KR100320031B1 - 박테리오신 생산성이 증가된 비스판 변이균주 및 이로부터 박테리오신 생산방법 - Google Patents

박테리오신 생산성이 증가된 비스판 변이균주 및 이로부터 박테리오신 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리오신 생산성 비스판 변이균주 및 이로부터 박테리오신 생산방법에 관한 것으로 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)를 NTG 처리하여 얻은 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)는 친주와 형태, 배양 및 생리학적 특성이 동일하고 생산하는 박테리오신도 동일하나 그 생산량에 있어서는 같은 조건에서 2배의 높은 생산성을 나타내는 뛰어난 효과가 있다.

Description

박테리오신 생산성이 증가된 비스판 변이균주 및 이로부터 박테리오신 생산방법{Bispan mutant with enhanced bacteriocin productivity and process for praparation bacteriocin using the same}
본 발명은 박테리오신 생산성이 증가된 비스판 변이균주 및 이로부터 박테리오신 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 박테리오신을 생산하는 비스판균을 변이처리하여 박테리오신 생산성이 2배로 증가된 비스판 변이주(기탁번호 KCCM 10104) 및 이로부터 박테리오신를 생산하는 방법에 관한 것이다.
생균제란 살아있는 미생물 균체를 섭취함으로서 미생물이 분비하는 효소라든지 유기산, 비타민, 무독성 항균단백질 등에 의한 신체기능 개선을 목적으로 생산된 제품을 말한다.
현재 생균제로는 주로Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium등이 연구되었으나 사람이나 동물에 상업적으로 사용되는 생균제에서는Lactobacillus, Bacillus, Clotridium, Saccharomyces, Aspergillus등이 혼합된 형태로 제품화 되고 있다. 그러나Bacillus나Clostridium또는Sacchromyces, Aspergillus의 생균제로서의 능력은 많이 연구되어진Lactobacillus나Enterococcus등에 비해 아직까지 거의 평가되지 않는 상태이다. 생균제로서의 균이 가져야 하는 가장 중요한 특성은 GRAS(generally Recognized As Safe) 미생물로서 동물장내에서 생존력이 커야 한다는 점이다.
질병치료의 경우 화학약품 대신 살아있는 미생물을 이용하여 소기 목적을 달성하는 경우가 많이 있다. 왜냐하면, 화학약품들을 치료약으로 사용하는 경우 1차 목적인 질환치료는 달성할 수 있으나 신체의 다른 부분에 부작용을 일으키는 경우가 많으며 또한 원인균들이 항생제 내성 등을 가지게 되어 점차 치료하기 어려워지는 경우가 많다. 그러나 비병원성 생균을 질환치료에 사용한다면 각종 분해효소를 생성하여 병원균에 대한 길항작용을 하게 되므로 부작용이 없이 화학적 치료법의 단점을 보완할 수 있게 된다.
박테리오신은 미생물이 생산하는 천연의 무독성 방부제로 주목받고 있는 항균성 단백질이다. 기존의 항생제가 2차 대사산물인데 반하여 자신의 유전자로부터 직접 생합성(ribosomal translation)되는 것이 특징이며, 따라서 직접적인 유전자 조작 등에 의한 생물공학적 응용이 용이하고 그 결과 산업현장의 소요에 보다 다양하게 반응할 수 있다. 또한 분자가 단백질로 구성되어 있기 때문에 인체에 섭취되면 소화기관의 단백질 가수분해효소에 의해 분해되므로 인체에 무독하고 잔류성이 없다는 점에서 식품 등에서의 천연방부제 내지는 발효식품 등의 생물제어제로서의 효용성이 증대되고 있다. 즉, 발효유, 발효알콜음료, 통조림, 냉장·냉동제품에서의 저장성 향상 외에도 고추장, 된장, 두부, 유산균 발효제품 등에서의 저장성 연장 및 김치, 약주, 탁주 등 전통식품의 산패 및 변질방비, 어패류의 신선도 유지 및 콩나물 등 과실 및 야채류의 저장성을 향상시킬 수 있다.
