KR100416192B1 - 된장에서 분리한 바실러스 메가테리움 ｐｓ352 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환경 친화적이며 동물사료용 첨가제로 유용한 균주 바실러스 메가테리움 PS352 (Bacillus megateriumPS352)와 그 균주를 유효성분으로 함유하는 사료용 첨가제 및 사료에 관한 것이다.

본 발명에 의한 PS352 균주는 여러 병원성 미생물에 대해 강한 항균력이 있고, 다양한 사료 첨가용 항생제에 대해서도 내성을 지닌다. 또한 담즙산 및 인공 위액에 대해서도 내성을 지녔으며 다양한 범위의 pH 와 열에 대해서도 안정적으로 생존 가능하다. 또한 고체발효에서 전분분해효소, 단백질분해효소, 자일란분해효소, 펙틴분해효소, 글루칸분해효소와 인산분해효소를 높은 역가로 생산한다.

따라서 본 발명에 의한 균주에 의하여 저렴하고 우수한 사료첨가용 미생물 제제를 얻는 것이 가능하게 된다.

Description

된장에서 분리한 바실러스 메가테리움 ＰＳ352{A New Strain of Bacillus megaterium PS352 Isolated from Soy Sediment and A Probiotic Usage of the Strain}

본 발명은 환경 친화적이며 동물사료용 첨가제로 유용한 균주와 그 균주를 유효성분으로 함유하는 사료용 첨가제 및 사료에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 병원성 세균에 대한 항균력, 사료 첨가용 항생제 내성, 내담즙성, 인공 위액에 대한 내성 및 우수한 효소적 특성을 갖는 바실러스 메가테리움 PS352 (Bacillus megateriumPS352)균주 및 상기 균주를 함유하는 사료용 첨가제 및 사료에 관한 것이다.

프로바이오틱스 또는 프로바이오틱 균주(probiotics, probiotic strain)는 숙주의 장내에서 생존·생장하면서 장내 미생물 균총의 균형을 유지시키며 숙주에 유용한 각종 대사산물을 생산함으로써 숙주의 건강증진과 사료효율을 증대시키는 등의 효과를 보이는 살아있는 미생물 제제로 현재 동물용 사료 첨가제로서 널리 사용되고 있다.

이러한 프로바이오틱 균주가 유효하게 작용하기 위해서는 사료 등에 포함된 상태에서 숙주에 의해 섭취된 후 위와 십이지장을 통하여 장에 정상적으로 도달하여 정착해야 하므로 위액 및 담즙산에 대한 내성이 있어야 한다. 또한 사료에는 통상 다양한 종류의 항생제가 첨가되므로 이들 항생제에 대해서도 내성이 있어야 할 뿐만 아니라 다양한 균총으로 이루어진 숙주의 장내에서 생장하기 위해서는 장내의 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력이 있어야 한다. 나아가 숙주에 유용한 대사산물을 생산·분비해야 하므로 고농도의 효소 분비 또한 가축의 소화율 향상 및 환경 정화 측면에서 필수적인 요건이 되고 있다. 또한 통상 35~40℃에 이르는 숙주의 장내에서 우수한 생장특성을 보여야 한다.

그러나 현재까지 상기와 같은 프로바이오틱 균주로서의 특성을 완벽하게 갖춘 균주가 개발되어있지 않은 것이 현실이다. 대부분 기존의 고체발효를 통한 효소의 생산은 아스퍼질러스 속(Asergillussp.), 트라이코더마 속(Trichodermasp.), 바실러스 속(Bacillussp.) 등의 효소 생산 능력에만 치중하여 생산되어졌으므로 미생물을 포함한 고체 발효산물 자체를 프로바이오틱 용도(사료용 생균제)로사용하는 데 있어서는 그 안정성에 문제가 있었다.

