광도가 최대 1.41로 가장 높았고, 파파인 효소 처리를 통해 제조된 효모 자가분해물(실시예 13, 14) 역시 흡광도 약 2.0로 매우 높은 것으로 확인되었다. 즉, 본 발명을 통해 선정된 SCHY-1 효모와 SCHY-21 효모를 이용해 효모 자가분해물을 제조할 경우, 고압멸균 처리 혹은 파파인 효소 처리를 통해 얻은 효모 자가분해물이 가장 바람직한 것을 알 수 있다.

실험예 2. SCHY -1 효모, 이의 효모 자가분해물에 대한 형태학적 분석

1) 비파쇄 SCHY-1 효모의 형태학적 분석

동결건조 후 상온에서 보관된 K. marxianus SCHY-1 효모를 주사전자현미경(SEM)으로 형태를 관찰하였다. 도 7은 K. marxianus SCHY-1 효모의 SEM 사진으로, 이에 따르면 SCHY-1 효모는 불규칙한 형태와 크기를 가지고 있음을 확인하였다. SCHY-1 효모는 크기 분포가 약 5-7㎛ 또는 약 2-4㎛ 정도이고, 직경이 상대적으로 크면 둥글고 타원형을 유지하였으나, 상대적으로 직경이 작은 경우에는 표면이 고르지 않은 것을 확인하였다. 동결건조시 SCHY-1 효모는 60% 이상 형태를 유지하고 있는 것으로 확인되었고, 효모가 수용액 속에 분산되었을 때에는 세포 간 거리 및 밀도를 일정하게 유지하는 것을 확인하였다.

2) 실시예 3으로부터 제조된 효모 자가분해물에서 효모의 형태학적 분석

실시예 3으로부터 제조된 효모 자가분해물을 주사전자현미경(SEM)으로 형태를 관찰하였다. 도 8은 실시예 3으로부터 제조된 효모 자가분해물의 SEM 사진으로 이에 따르면, 고압멸균에 의해 얻은 효모 자가분해물에는 규칙적인 형태와 크기를 갖는 SCHY-1 효모가 존재하는 것으로 확인되었다. 상기 SCHY-1 효모 크기는 직경 약 2-3 ㎛ 정도로, 둥글고 타원형이였다. SCHY-1 효모를 고압멸균으로 처리하면, 높은 압력에 의해 효모들 간 밀도가 증가함에 따라 크기와 형태가 일정해진 것으로 여겨진다.

또한 SCHY-1 효모들 사이에, 효모의 파쇄에 의해 유출된 당 성분 등이 위치함으로써, 공동을 메우고 생물막과 유사한 구조를 형성하게 되는데, 이는 부분적으로 세포막이 파괴된 소수성 proteoglycan 복합체의 영향인 것으로 유추된다.

3) 실시예 13으로부터 제조된 효모 자가분해물에서 효모의 형태학적 분석

실시예 13으로부터 제조된 효모 자가분해물을 주사전자현미경(SEM)으로 형태를 관찰하였다. 도 8은 실시예 13으로부터 제조된 효모 자가분해물의 SEM 사진으로 이에 따르면, 불규칙한 형태와 크기를 갖는 것으로 확인되었다. 파파인 처리를 통해 얻은 효모 자가분해물에 존재하는 파쇄된 SCHY-1 효모는 직경 4-7㎛ 정도인 것으로, 비분해 효모와 비교시 효모 간 거리가 가깝고, 부분적으로 함몰된 부분이 많은 것으로 확인되었다. 또한 파파인 처리를 통해 얻은 효모 자가분해물에 존재하는 파쇄된 SCHY-1 효모는 수백 개의 효모가 서로 응집되어 하나의 군집을 이루는 것을 확인하였다. 이는 파파인 효소에 의해 효모의 단백질이 분해되면서 당단백질 성분 등이 세포벽 밖으로 흘러나와 효모 간에 결합을 유도하기 때문으로 여겨진다.

실험예 3. 실시예 3 내지 실시예 16의 효모 자가분해물에 대한 성분 분석

1) Total-glucan 함량 분석

실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물을 각각 동결건조하고, 이들 각각의 분말에 대하여 total-glucan 함량을 분석하고자 하였다.

상기 분말을 1.0 mm(100 μm)체에 통과시켜, 분쇄한 후, 분쇄물 90 mg을 20ㅧ125 mm 시험관(Fisher Brand cμLture tube)에 넣었다. 상기 시험관에 황산 2.0 ml(12 M)을 넣고, 시험관 마개를 닫은 후, 충분히 교반한 다음, 4 ℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이어서 볼텍스 장치를 이용해 충분히 교반한 후, 물 4 ml를 넣고, 교반하고 물 6 ml를 첨가하고 교반하는 과정을 반복하였다. 파파인 효소와 효모를 비활성화하기 위해 고온으로 가열한 뒤, KOH 용액(10 M) 6 ml와 200 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5)를 총 부피 100 ml가 되도록 첨가하였다. 이의 분획을 얻은 후, 1500 g, 10 분으로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 회수한 침전물을 0.1 ml씩 분획하여 200 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)을 넣고 제1 용액[exo-1,3-β-glucanase (20 U/mL) 및 β-glucosidase(4 U/mL) 혼합물] 0.1 ml를 첨가하고, 완전히 교반하여 40 ℃, 60 분 동안 배양하였다. 여기에 GOPOD 시약 3.0 ml를 첨가하고 40 ℃, 20분 동안 추가 배양한 다음, 시약바탕시료(reagent blank)에 대응하는 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) α-Glucan 함량 분석

실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물을 각각 동결건조하고, 이들 각각의 분말에 대하여 α-Glucan 함량을 분석하고자 하였다.

상기 분말을 체로 거른 후, 정확히 100 mg를 20 x 125 mm 피셔 브랜드 배양용 시험관(Fisher Brand cμLture tube)에 넣었다. 여기에 2 M KOH을 2 ml 첨가하고, 자석 교반막대(5 x 15 mm)를 이용해 교반한 후, 1.2M 아세트산나트륨 완충액(pH 3.8) 8 ml를 첨가하였다. 이어서 제2 용액[amyloglucosidase(1,630 U/mL) 및 invertase(500 U/mL) 혼합물] 0.2 ml를 넣고, 잘 섞어준 후 항온수조에서 40 ℃로 유지시켰다. 반응이 완료된 다음, 1500 g에서 10분 동안 원심분리 한 후, 상등액을 회수하고, 최종 부피가 10.3 ml가 되도록 부피를 조절한다. 상기 상등액 0.1 ml에 200 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0) 0.1 mL와 GOPOD 시약 3.0 mL을 첨가하고, 40 ℃에서 20분 동안 배양한 다음 시약바탕시료에 대응하는 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도로부터 α-Glucan 함량은 Megazyme Mega-Calc TM을 사용하여 계산하였다.

3) Glactomannan 함량 분석

실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물을 각각 동결건조하고, 이들 각각의 분말에 대하여 Glactomannan 함량을 분석하고자 하였다.

상기 분말을 0.5 mm 체에 거린 후, 100 mg에 80 %(v/v) 에탄올 5 mL를 넣고 교반한 후, 85-90 ℃에서 5 분간 가열하였다. 여기에 에탄올 5 mL를 추가하고 1,500 g에서 10 분간 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 침전물(pellet)을 회수하였다. 회수한 침전물에 에탄올 5 ml를 첨가하고 현탁하는 과정을 3차례 반복한 후, 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 회수한 침전물에 100 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)(Buffer B) 8 ml를 첨가하여 재현탁하고, 교반하였다. 이어서 반응을 종료시키기 위해 끓는 물에 넣고, 실온에서 식히는 과정을 2차례 반복하였다. 충분히 식힌 후, β-mannanase 현탁액(제3 용액) 10 μl를 넣고 30초 동안 교반하고, 60분 동안 40 ℃에서 반응시켰다. 증류수로 최종부피를 맞춘 후, 분획물을 회수하여 1,500 g에서 10 분간 원심분리하였다. 얻은 상등액을 340 nm 파장에서 분광광도계로 측정하였다. 이때 blank는 D.W를 사용하였다.