상기와 같은 박테리오신을 생산하는 균중 비스판균은Bacillus polyfermenticus로 알려져 있으며 20여종의 효소를 분비하여 영양소를 재활용하게 하며 비타민 B1, B2, K를 합성하여 영양을 보급시킨다. 또한 인체의 3대 영양소인 탄수화물, 지방, 단백질 및 섬유소를 소화, 흡수시키며 병원성 균들인 티프스균, 파라티프스균, 적리균, 콜레라균 등을 용균시켜 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 아울러 섭취할 경우 비경구적 감염방어작용과 경구적 면역능이 증강된다는 사실도 밝혀져 있으며 숙주의 면역기능을 강화하고 발암물질과 발암촉진물질을 생성하는 장내 미생물의 생육을 억제하며 대장의 항종양 물질이나 항돌연변이물질을 생성함으로서 종양발생을 억제한다. 이러한 비스판균은 아포를 형성하는 균이기 때문에 장에 도달할 때까지 활성을 거의 잃지 않아 장질환의 치료에 탁월한 효과를 보이고 있다. 비스판균이 다른Bacillussp. 들보다 환경 적응력이 뛰어나며 설사유발 대장균 및 살모넬라에 대한 생육억제력도 우수하다. 또한 배양 후 냉동건조시킨 후 37℃에서 42일까지 보관한 후에도 생존율이 상당히 높아 생균제로서의 효과가 매우 우수하다.
본 발명자들은 지금까지 박테리오신 생산성 비스판 균이 일본에서 수입되어 온 것을 감안하여 직접 비스판균의 미생물학적인 특성을 동정하고 비스판균의 장내에서 발생하기 쉬운 주요 부패세균 및 병원성 세균에 대한 항균효과 검정시험을 수행하여 비스판균의 우수성을 확립하던 중 비스판균이 생산하는 항균성 단백질인 박테리오신을 발견하게 되었으며, 마지막으로 변이처리하여 고역가 균주를 분리하여 발효조에서 대량으로 박테리오신을 발효배양하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 박테리오신을 다량으로 생산하는 비스판 변이주인Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 비스판 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)를 발효배양하여 박테리오신을 다량으로 생산함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 친균주인 비스판균으로Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)를 배양하여 비스판균 자체의 항균활성을 측정하고 상기 비스판균에 NTG를 처리하여 돌연변이를 유발한 후 돌연변이균주들 중 가장 박테리오신 생산성이 높은 변이주Bacillus polyfermenticusKD21, KD33, KD42, KD65, KD74, KD83을 선발하고 상기 친균주와 변이주 6종의 박테리오신 생산성을 비교하고 이들 박테리오신의 항균활성과 열, pH 안정성 및 효소에 대한 민감성을 조사함으로서 달성하였다.
이하. 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.
도 1은 500mL 배플 플라스크에서 배양시간에 따른 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 NTG 처리하여 얻은 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)의 박테리오신 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 5L 발효배양기에서 배양시간에 따른 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 NTG 처리하여 얻은 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)의 박테리오신 생산을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 비스판균으로Bacillus polyfermenticusSCD을 사용하여 이 균주의 종균을 순수분리하여 TSB(tryptic soy broth)배지에서 종균배양한 후 본 배양을 실시하는 단계; 상기 배양한Bacillus polyfermenticusSCD의 항균활성을 플립 플레이트 방법(flip plate method)에 의해 그람음성균과 그람양성균 각각에 대해 조사하는 단계; LB 배지에서 배양한 균주를 NTG로 처리하여 돌연변이를 유발한 후 LB 플레이트 배지에서 배양하여 콜로니의 크기, 색상에 따라 3000여종을 1차 선별하고 박테리오신의 생산력을 기준으로 6종의 변이주Bacillus polyfermenticusKD21, KD33, KD42, KD65, KD74, KD83를 선발하는 단계; 친주인Bacillus polyfermenticusSCD와 상기 선발한 변이주 6종을 배플 플라스크에 접종하여 종배양한 후 이어서, 본 배지에서 본 배양한 다음 황산암모뉴밈전법과 투석으로 부분정제하여 박테리오신을 회수하는 단계; 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)의 형태, 배양, 생리학적 특성을 동정하여 비교하는 단계; 상기 부분정제하여 얻은 박테리오신의 항균활성을 스팟-온-론 방법(spot-on-lown method)으로 측정하는 단계 및; 상기 항균활성을 측정한 박테리오신의 열, pH안정성 및 효소에 대한 민감성을 조사하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 균주는 (주)순천당제약 기술연구소로부터 비스판균인Bacillus polyfermenticusSCD(KCCM 10104)를 분양받아 3 ~ 4회에 걸친 여러번의 계대배양으로 균주를 활성화하였다. 이 비스판균과 본 실험에서 사용된 모든 균주들은 글리세롤 스탁(glycerol stock)법으로 -70℃에서 보존하였고 워킹 컬쳐(working culture)를 한달에 1회씩 계대배양을 하여 사용하였다.