본 발명은 병원성 미생물에 대한 강한 항균력, 위산에 대한 내성, 내담즙산성, 항생제 내성 및 열에 대한 안정성을 지닐 뿐만 아니라 다양한 효소를 고농도로 분비하는 환경 친화적 균주, 상기 균주가 함유된 사료용 첨가제 및 사료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 의한 균주의 분리·동정 과정을 보여주는 흐름도.

도 2a는 본 발명에 의한 균주의 pH에 대한 안정성을 보여주는 그래프.

도 2b는 본 발명에 의한 균주의 온도에 대한 안정성을 보여주는 그래프.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 병원성 미생물에 대한 항균력, 사료 첨가용 항생제와 담즙, 인공 위액에 대한 내성 및 넓은 pH 및 온도범위에서 생장이 가능한 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352) (KFCC 11179), 상기 균주를 함유하는 사료용 첨가제 및 상기 균주를 함유하는 사료에 관한 것이다.

본 발명에 의한 상기 균주는 한국의 전통발효식품인 된장에서 분리하였다.

재래식 시장에서 판매자가 직접 제조한 된장을 구입하여 적절한 분량의 된장을 순차희석 도말법을 사용하여 된장에 존재하는 다양한 미생물을 얻었다. 이 후 형성된 군집을 성상별로 분리하여 이를 다시 영양한천배지에 도말한 후 단일 군집을 분리하는 과정을 반복하였다.

그리고 분리된 단일 균주들 중 플레이트에서의 효소 활성 측정법을 통해 가장 높은 전분분해효소와 단백질분해효소 활성을 나타내는 균주인 PS352를 분리하였다.

분리균 PS352는 포자를 형성하는 막대형 세균으로서 운동성이 있는 그람양성균이었다. 분리한 균주에 대하여 일반적인 실험방법에 의거하여 그람염색, 산화효소, 카탈라아제, 각종 단백질의 생산 등 생화학적 특성 및 균주의 세포벽 지방산 성분을 분석한 결과, 분리균은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 속하는 신균주임을 확인하였고 이를 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)로 명명하고 한국종균협회(KFCC)에 기탁하여 균주번호 KFCC-11179를 부여받았다.

상기 분리된 바실러스 메가테리움PS352 (Bacillus megateriumPS352)는 다양한 병원성 미생물에 대한 항균력이 뛰어날 뿐 아니라 다양한 사료첨가용 항생제, 담즙과 위액에 대한 내성 및 열에 대한 안정성이 우수한 미생물로 확인되었다.

또한 상기의 바실러스 메가테리움 PS352은 전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 인산분해효소(phytase) 등 다양한 효소를 고농도로 분비하였다

따라서 상기 분리된 바실러스 메가테리움 PS352은 프로바이오틱 균주로서의 특성을 모두 가지는 우수한 균주로서, 사료용 첨가제로 사용되거나 사료에 첨가되어 사용될 수 있을 것이다.

또한 본 발명은 상기 균주에 의해 생산되는 전분분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 자일란분해효소(xylanase), 펙틴분해효소(pectinase), 글루칸분해효소(β-glucanase), 인산분해효소(phytase) 등과 같은 각종 효소에 관한 것이다. 본 발명에 의한 균주는 대두박 등과 같은 사료의 원료를 배지로 하여 위와 같은 효소를 효율적을 생산하기 때문에 가축에 섭식되었을 때 숙주의 사료효율을 증대시키는 효과를 발휘할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기위한 예일 뿐이며 이에 의하여 본 발명의 기술적 범위가 축소되거나 변경되는 것은 아니며 또한 본 발명의 개념이 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. 미생물의 분리 및 동정