4) α-Amylase 함량 분석

실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물을 각각 동결건조하고, 이들 각각의 분말에 대하여 α-Amylase 함량을 분석하고자 하였다.

상기 분말 3 g에 buffer A(pH 5.4) 20 mL를 넣은 후 40℃에서 20분 동안 간헐적으로 섞어주면서 효소를 추출한 후 원심분리(1,000 g, 10분) 하였다. 이와 동시에 Stansdard 시료인 맥아(Malt) 0.5 g에 제1용액을 100 ml를 넣고 약 20분 동안 상온에서 교반한 후, 원심분리(1,000 g, 10분) 하여, 용해액을 제조하였다. 상기 용해액 0.5 ml를 buffer A(pH 5.4) 9.5 ml에 넣어 ㅧ10 희석액을 제조하고, 이와 동일한 방식으로 ㅧ1 맥아 희석액을 준비하였다.

다음으로 상기 원심분리한 시료(침전물) 1 g에 buffer A(pH 5.4) 50 ml를 넣고 약 15분 동안 부드럽게 저어 준 후, 원심분리(1,000 g, 10분) 하였다. 1.0 ml를 버퍼액 9.0 ml에 넣어 ㅧ10 희석액을 제조하고, 이와 동일한 방식으로 ㅧ1 희석액을 준비하였다.

Amylase HR Reagent solution 실험을 수행하기 위하여, 상기 시료 희석액 6 ml(ㅧ1, ㅧ10)을 40 ℃, 5분 동안 전배양(pre-incubate)한 후, 시료 희석액 또는 맥아 희석액을 0.2 ml씩 분취하여 준비해두었다. 각각에 Amylase HR Reagent solution 0.2 ml를 첨가하고, 40 ℃, 10분 동안 배양한 다음, 반응종료 시약(Stopping Reagent)을 3.0 ml 첨가하여, 용액의 흡광도(at 400 nm)을 ELISA로 기록하고, 대비값(Con.)으로 증류수에 대하여 blank 흡광도 측정를 측정하여, 아래 식 1을 통해 계산하였다. α-Amylase 활성(Units/g Flour) 계산은 다음과 같다.

[식 1]

5) Protease 함량 분석

실시예 3 내지 16의 효모 자가분해물을 각각 동결건조하고, 이들 각각의 분말에 대하여 Protease 함량을 분석하고자 하였다.

Microplate well에 100 μl Succinylated casein solution을 첨가하고, blank로 Assay Buffer 100 μl를 사용하였다. 상기 Succinylated casein solution이 첨가된 웰에 50 μl 상기 분말을 첨가하였다. 실온에서 20 분간 반응시킨 후, TNBSA Working solution을 50 μl 첨가하고, 20 분간 배양한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도와 blank의 흡광도를 뺀 450nm에서 흡광도 변화량(ΔA₄₅₀)을 계산하였다. 이때, 상기 blank에도 시약이 모두 동일하게 첨가되었다. 또한 상기 ΔA₄₅₀는 protease의 단백질 분해 활성에 의해 나타난 흡광도 수치를 의미한다. 상기 흡광도 변화량을 검정곡선에 대입하여 protease 함량을 계산하였다.

6) 결론

상기 효모 자가분해물에 대하여 Total-glucan, β-Glucan, α-Glucan, Glactomannan, α-Amylase 및 Protease의 함량을 측정하였고, 이를 하기 표 9과 도 10 및 11에 나타내었다.

구분	-Glucan	Glactomannan	-Amylase	Protease
구분	ppm	ppm	U/g	U/g
대조군 (Control)	155.59±6.79	189.2±17.55	154.3±3.92	595.85±6.08
실시예 3	178.57±16.03	174.15±1.76	79.9±7.68	269.1±67.61
실시예 5	143.87±1.65	184.9±14.04	140.53±3.45	445.05±50.7
실시예 7	147.45±9.36	189.2±3.51	106.22±5.37	445.05±50.7
실시예 9	78.67±9.86	204.25±5.27	136.3±3.07	595.13±4.23
실시예 11	107.31±8.02	184.9±7.02	168.73±0.38	538.2±16.9
실시예 13	66.88±7.4	301.0±14.04	358.5±3.84	1001.37±95.07
실시예 15	149.92±9.4	202.1±10.54	213.98±24.25	884.925±88.74

표 12과 도 10, 11에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 효모 자가분해물(autoclave)의 경우, β-glucan이 178.57 ppm으로 가장 많은 것으로 확인되었다. 허나 대조군(control)보다 glactomannan 함량(174.15 ppm)이 낮았고, α-amylase 및 protease의 활성도 79.9 및 269.1 U/g로 낮은 것을 확인하였다.

이에 반해 파파인 효소로 처리한 실시예 13의 효모 자가분해물(Papain)은 β-glucan의 수득은 다소 낮았으나(66.88 ppm), glactomannan의 수율(301.0 ppm)과 protease(358.5 U/g) 및 α-amylase(1001.37 U/g)의 활성이 높은 것을 확인하였다. 즉, 실시예 13으로부터 제조된 효모 자가분해물이 대조군에 비해 β-Glucan의 함량은 제외한 전체 함량측면에서 약 1.5 배 이상의 우수한 효율을 가지고 있음을 확인하였다.

실험예 4. 사양실험-육계

1) 실험동물 준비

사양시험은 충청남도 천안시 동남구 안서동에 소재하는 육계농장에서 실시하였다. 시험사료는 NRC(1994) 요구량에 따라 배합한 옥수수-대두박 위주의 사료를 급여하였다. 1일령 ROSS 308 병아리를 768수 공시하여 3단 케이지에서 사육하였으며, 사료와 물은 자유채식으로 하였고, 처리구별 위치를 조절하였다. 시험개시 체중은 37 ㅁ 0.51 g으로 35일간 실시하였다. 시험설계는 대조군(Control group, Cont)에게 Basal diet로 섭식시켰고, 제1 실험군(Experimental group, T1)에는 Basal diet에 0.1% 신바이오틱 이스트 컬처(사료첨가제)를, 제2 실험군(Experimental group, T2)에는 0.2% 신바이오틱 이스트 컬처(사료첨가제)를 첨가하여 섭식하도록 하였으며, 3 그룹에 대하여 처리당 12회 반복, 반복당 16수씩 완전 임의 배치하였다. 이때, 상기 신바이오틱 이스트 컬처(사료첨가제)는 실시예 18에 따라 제조된 것을 사용하였다.

표 13은 3단계별 닭에 대한 섭취기준에 따른 배합사료의 기본성분조성을 나타낸 것이다. 하기 1 배합사료는 0~7 일령의 닭에 대한 일반 초이사료이고, 2 배합사료는 7~21 일령의 닭에 대한 전기 시험사료이며, 3 배합사료는 21~35 일령의 닭에 대한 후기 시험사료이다.