본 발명에서 사용한 배지는 종균배지로는 TSB 배지를 사용하였으며 본 배양배지로는 TSB 배지와 산업용 배지를 사용하였다. 본 발명에서 사용한 공업용 배지는Bacillussp. 균주에 많이 이용되고 아포형성에 뛰어난 배지로서 비스판균의 배양을 위해 사용하였다. 산업용 배지를 구성하고 있는 성분들은 가격적인 면에서 저렴하고 국내에서 비교적 쉽게 공급받을 수 있어야 한다는 점이 고려되었으며 주성분인 포도당, 옥수수전분은 (주)신동방으로부터 제공받았다.
본 발명에서 사용한 배양장치를 보면, 종균배양은 500mL 배플 플라스크[baffled flask(working volume; 100mL)］을 이용하였으며 본 배양은 5L 발효조(한국 발효기, working volume; 3L)를 사용하여 수행하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 비스판균 배양
본 실시예에서는 비스판 균으로Bacillus polyfermenticusSCD(KCCM 10104)를 사용하였다. 이 균주의 종균을 순수분리하여 TSA(tryptic soy agar) 플레이트에 보존중인 균주를 500mL 배플 플라스크(baffled flask)의 TSB(tryptic soy broth) 배지에 한 백금이 접종하여 37℃에서 교반속도 150rpm으로 10시간 진탕배양하였다. 플라스크규모에서의 본 배양조건은 배양온도 37℃, 초기 pH 7.0, 교반속도 140rpm, 배양시간은 5일이었다. 발효조에서의 본 배양의 배양조건은 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.1% 박토효모추출액, 1% 염화나트륨)에서 총용량(total volume)은 5L, 실용량(working volume)은 3L, 배양온도는 37℃, pH 7.0 ±0.1, 교반속도는 500rpm, 통기량은 1vvm, 배양시간은 4일이었다.
실시예 2: 비스판균의 항균활성 측정
상기 실시예 1에서 배양한 비스판균Bacillus polyfermenticusSCD(KCCM 10104)의 항균활성은 플립 플레이트 방법(flip plate method)에 의해 측정하였다. 즉, 비스판균을 TSB 배지에 37℃에서 12시간 배양하고 이 배양액을 건조된 TSA 플레이트에 스트리킹(stricking)한 후 37℃에서 다시 24시간 배양하였다. 비스판균이 자란 플레이트(plate)를 뒤집어, TSB 에 37℃, 12시간 배양한 대상균주 100㎕를 0.75% soft agar 5mL에 접종, 혼합(약, 107cells)하여 오버레이(overlay)한 후 37℃에서 12∼24시간 배양하여 생육저해 활성을 조사하였다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 비스판균의 항균활성은Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillussp.,Micrococcussp. 및Listeriasp. 등Staphylococcus epidermidisATCC 12228을 제외한 모든 그람양성균에 대하여 항균활성을 나타냈고, 그람음성균은Yersiniasp.,Vibriosp.,Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Salmonellasp.,Shigellasp. 및Pseudomonassp. 등 모든 그람음성균에 대해 항균효과를 나타냈다.