재래식 시장에서 구입한 된장을 0.95% 생리식염수에 10배씩, 최종적으로 10⁷배까지 희석하였다. 희석된 용액을 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 형성된 군집을 계속 새로운 영양한천배지에 계대배양 하면서 23개의 단일균종을 확보한 후 플레이트에서 전분 분해효소 및 단백질 분해효소 활성을 측정하여 가장 높은 활성을 보이는균주 PS352를 분리하였다. 즉, 전분(soluble starch)이 1% 포함된 영양한천배지 (소고기 추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 한천 1.5%)에 멸균된 이쑤시게를 이용하여 단일균종을 접종한 뒤 30℃에서 24시간 배양한 후 요오드 용액으로 염색하여 생기는 투명환의 크기가 큰 5종의 단일균종을 선택하였다. 이어서 탈지분유(skim milk)가 1% 포함된 영양한천배지(소고기 추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 한천1.5%)에 멸균된 이쑤시게를 이용하여 상기 선택된 5종의 단일균종을 접종한 뒤 30℃에서 24시간 배양한 후 생기는 투명환의 크기가 가장 큰 것을 선택하여 PS352로 명명하였다.

다양한 생화학적 시험 및 Biolog. system(Biolog Microlog 3 4.01A)을 사용하여 최종 분리된 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여 하기 표 1에 나타내었다.

분석 결과 분리균주는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에 속하는 신균주인 것으로 동정되어 이 균주를 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)로 명명하였고 한국종균협회(KFCC)에 기탁번호 KFCC-11179로 기탁하였다.

시료에서부터 미생물을 분리, 동정하고 다양한 프로바이오틱(probiotic) 특성에 대한 조사를 하는 일련의 과정을 도 1에 도시하였다.

실시예 2 : 병원성 미생물에 대한 균주 PS352의 항균력

교차배양 및 2단 배양을 통하여 본 발명의 균주인 바실러스 메가테리움PS352의 병원성 미생물에 대한 항균력을 조사하였다.

교차 배양법을 통하여 항균력을 시험하기 위하여 새균오염의 지표가 되는 대장균(Eschelichia coli), 식중독 원인균인 스트렙토 코커스(Streptococcussp.), 살모넬라 타이피뮤리움(Samonella typhimurium), 살모넬라 콜레래시어스(Samonella choleraesuis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 비브리오패혈증의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티커스(Vibrio parahaemolyticus)를 병원성 미생물로 선택하였다. 먼저 분리된 균주를 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에서 30℃로 24시간 동안 진탕배양한 후 1% 사료 한천 배지(양계용사료 2%, agar 1.5%)에 백금이를 사용해 상기 선택한 병원성 미생물을 교차도말한 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

상기의 교차배양에서 PS352는 비브리오 파라헤모라이티커스를 제외한 모든 병원성 미생물에 대한 강한 항균력을 지니고 있는 것을 보여주었다.

한편 2단 배양을 위해 영양배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%)에서 12시간 배양된 대장균, 락토코커스 속(Lactococcussp.), 살모넬라 타이피뮤리움 및 스타필로코커스 아우레우스 각각을 한천이 0.6% 포함된 겔 형태의 영양배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%)한 후, PS352가 점 배양된 MRS(DeMan Rogosa and Sharpe broth) 상면에 부은 후 37℃에서 배양하였다. 24시간 배양 후 모든 실험구에서 투명환이 형성되어 본 균주가 피검체에 대한 강한 항균력을 보유하고 있음을 확인하였다.

교차 배양 및 2단 배양법을 통한 PS352의 항균력 시험 결과를 표2에 자세히나타내었다.

실시예 3. PS352의 항생제 내성

사료 첨가용 항생제에 대한 본 발명의 균주인 바실러스 메가테리움 PS352의 내성을 조사하였다.

타이로썰파(tyrosulfa), 플라보마이신(flavomycin), 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline), 젠타마이신(gentamycin), 노플라쎄신(norflaxacins), 네오마이신(neomycin), 페니실린(penicillin), 클로로테트라사이클린(chlorotetra- cycline), 콜리스틴(colistin), 카시트라신(cacitracin), 암모시실린(amoxicillin), 퓨라조리딘(furazolidine)을 각각 0∼500 ppm 포함하는 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.5%)에 본 발명에 의한 균주를 도말하여 30℃로 24시간 배양 후 균의 성장 여부를 조사함으로써 항생제 내성을 판단하였다.