혼합성분 (Ingredients(중량%))	배합사료
혼합성분 (Ingredients(중량%))	1~7일령	7~21일령	21~35일령
Corn	51.96	55.64	56.38
Soybean meal	35.96	26.04	18.41
Canola meal	5.00	10.00	15.00
Animal fat	2.50	3.80	5.40
MDCP	-	1.20	1.10
DCP	1.50	-	-
Limestone	1.15	1.30	1.20
L-lysine	0.43	0.50	0.74
DL-Methionine	0.41	0.41	0.51
L-Threonine	0.19	0.20	0.32
L-Tryptophan	-	0.01	0.04
NaHCO3	0.10	0.10	0.10
Salt	0.30	0.30	0.30
Vitamin premix	0.20	0.20	0.20
Mineral premix	0.20	0.20	0.20
Choline	0.10	0.10	0.10
Total	100	100	100
계산된 성분 (Calculated composition)
ME, kcal/kg	3,000	3,100	3,200
CP, %	23.76	21.28	19.98
CF, %	4.82	6.31	8.02
Lys, %	1.5	1.28	1.25
Met, %	0.72	0.66	0.71
AP, %	0.45	0.42	0.40
Ca, %	0.92	0.84	0.80

¹완전식이 요법 1 kg당 제공량 : 11,025 IU 비타민 A; 1,103 IU 비타민 D3; 44 IU 비타민 E; 4.4 mg 비타민 K; 리보플라빈 8.3mg; 50 mg 니아신; 4 mg 티아민; 29 mg d- 판토텐산; 콜린 166 mg; 33 μg 비타민 B12.

²완전식이 요법 1 kg 당 제공량 : 12 mg Cu(CuSO₄ㅇ5H₂O); Zn 85 mg(ZnSO₄); 8 mg Mn(MnO₂); 0.28 ㎎ I(KI); 0.15 mg Se(Na₂SeO₃ㅇ5H₂O).

2) 증체량(BWG), 사료섭취량(FI) 및 사료요구율(FCR)

증체량은 개시시, 1~7일령, 7~21일령 및 21~35일령에 각 그룹별로 체중을 측정하였다. 사료섭취량은 체중 측정시 사료급여량에서 잔량을 제하여 계산하였고, 사료요구율은 사료섭취량을 증체량으로 나누어 산출하였다. 모든 자료는 SAS(1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다.

표 14은 본 발명에 따른 실시예 18의 사료첨가제를 0.1%, 0.2% 혼합하여 제조된 배합사료를 영계에 투여한 후, 증체량, 사료섭취량 및 사료요구율을 측정하여 나타낸 것으로, 이에 따르면 7-21일차 일당증체량에 있어 제2 실험군이 대조군보다 유의적으로 높은 것을 확인하였고(P<0.05), 사료요구율은 대조군이 제1 실험군 및 제2 실험군보다 유의적으로 높음을 확인하였다(P<0.05). 21-35 일차 일당증체량에 있어 제2 실험군이 대조군보다 유의적으로 높았고(P<0.05), 전체적으로 일당증체량은 제2 실험군이 대조군보다 유의적으로 높은 것으로 관찰되었으며(P<0.05), 사료요구율은 대조군이 제2 실험군보다 높은 것으로 확인되었다(P<0.05).

구분	대조군 (CON)	제1 실험군 (TRT1)	제2 실험군 (TRT2)	SEM²
1~7일령
BWG, g	90	92	91	2
FI, g	106	103	105	1
FCR	1.183	1.128	1.153	0.025
GF	0.85	0.89	0.87	0.019
7~21일령
BWG, g	652^b	672^ab	678^a	9
FI, g	1030	1022	1025	9
FCR	1.583^b	1.522^b	1.513^a	0.016
GF	0.63^b	0.66^a	0.66^a	0.007
21~35일령
BWG, g	986^b	1009^ab	1035^a	15
FI, g	1775	1807	1802	22
FCR	1.800	1.794	1.743	0.024
GF	0.57	0.56	0.56	0.008
총합
BWG, g	1728^b	1774^ab	1805^a	16
FI, g	2910	2932	2932	26
FCR	1.695^a	1.655^b	1.625^b	0.012
GF	0.59^b	0.60^ab	0.62^a	0.005
Motality, %
INO³	192	192	192	-
FNO³	184	189	189
Survival	95.83^b	98.44^a	98.44^a	0.76

²표준오차

³INO는 각 그룹에서 초기 살아있는 영계의 수

³FNO는 각 그룹에서 마지막까지 살아있는 영계의 수

^a,b같은 행에 다른 위첨자가 존재하는 경우, 다른 의미를 갖는다(P<0.05).

3) 분내 악취물질

육계의 분내 가스 조성은 실험 35일째 각 그룹에서 동일한 시간동안 배설된 분을 채취하여 암모니아, 황화수소 및 총 메캅탄을 분석하였다. 구체적으로 암모니아, 황화수소 및 총 메캅탄의 측정은 분 300 g을 취하여 2,600 ml 부피의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 24 시간 발효시킨 후, 실온에 5 일간 보관하면서 Gastec(Model GV ?? 100, Gastec, Japan)으로 암모니아, 황화수소 및 총 메캅탄에 대한 검지관(No. 3L, No. 4LT 및 No. 70L, Gastec, Japan)을 사용하여 측정하였다. 모든 자료는 SAS(1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다.

육계 배합사료 내에 실시예 18의 사료첨가제를 첨가할 경우, 육계의 분내 악취물질에 미치는 영향을 분석하여 도 12에 나타내었다. 구체적으로 도 12는 대조군(CON), 제1 실험군(TRT1) 및 제2 실험군(TRT2)의 분내 가스 조성을 분석하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면, 분내 암모니아에 있어 대조군이 제2 실험군보다 유의적으로 높게 나타남을 확인하였다(P<0.05).

4) 분내 미생물 조성

실험 35일째 각 그룹에서 동일한 시간동안 배설된 분을 채취하여, 멸균된 생리식염수에 현탁하여 균질화시킨 다음, 10-3에서 10-6까지 계단 희석하여 생균수 측정용 시료로 사용하였다. 실험처리에 의한 육계 분내의 Lactobacillus 및 E. coli 균수를 측정하기 위해 Lactobacillus에는 MRS agar(Difco, USA)를, E. coli은 MacConkey agar(Difco, USA)를 사용하여 37 ℃에서 38 시간 배양후 균수를 측정하여 표 12에 나타내었다. 모든 자료는 SAS(1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다.

Items, log₁₀cfu/g	대조군 CON	제1 실험군 TRT1	제2 실험군 TRT2	SEM²
Lactobacillus	7.08b	7.33ab	7.4a	3.51
E. coil	6.65a	6.42b	6.35b	4.92

²표준오차

표 15에 나타난 바와 같이, Lactobacillus에 있어 제2 실험군(TRT2)이 대조군(CON) 보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). E.coli에 있어 대조군(CON)이 제1 실험군 및 제2 실험군보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

5) 항문지수(vent score)

실험 35일째 각 그룹별로 항문의 더러운 정도를 육안으로 측정하였다. 구체적으로 항문지수(Score)는 매우 깨끗한 1부터 매우 더러운 3까지의 수치로 측정하여 표 16에 나타내었다. 모든 자료는 SAS (1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 처리하여 평균 간의 유의성을 검정하였다.

표 16에 나타난 바와 같이 설사빈도를 나타내는 항문지수에는 대조군과 제1 실험군 및 제2 실험군 간에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(P>0.05). 이는 본 발명에 따른 사료첨가제를 첨가한 사료를 급여하더라도 설사에 유발하거나, 이와 관련된 질환을 유도하지 않는다는, 안정성을 확인한 것이라 할 수 있다.

구분	대조군 CON	제1 실험군 TRT1	제2 실험군 TRT2	SEM²
항문지수 vent score	1.37	1.29	1.32	0.05

²표준오차

6) 육질특성 및 장기무게

실험 35일째 각 그룹별로 4수씩 선별하여 경골탈퇴 방법으로 도살한 다음 간, 비장, 근위, F낭, 가슴육 및 복강지방의 무게를 측정하여 생체중에 대한 비율로 계산하였다. pH는 pH meter(77P, Istek, Korea)를 사용하여 측정하였으며, 육색은 색차계(Model CR-210. Minolta Co., Japan)를 이용하여 각 가슴육 샘플 1개당 2회 반복하여 측정하였다. 이때 표준 색판은 L=89.2, a=0.921, b=0.783으로 하였다. 보수력(water holding capacity)은 Hofmann 등(1982)의 방법으로 전체면적과 육의 면적의 비율을 기록하여 측정하였으며, 각 샘플당 2개의 시료를 만들어 Drip loss를 측정하였다. Drip loss는 4℃에서 1일, 3일, 5일 및 7일간 냉장 보관하면서 발생되는 감량을 측정하여 표 14에 나타내었다. 모든 자료는 SAS(1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다.