비스판균인Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)의 항균활성
Spoilage and pathogenic microorganisms Culturemediumb Incubationtemp. Inhibition zonediameter(mm)
Gram positive bacteria
Enterococcus faecalisATCC 19433 TSA 37℃ +
Staphylococcus aureusATCC 25923 TSA 37℃ +
Staphylococcus epidermidisATCC 12228 TSA 37℃ -
Clostridium perfringensATCC 3624a TSA 37℃ +
Bacillus cereusATCC 11778 TSA 37℃ +
Bacillus subtillsATCC 6633 TSA 37℃ +
Micrococcus luteusATCC 10240 TSA 37℃ +
Listeria monocytogenesATCC 15313 TSA 30℃ +
Listeria ivanoviiATCC 19119 TSA 30℃ +
Gram negative bacteria
Yersinia pseudotuberculosisATCC 6902 TSA 30℃ +
Yersinia enterocoliticaATCC 27729 TSA 30℃ +
Vibrio parahaemolyticusATCC 17802 TSA 37℃ +
Vibrio vulnificus TSA 37℃ +
Vibrio choleraeO139 TSA 37℃ +
Aeromonas hydrophila TSA 37℃
Escherichia coliATCC 8937 TSA 37℃ +
Escherichia coliATCC 29522 TSA 37℃ +
Escherichia coliO157 TSA 37℃ +
Salmonella typhi TSA 37℃ +
Salmonella paratyphi A TSA 37℃ +
Salmonella typhimurium TSA 37℃ +
Salmonella enteritidis TSA 37℃ +
Shigella flexneri TSA 37℃ +
Shigella boydii TSA 37℃ +
Shigella sonnei TSA 37℃ +
Pseudomonas syringaeATCC 12855 TSA 30℃ +
Pseudomonas aeruginosaATCC 15442 TSA 30℃ +
a : Incubated in anaerobic GasPak jarb : TSA, tryptic soy agar
실시예 3: 비스판균 Bacillus polyfermenticus SCD(기탁번호 KCCM 10104)변이처리
TSB 배지를 사용하여 500mL 배플 플라스크(baffled flask)에 친균주인 비스판균Bacillus polyfermenticusSCD(KCCM 10104)를 한 백금이(one-loopful)의 양으로 접종하여 37℃에서 교반속도 160rpm으로 진탕배양하며 종배양을 실시하였다. 이후 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.1% 박토효모추출액, 1% 염화나트륨)을 사용하여 500mL 배플 플라스크에 상기 종배양액을 한 백금이의 양으로 접종하여 37℃, pH 7.0, 교반속도 160rpm의 조건에서 배양하였다. 접종 후 5일이 경과한 후 배양을 종료하였다. 배양한 균주를 PAB(antibiotic medium 3) 배지에 접종한 후, 충분한 통기성하에서 대수증식기까지 37℃에서 배양하고 원심분리로 상등액을 제거한 후 따뜻한 SC(0.15M 염화나트륨, 0.01M 소듐 시트레이트 완충용액, pH 7.0) 10mL로 세척하였다. mL 당 100㎕의 NTG를 첨가하여 30분 동안 반응시켜 돌연변이를 유발시켰다. 그 다음 따뜻한 PAB 배지로 세척한 후 적당히 희석하여 LB 플레이트배지에서 배양하여 박테리오신 생산력을 기준으로 3000여종을 1차 선발한 후 이 방법을 반복하여 최종적으로 LB 플레이트에서 생산력이 높다고 판단된 6종의 변이주Bacillus polyfermenticusKD21, KD33, KD42, KD65, KD74, KD83을 선발하였다.