그 결과 PS352는 플라보마이신(flavomycin), 카시트라신(cacitracin)을 제외한 모든 항생제에 대하여 내성을 가지고 있음이 확인되었다. 각 항생제에 대한 자세한 내성 한계농도를 표 3에 나타내었다.

실시예 4. PS352의 담즙과 인공 위액에 대한 내성

바실러스 메가테리움 PS352의 담즙과 인공 위액에 대한 내성을 조사하였다.

담즙을 0%에서 3%까지 0.5%(w/v) 단위로 함유하는 MRS 평판 배지에 PS352를 도말하여30℃에서24시간 배양 후 균의 성장 여부를 보았다. 본 발명에 의한 균주는 담즙 농도 3.0%에서도 활발히 생존함으로써 강한 내담즙산성을 보였다.

인공 위액에 대한 내성 판단은 0%에서 1%까지 0.2%(w/v) 단위의 pepsin으로 2시간 처리한 균주배양액을 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar1.5%)에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 균의 생존 여부를 확인하였다. 그 결과 본 균주는 1% pepsin 처리 후에도 정상적인 생육을 함으로써 인공위액에 대한 강한 내성을 나타내었다.

표 4에 PS352의 담즙 및 pepsin 농도에 따른 내성 시험 결과를 나타내었다.

실시예 5. PS352의 pH 및 열 안정성

분리된 균주바실러스 메가테리움 PS352의 pH 및 열에 대한 안정성을 조사하였다.

pH 2 ∼ pH 12까지의 완충용액(20mM citrate-phosphate buffer for pH 2.0-6.0; 20mM potassium phosphate buffer for pH 6.0-8.0; 20mM glycine-NaOH buffer for pH9.0-12.0)에 분리된 균주 배양액을 4시간 방치한 후 영양배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 생균수(콜로니 수)의 상대비를 조사하였다. 실험 결과 PS352는 pH 4 ∼ pH 9의 넓은 범위에서 안정적으로 생존함을 알 수 있었다.

열에 대한 안정성은 배양액을 10℃에서 70℃까지의 수조에 15분간 처리한 뒤 상기와 같은 방법으로 생균수를 측정하여 판단하였으며 PS352는 전 범위에서 안정적으로 성장하는 것으로 나타났다.

PS352의 pH와 열에 대한 안정성을 도 2에 나타내었다.

실시예 6. PS352에 의한 효소 생산

본 발명에 의한 균주인 바실러스 메가테리움 PS352에 의한 유용효소의 생산 및 생산된 각종 효소의 pH 및 열안정성을 확인하였다.

대두박과 말분 배지(1:1)에 각각 1.0×10⁷CFU/g 농도로 균주 PS352를 접종하여 고체발효(30℃, 72시간 45% (v/w) 수분함량)를 진행한 후 발효가 완료된 발효산물 10g을 멸균된 증류수 900ml에 현탁하여 30℃에서 약 10분간 진탕한 후 6,000rpm의 속도로 원심분리하여 얻은 상등액을 효소 추출액으로 사용하여 효소의 역가를 측정하였다.

전분분해효소의 활성은 0.1% 전분 용액 900㎕에 균주 배양액 혹은 효소 추출액을 100㎕ 첨가하여 30℃에서 30분간 반응시킨 후 동량의 DNS(dinitro salicylic acid)용액을 혼합하여 물에 15분간 끓인 후 570nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 계산하였다. 대조구에서는 효소액 대신 멸균수를 100㎕ 첨가시켜 동일한 방법으로흡광도를 측정하였다.

자이란분해효소, 글루칸분해효소, 펙틴분해효소의 효소 활성은 0.1% 전분 용액 대신 1% xylan, 0.5% glucan, 1% pecin을 사용하여 측정하였다. 이상 탄수화물 분해효소의 단위 활성(Unit)은 기질 용액과 30℃에서 30분간 반응하여 효소가 첨가되지 않은 대조구와 비교할 때 0.001의 흡광도 값의 차이를 나타나게 하는 효소의 량으로 정의하였다.