표 17에 나타난 바와 같이 육질특성 및 장기무게에 있어서 처리구간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 이를 통해 본 발명에 따른 사료첨가제가 육질이나 장기에 독성을 나타내고 있지 않음을 확인하였다.

구분	대조군 CON	제1 실험군 TRT1	제2 실험군 TRT2	SEM²
pH 수치	5.86	5.76	5.79	0.15
가슴근육 색깔
Lightness(L*)	52.25	53.72	55.23	1.37
Redness(a*)	10.26	10.34	10.45	0.56
Yellowness(b*)	9.17	9.51	9.79	0.57
Cooking loss, %	34.65	33.84	31.41	2.60
WHC, %	54.03	52.48	51.07	2.42
Drip loss, %
1일 보관	2.70	2.64	2.60	0.19
3일 보관	5.58	5.45	5.36	0.10
5일 보관	8.64	8.57	8.44	0.22
7일 보관	10.48	10.22	10.13	0.24
장기무게, %
가슴근육	18.30	18.42	18.57	0.14
간	2.88	2.90	2.95	0.13
파브리키우스 소낭 (F낭)	0.10	0.12	0.13	0.01
복부지방	3.39	3.56	3.67	0.31
비장	0.10	0.13	0.14	0.02
모래주머니	1.22	1.18	1.14	0.07

²표준오차

실험예 5. 미생물 균총분석 결과

실시예 18로부터 제조된 사료첨가제가 급여된 육계의 분변에서 장내 미생물을 분리한 결과, 총 44 종의 문(phylum), 1,690 종의 미생물이 분석되었다. 대다수의 서열은 Firmicutes, Proteobacteria, Bacterioidetes, Actinobacteria 중 하나였으며, 속(genus) 수준의 우점종은 Lactobacillus, Arthromitu, Romboutsia였다.

표 18는 실시예 18로부터 제조된 사료첨가제가 육계의 장내 미생물에 미치는 영향을 분석한 것으로, 육계 사양실험에 따른 Lactobacillus 및 E. coli, Salmonella 의 증감에서 Lactobacillus는 1차에서 41.53% 증가율(대조군 대비 제1 실험군 및 제2 실험군)을 나타내었고, 2차에서 27.68% 증가율(대조군 대비 제1 및 제2 실험군)을 보였다. 이에 반해 E. coli 및 Salmonella는 확인되지 않았다. Lactobacillus 속은 대조군보다 제2 실험군에서 유의적으로 높게 확인되었고(P < 0.05), E. coli은 대조군이 제1, 2 실험군에서보다 유의적으로 증가하였음을 확인하였다(P < 0.05). 이를 통해 Lactobacillus가 E. coli 생장을 억제하고 있음을 알 수 있다.

본 발명에서 실시예 18의 사료첨가제(효모배양물)을 급여한 경우, Salmonella가 대조군이나 제1, 2처리군에서 모두 검출되지 않아 증감여부를 확인할 수는 없었으나, E. coli 균수가 대조군에 비하여 감소하였고, Lactobacillus은 증가하였으며, Salmonella 역시 검출되지 않았음을 통해 본 발명의 사료첨가제가 가축의 장내 미생물에 긍정적 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.

균주	대조군 대비 성장률(%)
Lactobacillaceae(Lactobacillus)	1^st up 41.53%, 2^nd up 27.68%
Enterobacteriaceae(E. coli)	검출되지 않음
Salmonella	모든 그룹에서 검출되지 않음

종합하면, 실시예 18의 사료첨가제를 투여하지 않은 대조군(Cont)과 제1, 2 실험군(T1, T2)군의 장내 미생물 군집의 다양성은 상기 언급한 바와 같으며, 구체적으로 즉, 제1, 2 실험군은 대조군과 비교하여 Firmicutes 미생물군이 상대적으로 많았으며, Lactobacillus도 제1 실험군(95.85 ± 1.71%)과 제2 실험군(98.05 ± 0.43%)이 대조군보다 현저히 많았다. 또한 E. coli(18.27 ± 5.95%)이 우위를 점하고 있는 대조군과는 달리 제1, 2 실험군은 Lactobacillus를 비롯한 Bacteroides(22.09ㅁ2.91%)와 Clostridium(20.51ㅁ1.16%)가 지배적임을 확인하였고, 제2 실험군은 Bacteroides(33.21 ㅁ 5.13%)의 비율이 가장 높음을 확인하였다. 즉 본 발명에 따른 사료첨가제를 급여시킬 경우, 가축의 장내에 존재하는 유익한 미생물의 생장을 촉진하고, 우점화하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

실험예 5. 사양실험-젖소

1) 실험동물 준비

사양실험은 연암대학 축산과(충남 천안시 서북구 성환읍 수향리)의 가축축사에서 4주 간에 걸쳐 실시하였으며, 시험사료는 TMR(Total Mixed Ration, 완전혼합 사료)를 급여하였다. 실험동물은 젖소(Bos taurus) 총 10마리를 사용하였다, 이중 5마리는 대조군(Control group, Cont), 나머지 5 마리는 제1 실험군(Experimental group, T1)으로 나누어 각각의 연령 및 성별을 확인하였다(표 16). 사료와 물은 자유 섭식토록 하였다. 실험은 대조군에 일반사료(Basal diet)(TMR)만 섭식시켰고, 제1 실험군은 0.2% 사료첨가제(실시예 18)를 혼합한 TMR 배합사료를 급여하였다. 이때 상기 사료첨가제는 실시예 18로부터 제조된 것을 사용하였다.

Ingredients (%)	일반사료 (Basal diet)	사료첨가제를 포함하는 배합사료
Ingredients (%)	대조군	제1 실험군
효모배양물¹ ⁾	0	0.2
야생효모 자가분해물² ⁾	0	0.2
일반사료 조성
Yellow corn	53.44	53.24
Soybean meal	33.65	33.65
Corn gluten meal	4.16	4.16
Soybean oil	4.68	4.68
Limestone	1.02	1.02
Tricalcium phosphate	2.01	2.01
Salts	0.25	0.25
DL-Methionine(99%)	0.27	0.27
Lysine-HCl(98%)	0.02	0.02
Vitamin-Mineral mixture³ ⁾	0.50	0.50
Water	20	20
Total	100.00	100.00
Calculated value
ME (kcal/kg)	3,100	3,100
Crude protein (%)	22.0	22.0
Lysine (%)	1.10	1.10
Methionine (%)	0.87	0.87
Methionine + cystine (%)	0.50	0.50
Ca (%)	1.00	1.00
Available P (%)	0.50	0.50

¹⁾효모배양물은 10% 효모 자가분해물(실시예 13) 및 곡물을 포함하는 배지에 10% 스타터(SCHY-1 + SCHY-2)를 접종하고, 2 일동안 32 ℃에서 배양하고 건조하여 얻은 실시예 18의 사료첨가제이다.

²⁾야생효모 자가분해물은 SCHY-1과 SCHY-21을 파파인 효소로 처리하여 얻은 것이다.