실시예 4: 친주와 변이주의 성장 및 박테리오신 생산
본 실시예에서는 친주인Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 상기 실시예 3에서 얻은 변이주 6종의 박테리오신 생산을 조사하였다. 친주와 변이주 6종 각각을 배플 플라스크[baffled flask(working vol. : 500mL)]에 접종하여 37℃에서 8시간 진탕배양하여 종배양한 후 본배지에 1%로 접종하여 본 배양하여 활성을 확인하였다. 실험결과, 표 2 ~ 8에 나타낸 바와 같이 선발한 변이주 6종에서 많은 박테리오신 활성을 나타낸 것은 KD33, KD42이였으며 이중 KD42는 6시간만에 최대활성이 나타났고 KD33은 4시간만에 최대활성을 나타내 가장 활성이 우수한 변이주임을 알 수 있었다. 친주는 6시간만에 최대활성에 도달하였으며, 그 후에는 활성이 급격히 감소되었다. 도 1에는 배플 플라스크 배양에서 친주와 가장 활성이 우수한 변이주 KD33의 균 성장과 박테리오신 활성을 시간경과에 따라 측정하여 나타냈으며 도면에 따르면 균주의 성장곡선은 유사하나 박테리오신 활성 곡선은 변이주가 꾸준히 높았다. 한편 도 2에는 발효조에서의 친주와 변이주 KD33의 균성장과 박테리오신 활성을 시간 경과에 따라 측정하여 나타냈으며, 박테리오신 활성은 변이주가 역시 꾸준히 높았다. 따라서 발효조에서도 변이주의 우수함을 확인하게 되었다. 친주와 변이주 KD33으로부터 회수한 박테리오신의 총량은 표 9에 나타낸 바와 같이 친주가 500mL에서 800, 5L 발효조에서 2133을 나타냈으며 변이주 KD33의 경우는 500mL에서 1600, 5L 발효조인 경우는 4266으로 변이주 KD33이 친주에 비해 2배로 높았다. 이후 5L 발효조에서 얻은 친주와 변이주 KD33 배양액을 각각을 원심분리하여 상징액을 75% 황산암모늄침전과 2번의 투석(MWCO 1000)을 통해 부분정제하여 회수율 90% 이상으로 박테리오신을 얻었다.
친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.02 0.0035 0
2시간 6.95 0.0191 400
3시간 6.82 0.2012 800
4시간 6.69 0.7733 3200
5시간 6.44 1.7075 2260
6시간 6.19 1.8591 1600
8시간 6.92 1.8353 800
10시간 7.37 2.0253 400
12시간 7.75 2.1624 400
변이주Bacillus polyfermenticusKD21의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.02 0.0051 -
2시간 6.97 0.0564 -
3시간 6.78 0.3504 800
4시간 6.59 0.9507 800
5시간 6.48 1.7780 3200
6시간 6.38 1.8956 -
8시간 7.13 1.9873 800
10시간 7.86 2.1799 400
12시간 8.25 2.0728 400
변이주Bacillus polyfermenticusKD33의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.01 0.0066 100
2시간 6.96 0.0629 800
3시간 6.75 0.2761 3200
4시간 6.55 0.7241 6400
5시간 6.40 1.6358 6400
6시간 6.26 1.6843 6400
8시간 6.98 1.9652 3200
10시간 7.63 2.1488 3200
12시간 7.85 2.1418 1600
변이주Bacillus polyfermenticusKD42의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.02 0.0050 0
2시간 6.98 0.0382 200
3시간 6.85 0.2455 1600
4시간 6.73 0.6041 3200
5시간 6.46 1.4713 3200
6시간 6.19 1.8440 6400
8시간 6.85 1.9806 3200
10시간 7.45 2.1079 1600
12시간 7.79 2.1449 1600
변이주Bacillus polyfermenticusKD65의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.02 0.0050 -
2시간 6.98 0.0382 -
3시간 6.83 0.2455 800
4시간 6.69 0.6041 800
5시간 6.37 1.4713 -
6시간 6.06 1.8440 1600
8시간 6.93 1.9806 800
10시간 7.48 2.1079 800
12시간 7.85 2.1449 400
변이주Bacillus polyfermenticusKD74의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.02 0.0015 -
2시간 6.98 0.0249 -
3시간 6.85 0.2077 400
4시간 6.73 0.7239 800
5시간 6.49 1.7064 -
6시간 6.26 1.8613 1600
8시간 7.00 1.7701 800
10시간 7.40 2.1133 400
12시간 7.82 2.2085 -
변이주Bacillus polyfermenticusKD83의 박테리오신 활성
배양시간 pH OD AU/mL