단백질분해효소의 활성은 1% 아조카제인(Azocasein) 100㎕을 반응용액 400㎕에 첨가한 후 효소액을 100㎕을 처리하여 30℃에 반응시켰다. 이후 동량의 10% TCA(trichloro acetic acid)를 처리하여 얼음에 5분간 방치하고 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 390nm 파장에서 흡광도 값을 측정하여 계산하였다. 단위 활성(Unit)은 기질 용액과 30℃에서 30분간 반응하여 효소가 첨가되지 않은 대조구와 비교할 때 0.001의 흡광도 값의 차이를 나타나게 하는 효소의 량으로 정의하였다.

인산분해효소(phytase)의 활성은 5mM 인산나트륨(sodium phytate) 용액 600㎕에 효소 용액 150㎕를 가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 15% TCA 용액 750㎕를 가하여 반응을 종결한 후 위 반응액 100㎕를 멸균증류수 900㎕와 혼합한 후 발색시약(2g ascorbic acid, 0.5g ammonium molybdate, 95% H2SO4 5.7ml/ 100ml 증류수) 1ml을 가하여 50℃에서 20분간 반응시키고 파장 820nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 측정 후 인산 용액(K₂HPO₄) 표준 곡선과 비교하여 최종 환원된 인의값을 환산하였따. 효소의 단위 활성은 분당 1μM의 인을 유리시키는 효소의 량으로 정하였다.

PS352 균주에 의해 생산된 전분분해효소, 단백질분해효소의 활성은 각각 500,000kU/g, 200,000kU/g으로 높은 활성도를 나타내었으며, 자일란 분해효소, 펙틴분해효소, 글루칸 분해 효소와 인산분해효소도 표 5에서 보는 바와 같이 높은 역가로 측정되었다.

각 효소의 pH 안정성은 pH 2 ~ pH 12까지의 완충용액(20mM citrate-phosphate buffer for pH2.0-6.0; 20mM potassium phosphate buffer for pH 6.0-8.0; 20mM glycine-NaOH buffer for pH 9.0-12.0)에 분리된 균주 배양액을 4시간 방치한 후 영양배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 생균수 (콜로니 수)의 상대비를 조사함으로써 이루어졌다. 또한 열 안정성은 배양액을 10℃에서 70℃까지의 수조에 15분간 처리한 뒤 상기와 같은 방법으로 생균수를 측정하여 판단하였다.

표 5에 PS352에 의해 발효된 발효산물의 각 효소 활성도와 안정성에 대해 자세히 나타내었다.

본 발명에 의한 프로바이오틱스(probiotics) 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megaterium PS352)는 여러 병원성 미생물에 대해 강한 항균력이 있고, 다양한 사료 첨가용 항생제에 대해서도 내성을 지닌다. 또한 담즙산 및 인공 위액에 대해서도 내성을 지녔으며 다양한 범위의 pH 와 열에 대해서도 안정적으로 생존 가능하다. 또한 고체발효에서 전분분해효소, 단백질분해효소, 자일란분해효소, 펙틴분해효소, 글루칸분해효소와 인산분해효소를 높은 역가로 생산한다.

따라서 본 발명에 의한 균주에 의하여 저렴하고 우수한 사료첨가용 미생물 제제를 얻는 것이 가능하게 된다.

Claims (5)

1. 병원성 미생물에 대한 항균력, 사료 첨가용 항생제와 담즙에 대한 내성 및 인공 위액에 대한 내성이 있고 넓은 pH 및 온도범위에서 생장이 가능한 바실러스 메가테리움 PS352(Bacillus megateriumPS352)(KFCC-11179).
2. 제 1 항의 균주를 함유하는 사료용 첨가제.
3. 제 1 항의 균주를 함유하는 사료.
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