³⁾Vitamin-mineral mixture provided following nutrients per kg of diet : vitamin A, 15,000 IU : vitamin D3, 1,500 IU : vitamin E, 20.0 mg; vitamin K3, 0.70 mg : vitamin B12, 0.02 mg : niacin, 22.5 mg : thiamin, 5.0 mg : folic acid, 0.70 mg : pyridoxin, 1.3 mg : riboflavin, 5 mg : pantothenic acid, 25 mg : choline chloride, 175 mg : Mn, 60 mg : Zn, 45 mg : I, 1.25 mg : Cu, 10.0 mg : Fe, 72 mg : Co, 2.5 mg.

2) 폐사율 및 설사빈도

폐사율은 실험기간 동안 착유우의 폐사유무를 조사하여 계산하였고, 설사 빈도는 사료급여 시, 그룹별로 설사발생 유무를 확인한 후, 분변상태에 따라 설사 지수를 측정하여, 하기 표 20에 나타내었다.

실험기간	대조군 Control		제1 실험군 (T1)
실험기간	설사빈도 (diarrhea frequency)	설사지수 (Diarrhea index)	설사빈도 (diarrhea frequency)	설사지수 (Diarrhea index)
Intial	0	0	0	0
1 weeks	1	2	0	0
2 weeks	0	0	0	0
3 weeks	1	3	1	2
4 weeks	1	2	1	2
Total	0.6	2.3	0.4	2.0

표 20에 나타난 바와 같이, 각 그룹별 설사빈도와 설사지수를 측정한 결과, 실험기간에 따라 설사발생빈도(두수)가 없거나 1두가 발생함을 확인하였다. 평균 설사빈도 및 설사지수를 비교하면 대조군보다 제1 실험군이 다소 낮은 값을 유지하고 있음을 알 수 있다. 또한 시험시간 동안 대조군과 제1 실험군 모두에서 설사가 발생하였지만, 이는 일부에 불구하고 젖소의 심한 질병발생이나 폐사율은 나타나지 않았다.

3) 유량 분석

유량은 오전 및 오후 착유를 끝내고 그룹별 착유량을 기록하여 일일 착유량을 계산하여 표 21에 나타내었다.

실험기간	대조군(kg)	제1 실험군(kg)
Intial	38.7	39.1
1 weeks	36.5	38.8
2 weeks	35.7	37.8
3 weeks	34.3	36.7
4 weeks	33.9	36.6
Total	35.8	37.8

표 21에 나타난 바와 같이 본 발명의 배합사료를 급식시킨 후, 유량은 전 기간동안 대조군 대비 증가한 것을 확인하였다.

4) 유성분 분석

유성분은 실험전, 실험 2주후 및 실험 4주후에 그룹별 우유를 채취하여 유성분과 체세포수를 분석하였다.

성분	그룹	Initial	2 weeks	4 weeks	평균
유지율(%)	대조군	3.6	3.2	3.5	3.4
유지율(%)	제1 실험군	3.6	3.5	3.7	3.6
유단백질 비율(%)	대조군	3.0	2.9	3.0	2.9
유단백질 비율(%)	제1 실험군	2.8	2.9	2.9	2.9
무지고형물 (%)	대조군	8.8	8.7	8.8	8.8
무지고형물 (%)	제1 실험군	8.7	8.8	8.8	8.8
MUN(mg/dL)	대조군	18.9	15.6	14.3	16.3
MUN(mg/dL)	제1 실험군	16.4	12.9	11.6	13.6
Somatic cell numbers (X 1,000 cells/)	대조군	124.2	90.8	176.8	130.6
Somatic cell numbers (X 1,000 cells/)	제1 실험군	72.8	68.0	115.2	85.3

표 22에 나타난 바와 같이, 착유 후 대조군과 제1 실험군의 유지를 분석하였다. 그 결과 대조군보다 제1 실험군이 유지율이 더 높은 것을 확인하였다. 다만 유단백율과 무지고형물은 그룹별 차이가 없었다. MUN(milk urea nitrogen)의 경우, 우유 내 요소태 질소함량인 MUN의 적정 수준은 12 ~ 18 mg/dL인데, 대조군과 제1 실험군 모두 적정수준을 유지하고 있었으나, 상대적으로 제1 실험군이 더 낮은 MUN 수치를 유지함을 확인하였다. 즉 본 발명의 사료첨가제는 장내 악취를 감소시켜 MUN 수치가 낮게 나타나는 것으로 여겨진다. 실험이 진행된 후, 대조군과 제1 실험군으로부터 얻은 우유 내 체세포수는 상대적으로 제1 실험군이 더 낮은 것으로 확인되었다.

젖소에 본 발명에 따른 사료첨가제(효모 자가분해물에 효모를 접종 및 배양하여 건조시켜 얻은 효모배당체와 효모 자가분해물)을 급여하였을 때, 산유량 및 유지율이 증가하는 것은, 사업적인 측면에서 동일하거나 낮은 사료소비를 통해 우수한 품질의 우유를 생산할 수 있다는 점에서 매우 우수한 장점이라 할 것이다.

본 발명에서 효모는 젖산 같은 유기산이나 산소와 결합하려는 성질을 가져, 생체 내 섭취시 pH를 상승시켜 주는 완충제로 작용하므로, 혐기성 박테리아, 특히 섬유소 분해 박테리아의 증식을 촉진시키고 사료 소화율을 높이며 우유의 생산을 촉진하고 유성분 내 지방 함량 향상에 도움을 줄 수 있음을 알 수 있다. 나아가 효모 자가분해물에는 필수아미노산, 비타민 B군, 광물질, sterols, 유도지방 및 소화효소 등이 풍부하게 들어 있어, 효모의 성장증식 과정 및 자가분해 시 배출되는 소화효소와 대사물질이 가축의 생산성 증대 및 소화율을 향상시키는 작용을 한다는 것을 확인하였다.

5) 혈액성분 분석

혈액성분 분석을 위해 실험을 개시한 시점, 14일이 지난후, 28일이 지난후에 각 그룹별(n=2)로 동일한 개체에서, 동일한 시간(오전 11시~12시)에 경정맥에서 10 ㎖ 주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 4 ℃에서 15 분간 원심분리하고, 혈청만을 분리하여 -20 ℃ 보관하였다.

혈액 내 백혈구 수는 EDTA(K2 EDTA, BD VacutainerTM, USA) 항응고 처리된 튜브에, 앞서 설명한 바와 같이 그룹별로 각 기간에 따라 경정맥에서 전혈을 채집하고, 이를 자동화 혈구 측정기인 Hematology Analyze (Advia 120 Bayer, Siemens, USA)로 측정하였다. 채혈한 혈액 중 일부는 항응고제인 EDTA-2K가 들어있는 CBC bottle에 주입한 후 자동혈액분석기(ADVIA 2120, SIEMENS, USA)를 이용하여 아래 열거한 항목에 대하여 표 23의 방법으로 검사하였다. 혈액 분석 항목은 Red blood cell(RBC), Platelet count(PLT), Hematocrit(HCT), White blood cell(WBC), Red cell distribution width(RDW), Hb conc. distribution width(HDW), Hemoglobin concentration(HGB), Neutrophil(NEUT), Mean corpuscular volume(MCV), Lymphocyte(LYM), Mean cell hemoglobin(MCH), Monocyte(MONO), Mean cell hemoglobin concentration(MCHC), Eosinophil(EOS), Mean platelet volume(MPV), Basophil(BASO), Reticulocytes(RET), Large unstained cells (LUC), Cell hemoglobin concentration mean(CHCM), neutrophil(NEU), eosinophil(EOS), Platelet distribution width(PDW)를 분석하였다.