1시간 7.01 0.0055 -
2시간 6.94 0.0766 -
3시간 6.66 0.4530 800
4시간 6.38 1.3249 800
5시간 6.36 1.9206 3200
6시간 6.34 1.9240 1600
8시간 7.22 1.9839 400
10시간 7.64 2.1219 400
12시간 8.20 2.1054 400
친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 변이주Bacillus polyfermenticusKD33의 박테리오신 생산성 비교
배양장치 생산성(AU/ml/hr) 증가율(%)
친균주 변이주 KD33
500mL 플라스크 800 1600 200
5L 발효조 2133 4266 200
실시예 5: 친주와 변이주의 형태, 배양 및 생리학적 특성
본 실시예에서는 친주로 사용한Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 상기 실시예 4에서 가장 박테리오신 활성이 우수한 변이주Bacillus polyfermenticusKD33 각각을 영양한천 또는 TSA(Tryptic Soy Agar)에 도말하고 37℃에서 배양하고 그람염색법, 말라카이드 그린(Malachite Green) 포자 염색법, 편모염색법 등을 사용하여 현미경으로 관찰하였다. 생화학적 성질 및 자화성은 문헌(Biochemical tests for identification of medical bacteria; Manual for theidentification of medical bacteria)에 제시된 방법으로 시험하였다. 실험결과, 표 10에 나타낸 바와 같이 본 발명 변이주Bacillus polyfermenticusKD33은 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 형태, 배양 및 생리학적 특성은 동일하였다.
본 발명자들은 본 발명 변이주Bacillus polyfermenticusKD33을 한국종균협회 미생물보존센터에 1999년 10월 21에 기탁번호 KFCC 11108로 기탁하였다.
친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 변이주Bacillus polyfermenticusKD33의 형태, 배양 및 생리학적 특성
특성 Bacillus polyfermenticusSCD(KCCM 10104) Bacillus polyfermenticusKD33(KCCM )
형태 간균 간균
그람염색성 양성 양성
운동성 있슴 있슴
아포 형성능 있슴 있슴
산소요구성 호기성 호기성
포도당으로부터 산 생성능 있슴 있슴
전분 가수분해능 양성 양성
젤라틴 가수분해능 양성 양성
카제인 가수분해능 양성 양성
버지스-프로스카우어 테스트 양성 양성
질산염 환원 양성 양성
구연산 이용성 양성 양성
실시예 6: 박테리오신의 항균활성
본 실시예에서는 실시예 4에서 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 변이주Bacillus polyfermenticusKD33을 배양하여 얻은 박테리오신의 병원성균에 대한 항균활성을 조사하였다. 박테리오신 활성측정법으로 스팟-온-론 방법(spot-on-lawn method)을 사용하였다. 즉, 비스판균을 TSB 액체배지(10ml)에 접종하여 최적온도에서 6∼12시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양상징액 5㎕를 고체배지에 로딩(loading)한 후 건조시켰다. 그리고 대상균주 107cells을 포함하는 5mL의 소프트 아가(soft agar)로 오버레이(overlay)하여 다시 12시간 배양하여 생긴 저지환으로 판단하였다. 박테리오신 활성은 항균물질을 함유한 원액을 0.1M 인산완충용액으로 연속적으로 2배씩 희석한 후 각각의 희석액을 스팟(spot)하여 확실한 저해를 보인 최대희석배수를 역으로 취해 계산하였다. 실험결과, 표 11에 나타낸 바와 같이Clostridium perfringensATCC 36245,Bacillus pumilis,Bacillus subtilisIFO 12113 및Bacillus subtilisATCC 6633은 cell-free supernatant와 부분정제된 박테리오신에 대해 모두 항균활성을 나타내었고,Bacillus cereus와Micrococcus flavus는 cell-free supernatant에서는 약간의 항균활성을 보였으며 부분정제된 박테리오신에 대해 뚜렷한 항균활성을 나타내었다.Staphylococcus aureusATCC 25923,Bacillus cereusATCC 11778 및Listeria monocytogenesATCC 15313은 cell-free supernatant에 대해서는 약간의 항균활성을 보였다. 그 외의 그람양성균과 모든 그람음성균에 대해서 항균활성을 나타내지 않았고,Saccharomyces cerevisiaeKCCM 11201,Aspergillus oryzaeKCCM 11371,Aspergillus nigerKCCM 11239 및Penicillium chrysogenumKCCM 6933 등 실험에 사용된 효모와 곰팡이 균주에 대해서는 항균활성이 관찰되지 않았다.