전혈(CBC;cemplete blood count)에서 혈액분석
혈액성분	단위	분석방법
WBC	×10³/㎕	Flowcytometry
RBC	×10⁶/㎕	Flowcytometry, Isovolumetry
HGB	g/dL	Modified CN met-Hb method
HCT	%	(RBC×MCV)÷10
MCV	fl	Histogram
MCH	Pg	(HGB÷RBC)×10
MCHC	g/dL	[HGB÷(RBC×MCV)]×1000
RDW	%	Histogram
HDW	g/dL	Histogram
PLT	×103/㎕	Flowcytometry
MPV	fl	Histogram
RET	%	Flowcytometry, Isovolumetry
WBC에서 백혈구 분화인자 분석
혈액성분	단위	분석방법
NEU	%	Flow cytometry, Peroxidase staining
LYM	%
MONO	%
EOS	%
BASO	%
LUC	%	Noise-Lymph Histogram

표 24은 섭취 사료를 구분하는 환경 하에서 CBC 파라미터 변화를 분석한 결과를 정리하여 나타낸 것이다.

성분	Initial		14 day (2 week)		28 day (4 week)
성분	대조군	제1실험군	대조군	제1실험군	대조군	제1실험군
적혈구
RBC, x 10⁶ cells/	6.46±4.04	6.14±0.41	6.30±0.63	6.40±0.29	6.44±0.51	6.36±0.49
HGB, g/dL	10.9±0.74	10.4±0.87	10.5±1.21	10.4±0.99	10.4±1.22	10.1±1.18
HCT, %	31.4±1.35	29.54±2.42	30.7±3.44	30.9±2.64	30.9±3.06	30.3±3.02
MCV, fl	48.5±3.90	48.1±3.28	48.6±0.84	48.3±3.45	47.9±1.11	47.7±3.45
MCH, pg	16.9±0.44	16.9±1.19	16.6±0.47	16.2±1.38	16.1±0.58	15.9±1.34
MCHC, g/dL	34.7±0.77	35.±20.61	34.2±0.76	33.6±0.46	33.6±0.83	33.4±0.60
RDW, %	19.1±0.61	19.±20.54	19.5±0.64	19.0±0.38	19.0±0.90	19.2±0.43
HDW, %	2.71±0.22	2.72±0.13	2.81±0.11	2.68±0.16	2.66±0.12	2.6±70.21
CHCM, g/dL	34.3±0.38	34.4±0.40	34.3±0.35	34.3±0.38	34.8±0.23	34.5±0.50
백혈구, K/ml
WBCB, x10³ cells/	10.63±4.04	13.54±5.99	10.94±4.06	13.93±5.68	10.38±3.89	14.3±7.60
NEU	34.8±10.6	25.6±10.5	34.9±11.4	26.68±.54	34.8±14.0	30.1±9.03
LYM	55.8±10.2	51.1±7.98	54.4±12.2	59.84±10.76	51.4±10.6	58.3±10.52
MONO	0.2±0.04	0.3±0.15	0.2±0.07	0.38±0.37	0.4±0.22	0.34±0.39
EOS	8.3±1.4	6.6±3.4	9.5±3.35	12.0±6.3	11.9±6.29	9.9±6.0
LUC	0.06±0.08	0.1±0.06	0.08±0.04	0.08±0.04	0.04±0.05	0.14±0.10
BASO	0.8±0.2	0.9±0.3	0.9±0.3	1.0±0.4	1.5±0.4	1.22±0.42
혈소판
PLT, K/ml	355±131	410±63	364±43	389±120	317±61	405±108
MPV, fl	7.5±0.5	7.3±0.2	6.7±0.3	6.9±0.3	8.7±0.9	8.6±0.7
PDW, %	58.7±8.14	51.8±3.24	52.3±3.94	51.24±2.31	62.7±3.80	58.6±4.38
PCT, %	0.26±0.09	0.30±0.04	0.25±0.03	0.26±0.07	0.28±0.05	0.34±0.09

표 24에 나타난 바와 같이 기본 사료를 섭취한 대조군에서는 적혈구 관련 항목에서 적혈구 농도(RBC) 및 HCT 수치가 처음에는 감소하였다가, 2주 후에는 회복하지 못하다가, 4주후에 약간 증가하는 것을 확인하였다. 이에 반해, 대조군에서 MCV, RDW, HDW, CHCM 수치는 증가하였다가 감소하는 것을 볼 수 있고, HGB, MCH, MCHC는 지속적으로 감소하는 것으로 확인되었다.

백혈구 관련항목에서는 대조군에서 약 2주간 백혈구 농도(WBC) 수치에 변화가 없다가, 이후 LYM 비율이 지속적으로 감소되었고, MONO 비율은 4주 후에 2배이상 급증하였다. 호산구(EOS) 비율은 8.3%에서 9.5%로 그리고 11.9%로 지속적으로 증가하였고, 호염기구(BASO) 비율도 0.8%에서 0.9%로 증가하였다가 1.5%로 크게 증가하였다.

대조군에서 혈소판 항목은, 혈소판 농도(PLT)가 2주 간 355 K/㎖에서 364 K/㎖로 증가하였다가 4주 후 317 K/㎖로 눈에 띄게 감소하였으며, MPV 및 PDW 수치는 혈소판 농도(PLT)에 반비례하여 증가하는 것을 확인하였다.

0.2% 사료첨가제가 배합된 사료를 식이한 제1 실험군의 경우, 적혈구 항복에서, 적혈구 농도 수치가 2.4 × 10⁵ cells/㎖ 만큼 증가하다가 4.0 × 10⁴ cells/㎖ 차이로 유지되고 있음을 확인하였고, 이는 효모배양물이 첨가된 사료가 적혈구의 생성을 촉진하는 등 혈액 생성에도 긍정적인 영향을 미치고 있음을 보여주는 것이다.

백혈구 관련 항목에서는 백혈구 농도(WBC)를 비교하면, 제1 실험군이 대조군보다 1.38% 더 증가하였으며, 4주가 지난 후에는 6.72% 더 증가하였음을 확인하였다. NEU 비율은 2주 후 4.22%, 4주 후 17.58%로 증가되었으며, 이는 면역활성이 증가되었음을 나타내는 것이다. LYM의 경우 2주 후 17.1%, 4주 후 14.09%로 역시 증가하였으며, 이는 대조군과 달리 제1 실험군은 선천성 및 후천성 면역력이 지속적으로 강화되었음을 의미하는 것이다. EOS 비율은 2주 동안 기존의 거의 두 배에 가까운 수치인 5.4% 만큼 증가하여 대조군(1.2% 증가)보다 극적으로 더 염증억제 반응이 일어났음을 알 수 있다.

혈소판 항목에서, 혈소판 농도 등 수치에서는 유의미한 변화를 확인하지 못하였으나 전체 기간 동안 제1 실험군이 대조군에 비해 유의미하게 높은 수치를 보임을 확인할 수 있었다.

6) 젖소 혈청 내 IL-2(Interleukin 2) 분석

Bovine IL-2(Interleukin 2)를 분석하기 위하여 Mybiosource사의 IL-2 ELISA Kit(MBS700611, mybiosource, USA)를 사용하였다. 키트 내 모든 농축 시약은 1배 농도로 희석하여 사용하였고, Standard는 0.5 ㎖씩 마이크로튜브에 담은 후, standard 500 μl를 덜어 2,000 pg/㎖부터 2배씩 7단계까지 희석하여 준비해두었다. 각 웰에 100 ㎕씩 7개의 standard 용액 또는 10개의 시료를 넣은 후, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 시료나 stnadard 내에 존재하는 IL-2는 웰상에 존재하는 고정화된 항체와 결합되고, 상기 결합된 IL-2를 검출하기 위해, 이에 특이적인 Biotin conjugated antibody(biotin-antibody) 및 detection reagent A 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 흡인 후, 세척용액 200 ㎕를 사용하여 3차례에 걸쳐 수세하고, Avidin conjugated horseradish peroxidase(Avidin-HRP) 및 detection reagent B 100 μl를 첨가하여, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 흡인 후 5차례 수세하였다. TMB 기질 90 μl를 넣고 37 ℃에서 10-20분 동안 반응시키면 Bovine IL-2 성분과 결합한 biotin-antibody 및 HRP-avidin을 함유하는 웰만이 색 변화를 나타낸다. 반응 종료 시약 50 ㎕을 첨가한 다음, 즉시 450 nm의 파장에서 분광 광도계로 측정하여 표 25에 나타내었다.

Initial, ㎍/㎖		14 day, ㎍/㎖ (2 week)
대조군	53.94±43.59	대조군	39.34±24.68
제1 험군	53.14±54.82	제1 실험군	56.75±53.46

표 25에 나타난 바와 같이, 대조군은 Bovine IL-2의 혈중 농도가 2주 동안 27.08% 감소하였으나, 제1 실험군에서는 6.79% 증가하였음을 확인하였다, 이는 본 발명에 따른 사료첨가제가 선천성 면역성을 강화시키고 있음을 의미하는 것이다.

7) 소 혈청 내 IgA(Immunoglobulin A)

각 그룹별 젖소로부터 혈액을 채취하고, 마이크로튜브를 사용해 분취한 후, 30 분 동안 상온에 두어, 응고시켰다. 이후 이를 1,000 ㅧ g로 15 분간 원심분리하여, 상등액을 취(aliquot)하고 -20℃ 이하에서 보관하였다.

우선, 제1 실험군의 혈청 내 IgA(Immunoglobulin A)의 농도를 분석을 하기 위해 Abbexa사의 IgA ELISA Kit(ABIN2534862, abbexa, USA)를 사용하였다. 모든 시약은 사용 전 ㅧ1 농도로 희석하여 준비하였고, Standard는 0.5 ㎖씩 마이크로튜브에 미리 넣어둔 후, 500 ㎕ 분취하여 50 ng/㎖부터 2배씩 희석하여 7단계 희석하여 준비해두었다. 각 웰에 100 ㎕씩 7개의 standard 용액 또는 10개의 시료를 넣은 후, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 시료나 stnadard 내에 존재하는 IgA는 웰상에 존재하는 고정화된 항체와 결합되고, 상기 결합된 IgA를 검출하기 위해, 이에 특이적인 Biotin conjugated antibody(biotin-antibody) 및 detection reagent A 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 흡인 후, 세척용액 350 ㎕를 사용하여 3차례에 걸쳐 수세하고, Avidin conjugated horseradish peroxidase(Avidin-HRP) 및 detection reagent B 100 ㎕를 첨가하여, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음 흡인 후 5차례 수세하였다. TMB 기질 90 μl를 넣고 37 ℃에서 10-20분 동안 반응시키면 Bovine IgA 성분과 결합한 biotin-antibody 및 HRP-avidin을 함유하는 웰만이 색 변화를 나타낸다. 반응 종료 시약 50 ㎕을 첨가한 다음, 즉시 450 nm의 파장에서 분광 광도계로 측정하여 표 26에 나타내었다.

Initial, ㎍/㎖		14 day, ㎍/㎖ (2 week)
대조군	54.97ㅁ0.37	대조군	51.21ㅁ0.33
제1 실험군	59.71ㅁ0.77	제1 실험군	72.43ㅁ0.41

표 26에 나타난 바와 같이, 대조군은 Bovine IgA의 농도가 2주 동안 6.84% 감소하였으나, 제1 실험군에서는 21.3% 증가하였음을 확인하였다, 이는 본 발명에 따른 사료첨가제가 체액성 면역성을 강화시키고 있음을 의미하는 것이다.

8) 분변 내 미생물 조성

각 그룹별로, 시기에 따라 분변을 채취한 뒤, 멸균된 생리식염수에 현탁하여 균질화시킨 다음, DNA를 추출하여 PCR 증폭(amplification) 및 Illumina sequencing하였다. PCR 증폭은 추출된 DNA로 16S rRNA 유전자의 V3 내지 V4 영역을 표적으로 하는 Primer를 사용하여 수행 하였다. 박테리아 증폭을 위해, 341F(5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAC -AGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 해당 서열은 표적 부위 프라이머를 나타낸다) 및 805R(5'-GTCTCGTGGGCTCGGGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGG -TATCTAATCC-3') 프라이머를 사용하였다. 증폭은 다음 조건 하에서 수행하였다: 95 ℃에서 3 분간 초기 변성시킨 후, 95 ℃에서 30 초 동안 변성시키고, 55 ℃에서 30 초 동안 Primer annealing을 하고, 72 ℃에서 30 초간 연장하고, 72 ℃에서 5 분간 최종 신장시켰다. 이어서, Illumina NexTera 바코드를 부착하기 위하여 2차 증폭을 i5 정방향 프라이머(5'-AATGATACGG -CGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCGGCAGCGTC-3'; X는 바코드 영역을 나타냄) 및 i7 역방향 프라이머(5'-CAAGCAGAAGACGGCA -TACGAGATXXXXXXXXAGTCTCGTGGGCTCGG-3')를 사용하였고, 이때 반응조건은 증폭 사이클을 8로 설정하는 것을 제외하고는 상기 증폭반응과 동일하게 진행하였다.

상술한 과정을 통해 얻은 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에 전기영동하였고, Gel Doc 시스템(BioRad, Hercules, CA, USA) 하에서 시각화하였다. 증폭된 생성물은 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)로 정제하였다. 동등한 농도의 정제된 제품을 함께 모으고 ampure beads kit(Agencourt Bioscience, MA, USA)로 짧은 단편(비표적 제품)을 제거 하였다. DNA 7500 칩을 사용하여 Bioanalyzer 2100(Agilent, Palo Alto, CA, USA)에서 품질 및 제품 크기를 평가하였다. 혼합된 amplicon을 pooling하고 시퀀싱(sequencing)은 Chunlab, Inc.(Seoul, Korea)에서 Illumina MiSeq sequencing system(Illumina, USA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. Miseq 직교 서열분석 방법(Miseq pipeline Method)에 의한 원시 읽기 처리를 통해 품질을 확인하고 트리밍(0.321)으로 낮은 품질(<Q25)의 세트를 필터링하였다. QC(Quality Control)를 통과시킨 후, 쌍방향 시퀀스 데이터는 PandaSeq2를 사용하여 병합하였다. 프라이머는 ChunLab의 사내 프로그램으로 유사성을 0.8로 줄였다. Mothur's3 사전 클러스터링(clustering) 프로그램을 사용하여 시퀀스를 병합하고, 시퀀스 간에 최대 2개의 차이를 허용하는 고유 시퀀스를 추출하였다. EzTaxon 데이터베이스는 BLAST 2.2.224를 사용하여 분류법(taxonomic assignment)에 사용하였고, pairwise alignment 5는 유사성을 계산하는데 사용하였다.

Uchime6과 EzTaxon의 비-키메라 16S rRNA 데이터베이스는 유사성이 97% 미만인 유사성이 있는 읽기에서 키메라를 탐지하는 데 사용하였다. 이어서 CD-Hit7 및 UCLUST8을 사용하여 시퀀스 데이터를 클러스터링(Clustering)하고 α-diversity 분석을 수행하여, 각 그룹으로부터 채취한 분변으로부터 미생물 균총 변화를 확인하였다. 그 결과 총 29 종의 목(phylum), 2544 종의 분류군이 검출되었다. 대다수의 서열은 Firmicutes, Actinobacteria, Bacterioidetes, Euryarchaeota, Saccharibacteria_TM7, Tenericutes, Proteobacteria 중 하나에 속하고 있음을 확인하였다. 속(genus)에서 우점종은 Paeniclostridium, Romboutsia, Turicibacter인 것으로 확인되었다.