친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)가 생산한 박테리오신의 항균활성
Spoilage and pathogenicmicroorganisms Culturemediumb Incubationtemp. Inhibition
Superna-tant Partiallypurifiedbacteriocin
Gram positive bacteria
Enterococcus faecalisATCC 19433 TSA 37℃ - -
Staphylococcus aureusATCC 25923 TSA 37℃ - +/-
Staphylococcus aureusATCC 32359 TSA 37℃ - +
Staphylococcus epidermidisATCC 12228 TSA 37℃ - -
Clostridium perfringensATCC 3624a TSA 37℃ + +
Bacillus cereusATCC 11778 TSA 37℃ - +/-
Bacillus cereus TSA 37℃ +/-c +
Bacillus pumilis TSA 37℃ + +
Bacillus subtilisIFO 12113 TSA 37℃ + +
Bacillus subtillsATC 6633 TSA 37℃ + +
Micrococcus luteusATCC 10240 TSA 37℃ - -
Micrococcus flavus TSA 37℃ +/- +
Listeria monocytogenesATCC 15313 TSA 30℃ - +/-
Listeria ivanoviiATCC 19119 TSA 30℃ - -
Gram negative bacteria
Yersinia pseudotuberculosisATCC 6902 TSA 30℃ - -
Yersinia enterocoliticaATCC 27729 TSA 30℃ - -
Vibrio parahaemolyticusATCC 17802 TSA 37℃ - -
Vibrio vulnificus TSA 37℃ - -
Vibrio choleraeO139 TSA 37℃ - -
Aeromonas hydrophila TSA 37℃ - -
Escherichia coliATCC 8739 TSA 37℃ - -
Escherichia coliATCC 29522 TSA 37℃ - -
Escherichia coliKCCM 32396 TSA 37℃ - -
Escherichia coliJM 109 TSA 37℃ - -
Escherichia coliO157 TSA 37℃ - -
Salmonella typhi TSA 37℃ - -
Salmonella paratyphiA TSA 37℃ - -
Salmonella typhimurium TSA 37℃ - -
Salmonella enteritidis TSA 37℃ - -
Shigella flexneri TSA 37℃ - -
Shigella boydii TSA 37℃ - -
Shigella sonnei TSA 37℃ - -
Spoilage and pathogenicmicroorganisms Culturemediumb Incubationtemp. Inhibition
Superna-tant Partiallypurifiedbacteriocin
Pseudomonas syringaeATCC 12855 TSA 30℃ - -
Pseudomonas aeruginosaATCC 15442 TSA 30℃ - -
Pseudomonas fluorescens TSA 30℃ - -
Pseudomonas putida TSA 30℃ - -
Yeast and Molds
Saccharomyces cerevisiaeKCCM 11201 YPD 30℃ - -
Aspergilllus oryzaeKCCM 11371 PDA 30℃ - -
Aspergillus nigerKCCM 11239 PDA 30℃ - -
Penicillium chrysogenumKCCM 6933 PDA 30℃ - -
a : Incubated in anaerobic GasPak jarb : TSA, tryptic soy agar;YPD, yeast extract peptone dextrose;PDA, potato dextrose agar,c : Not clearly inhibited
실시예 7: 박테리오신의 열, pH 안정성 및 효소에 대한 민감성