또한, 각 그룹별(실험 초기의 대조군(cont-i), 실험 2주 후의 대조군(cont-14d), 실험 3주 후의 대조군(cont-28d) 및 실험 2주 후의 제1 실험군(T1-14d), 실험 3주 후의 제1 실험군(T1-28d))로부터 채취한 분변 내 미생물 군집이 매우 다양함을 확인하였다. Firmicutes 균은 대조군에 비해 상대적으로 제1 실험군에서 더 많았으며, Lactobacillus 균은 제1 실험군에서 95.85 ㅁ 1.71%임을 확인하였다. 구체적으로 대조군은 E. coli 균이 18.27 ㅁ 5.95%로 우점하고 있는데 반해, 제1 실험군에서는 Lactobacillus 외 Bacteroides 균(22.09 ㅁ 2.91%)과 Clostridium 균(20.51 ㅁ 1.16%)이 지배적이었고, 이중에서도 Bacteroides(33.21 ㅁ 5.13%)의 비율이 가장 높았음을 확인하였다.

대부분 바실러스, 락토바실러스, 포도상구균 등 다양한 균총을 포함하는 Firmicutes 문의 미생물이 가장 많았고, 대조군에서는 2주 동안 79.76%에서 88.03%로 증가하였으나, 4주가 지나자 감소하여, 최종적으로 초기에 비해 3.6% 증가한 것으로 관찰되었다. 이에 반해 제1 실험군에서는 2주에서 4주로 가는 동안 8.4% 감소한 것으로 확인되었다. Actinobacteria는 대조군에서는 1.7~3.6% 감소하였으나, 제1 실험군에서는 4% 증가하였다. Proteobacteria는 대조군에서 증가하다가 4주 후에는 0.11% 감소하였고, 제1 실험군에서는 2% 감소하다가 더 큰폭으로 감소하였다. Saccharibacteria_TM7는 대조군에서 0.16~0.23% 감소하였으나, 제1 실험군에서 2.7% 증가하였다. Fibrobacteres는 대조군에서 0.009~0.01% 감소한 반면, 제1 실험군에서는 0.004% 증가하였다. 이러한 측정된 결과를 하기 표 27에 정리하였다.

문(phylum)	대조군, % (Basal feed)			제1 실험군, % (0.2% yeast additive feed)
문(phylum)	Cont-i	Cont-14d	Cont-28d	T1-14d	T2-28d
Firmicutes	79.76	88.03	83.35	69.67	61.28
Actinobacteria	7.61	3.74	5.94	7.30	11.43
Bacteroidetes	6.26	4.81	3.97	10.15	9.18
Euryarchaeota	3.40	0.90	3.90	3.59	7.48
Proteobacteria	0.32	0.56	0.21	2.83	0.84
Saccharibacteria _ TM7	0.93	0.77	0.70	3.52	6.32
Tenericutes	0.93	0.57	1.22	2.09	2.84
Spirochaetes	0.63	0.52	0.49	0.53	0.36
Synergistetes	0.01	-	0.00	0.16	0.11
Cyanobacteria	0.05	0.00	0.03	0.02	0.03
Streptophyta	0.00	0.00	0.05	-	0.00
Fibrobacteres	0.03	0.02	0.02	0.00	0.01
Verrucomicrobia	0.00	0.00	0.02	0.02	0.01
Fusobacteria	0.00	0.00	-	0.01	0.00
Lentisphaerae	0.00	0.01	-	0.01	0.01
Planctomycetes	0.00	0.00	0.01	0.01	0.00
Acidobacteria	-	0.00	-	-	0.00

9) 균주 균총 변화(Species level)

균주의 균총 변화를 관찰하여, 하기 표 28에 나타내었다.

	대조군						제1 실험군
	Cont-i		Cont-14d		Cont-28d		T1-14d		T1-28d
	Counts	Ratio	Counts	Ratio	Counts	Ratio	Counts	Ratio	Counts	Ratio
Lactobacillaceae_uc	3	0.0058	-	-	1	0.0019	7	0.0128	2	0.0028
Lactobacillus	161	0.3089	34	0.0918	131	0.2445	482	0.8828	468	0.6575

이에 따르면 대조군에서는 Lactobacillaceae를 포함하여 다수의 과를 포함하는 계, Firmicutes에서 증가하였다가, 4주 후에는 다시 감소하는 것을 확인하였다. 결국 대조군은 실험을 시작하기 전과 균주 균총의 변화가 거의 없는 것으로 확인되었다. 제1 실험군은 2주부터 감소되기 시작하였다.

Lactobacillus는 대조군에서 실험 초(0.4%), 2주 후(0.15%) 및 4주 후(0.32%)까지 큰 변화가 관찰되지 않았다. 이에 반해 제1 실험군에서는 T1 처리구에서는 2주 후(1.04%) 및 4주 후(1.42%)까지 비율이 현저히 증가하고 있음을 확인하였다. 그러나 Escherichia coli 및 Salmonella에서는 관찰되지 않았다.

상기 각각의 그룹에서 채취한 분변에서, 분리한 Lactobacillus에 속하는 각각의 균주(Lactobacillaceae_uc)에서의 비율을 나타낸 차트를 도 13에 나타내었다. 구체적으로 도 13a는 초기상태의 대조군과 제1 실험군(cont-i, T1-i)에 대한 차트이고, 도 13b는 2주 후의 대조군과 제1 실험군(cont-14d, T1-14d)에 대한 차트이며, 도 13c는 4주 후의 대조군과 제1 실험군(cont-28d, T1-28d)에 대한 차트이다. 이에 따르면 Lactobacillus에 속하는 각각의 균주는 대조군에서는 L. farciminis group이 5%로 우세하였다가 2주 후(4%) 및 4주 후(6%) 크게 감소하였으며, 이와는 달리 L. hilardii group은 초기 26%에서 47% 및 60%로 증가하였음을 확인하였다. L. panis group도 5%에서 32% 및 27%로 증가하여 우점하고 있음을 알 수 있다.

이에 반해 제1 실험군의 경우, L. hilardii group 및 L. panis group은 각각 49% 및 25%에서 25% 및 6%로 절반 혹은 그 이하의 비율까지 감소하였으며 L. farciminis group은 8%에서 42%로 5배 증가하였음을 확인하였다.

Claims

Kluyveromyces marxianus를 파파인 효소로 처리하여 제조되는 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 Kluyveromyces marxianus 및 Saccharomyces cerevisiae를 접종 배양시킨 효모배양물;를 포함하고,
상기 효모배양물은 고형분을 기준으로 가축사료에 0.1 내지 0.5 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제.
제1항에 있어서,
상기 사료첨가제 1 중량부를 기준으로, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생효모를 1 중량부 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제.
제1항에 있어서,
상기 사료첨가제 1 중량부를 기준으로 효모 자가분해물 1 중량부 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제.
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제1항에 따른 면역증강용 사료첨가제를 포함하는 배합사료.
(ⅰ) Kluyveromyces marxianus에 파파인 효소를 처리하여 효모 자가분해물을 제조하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 효모 자가분해물을 포함하는 고체 배지에 Kluyveromyces marxianus 및 Saccharomyces cerevisiae를 접종, 배양시켜 효모배양물을 수득하는 단계;를 포함하는 면역증강용 사료첨가제의 제조방법.
삭제
제9항에 있어서,
상기 사료첨가제 1 중량부를 기준으로, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia kudriavzevii로부터 선택되는 어느 하나 이상의 생효모를 1 중량부 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 (ⅰ) 단계의 고압멸균 처리는 100 내지 150 ℃, 10 내지 30 분간 고압멸균처리를 통해 자가분해시켜 수행되고,
상기 (ⅰ) 단계 가수분해 효소 처리는 1 내지 3 units/mg 가수분해 효소를 첨가하여 20 내지 70 ℃, 1 내지 30 시간 배양하여 자가분해시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 사료첨가제의 제조방법.
삭제
제9항에 있어서,
(ⅲ) 상기 효모배양물을 동결건조하는 단계를 더 포함하는 면역증강용 사료첨가제의 제조방법.