본 실시예에서는 실시예 4에서 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)와 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)을 배양하여 얻은 박테리오신의 열, pH 안정성 및 효소에 대한 민감성을 조사하였다. 먼저 황산암모늄 침전법으로 부분정제된 상징액을 열안정성은 온도별로(40 ~ 100, 121℃) 항온수조에서 30분간 열처리하고, pH 안정성은 부분정제된 상징액을 각 pH 완충액(pH 2 ~ 9)과 1:1의 부피로 혼합한 후 4℃에서 4시간 동안 방치하고 효소안정성은 부분정제된 상징액과 프로테아제 I, 프로테아제 Ⅳ, 프로테아제 Ⅸ, 프로테아제 ⅩⅢ, 프로테인나아제 K, α-키모트립신, β-키모트립신, 트립신, 리파제 및 α-아밀라아제 각 효소들을 각각 혼합하여 각각의 최적 조건하에서 1 ~ 4시간 반응시킨 후 0.1M 인산완충액(pH 7.0)으로 2배씩 희석하여 미리 대상균주인BacillussubtilisATCC 6633이 오버레이(overlay)된 TSA 플레이트에 각각 희석된 상징액 5㎕를 스팟하여 생육저지환을 각각 관찰하였다. 실험결과, 상기 친주와 변이주로부터 얻은 박테리오신의 열안정성은 60℃까지 잔존활성을 나타내었으며, pH 2 ~ 9까지 안정하였다. 이는 열에는 비교적 불안정하지만 pH에는 매우 안정한 물질임을 나타낸다. 효소안정성은 표 12에 나타낸 바와 같이Bacillus subtilisATCC 6633에 대해 존재하던 항균활성이 완전히 소실되는 것으로 보아 그 항균물질이 단배질임을 증명하였다.
친주와 변이주로부터 부분 정제하여 얻은 박테리오신의 열, pH 안정성 및 효소민감성
처리물(열) 잔존 활성(AU/mL) 처리물(pH) 잔존 활성(AU/mL) 처리물(효소) 잔존 활성(AU/mL)
대조군 12,800 대조군 12,800 대조군 3,200
40℃ 12,800 2 12,800 프로테아제 I 3,200
50℃ 6,400 3 12,800 프로테아제 Ⅳ 3,200
60℃ 800 4 12,800 프로테아제 Ⅸ 3,200
70℃ 0 5 12,800 프로테아제 ⅩⅢ 3,200
80℃ 0 6 12,800 프로테인나아제 K 0
90℃ 0 7 12,800 α-키모트립신 3,200
100℃ 0 8 12,800 β-키모트립신 3,200
121℃ 0 9 12,800 트립신 3,200
리파제 3,200
α-아밀라아제 800
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 친주Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)를 NTG 처리하여 얻은 변이주BacilluspolyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)는 친주와 형태, 배양 및 생리학적 특성이 동일하고 생산하는 박테리오신도 동일하나 그 생산량에 있어서는 같은 조건에서 2배의 높은 생산성을 나타내는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업 및 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. Bacillus polyfermenticusSCD(기탁번호 KCCM 10104)를 NTG 처리하여 얻은 것을 특징으로 하는 박테리오신 생산성이 증가된 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)
  2. 배플 플라스크에 상기 제 1 항 기재의 변이주Bacillus polyfermenticusKD33를 접종하여 37℃에서 8시간 진탕배양하여 종배양한 후 발효조의 본배지에 1% 접종하여 본 배양한 다음 배양액을 원심분리하여 상징액을 황산암모늄으로 침전시키고 투석을 하여 부분정제하는 것을 특징으로 하는 변이주Bacillus polyfermenticusKD33(기탁번호 KFCC 11108)를 이용한 박테리오신 생산방법.
KR1019990046115A 1999-10-22 1999-10-22 박테리오신 생산성이 증가된 비스판 변이균주 및 이로부터 박테리오신 생산방법 KR100320031B1 (ko)

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