KR100376562B1 - 비스루트균의 생산성을 향상시키는 방법 - Google Patents

비스루트균의 생산성을 향상시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비스루트("바실러스 폴리퍼멘티쿠스"라고도 함)균를 연속배양하는 것에 의해 생균제로 사용되는 비스루트균의 생산성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

비스루트균의 생산성을 향상시키는 방법{Method for enhancing the productivity of Bisroot strain}
본 발명은 비스루트균의 생산성을 향상시키기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비스루트균을 연속배양하는 것에 의해 균주의 활성아포수의 생산성을 획기적으로 증가시켜 비스루트균을 대량으로 제공할 수 있는 방법에 관한 것이다.
비스루트균은 1933년 일본의 미생물학자가 공기로부터 분리한 아포성 간균으로서,바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)라고 알려져 있으며, 20여종의 효소를 분비하여 영양소를 재활용하게 되며, 비타민 B1, B2, K를 합성하여 영양을 보급시킨다. 또한, 인체의 3대 영양소인 탄수화물, 지방, 단백질 및 섬유소를 소화, 흡수시키며, 병원성 균들인 티프스균, 파라디프스균, 적리균, 콜레라균 등을 용균시켜 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 아울러, 섭취할 경우 비경구 적 감염방어 작용과 경구적 면역능이 증강된다는 사실도 밝혀져 있으며, 숙주의 면역기능을 강화하고 발암물질과 발암촉진물질을 생성하는 장내 미생물의 생육을 억제하여 대장의 항종양물질이나 항돌연변이물질을 생성함으로써 종양발생을 억제한다. 특히, 비스루트균은 현재 시판되고 있는 유산균 제제나 비피더스 제제 등이 장까지 도달하기 위해서는 위산이나 여러 효소들 때문에 특별한 코팅이나 캡슐화하여야 하는 것과 달리, 아포를 형성하는 균이기 때문에, 장에 도달할 때까지 활성을 거의 잃지 않아 장질환의 치료에 탁월한 효과를 보이고 있다.
또한, 비스루트균은 다른 바실러스속 균주들보다 환경 적응력이 뛰어나며, 설사유발 대장균 및 살모넬라에 대한 생육 억제력도 우수하고, 배양 후 냉동건조시킨다음 37℃에서 42일까지 보관한 후에도 생존률이 상당히 높은 것으로 나타나 생균제로서의 가능성이 보고된 바 있다(박홍석 외, 1998. 생균제로서 가능성이 있는 미생물의 선별 및 특성. 한국식품영양과학회지, 27:433-440).
따라서, 국내에서는 이 비스루트균의 원분말을 일본의 제조회사로부터 수입한 후, 부형제를 첨가하여 장질환 치료제와 같은 다양한 비스루트 제제를 제조하고 있다. 그러나, 원료비가 비싸고 수입할 때마다 활성아포수가 일정하지 않으며, 저장하는 동안에도 활성이 많이 떨어지는 문제점이 있다.
이에, 비스루트균의 생산성을 향상시킬 수 있는 방법에 대하여 연구하게 되었고, 그 연구의 결과로서, 비스루트균 (Bacillus polyfermenticus) SCD(KCCM 10104)를 포도당 1-3 중량%; 옥수수전분 l-5 중량%, 대두분 1-5 중량%, 및 옥수수 침지액으로 이루어진 성분에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 성분; 그리고 미량성분으로서 제1인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 제2인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 염화칼슘 2수화물 0.05-0.5 중량%, 황산마그네슘 7수화물 0.01-0.1 중량%, 황산구리 5수화물 0.001-0.01 중량%, 황산망간 0.001-0.01 중량%, 황산철 7수화물 0.001-0.01 중량%, 황산아연 7수화물 0.001-0.01 중량%를 포함하는 액체 생산배지에 접종하는 단계; 및 30~37℃에서 pH를 6.8~7.2로 조절하면서 호기적으로 배양하는 단계에 의해 비스루트균을 대량으로 생산하는 방법에 대하여 특허출원["액체 발효에 의한 비스판균의 제조방법"(대한민국등록특허 제 233615호)]을 하여 특허를 획득하였으며,바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM 10104)보다 최대 활성아포수가 많으면서, 최대 활성아포수에 도달되는 배양시간 또한 단축되어 생산성이 향상되지만, α-아밀라제 활성과 같은 기능면에서는 친주와 차이가 없는 균주인바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KD21(KFCC-11090)에 대해서도 1999년 5월 4일자로 "생산성이 향상된 비스루트 변이주"라는 발명의 명칭으로 특허를 출원한 바 있다(특허출원 제 99-15998호).
나아가, 본 발명자들은 비스루트균의 생산성을 향상시킬 수 있는 방법에 대하여 계속 연구하여 왔으며, 비스루트균을 연속식 방법으로 배양한다면, 회분식 방법 및 유가식 방법으로 배양하는 것보다 활성아포수의 생산성이 더욱 향상된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 비스루트균의 생산성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 방법은
(1) 비스루트 균주를 TSB(Trytic Soy Broth)배지에서 진탕배양하여 종배양하는 단계;
(2)상기 종배양한 비스루트 균주를 공업용 배지에 접종한 후, 배양하는 단계; 및
(3) 비스루트균의 성장제한인자를 조절하면서 연속배양하는 단계를 포함하고,
상기 비스루트균이바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) SCD(KCCM 10104) 또는바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC- 11090)임을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
미생물의 연속배양법은 미생물의 배양과정에서 배양액을 연속적으로 배출하면서 같은 양의 배지를 주입하고 미생물의 상 및 환경을 일정하게 유지하는 배양방법으로 일정한 발효조를 이용하는 경우 회분배양에 비하여 미생물의 활성, 이를 테면, 증식속도, 탄소기질의 이용속도가 높으며, 생산성이 향상되고, 노동력, 전력, 증기 등이 절약되는 이점이 있음에도 불구하고, 스웨덴의 노보사에 의한 글루코스아이소머레이스 생산(Diers. Ⅰ., Continuous Culture. Vol. 6, Applications and New Fields. pp209-223, Ellis Horwood, Chichester, 1975), 영국의 ICI사에 의한 단세포 단백질 생산, 맥주의 생산(Hough, J. S.,Continuous culture in brewing, pp 226-237. 1975), 요구르트와 버터밀크 생산(Lelieveld, H.L.M., Mixed-strain continuous mlilk fermentation. Process Biochem., 19, 112. 1984)등 극소수만이산업화되어 있다. 이는 장기간의 연속조작으로 잡균오염의 위험성이 크고, 균주의 변이 또는 퇴화가 있을 수 있으며, 화학반응에 비하여 반응속도가 늦어서 이익이 크지 않고, 생산물의 농도가 낮아 생산물의 분리에 비용이 많이 드는 문제점 등이 있기 때문이다.
본 발명의 비스루트균 또한 아직까지 연속배양법으로 배양을 시도한 적이 없다. 그러나, 본 발명자들인 비스루트균을 연속배양하는 것에 의해 균주의 활성아포수가 특정 희석률에서 고농도로 유지되기 때문에 생산성이 획기적으로 증가된다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명에 의하면 살아있는 미생물 균체를 섭취함으로써 미생물이 분비하는 효소, 유기산, 비타민 및 무독성 항균물질 등에 의한 장내 균총의 정상화는 물론 장질환 치료를 통하여 신체기능의 개선을 목적으로 생산되는 프로바이오틱 생균제로 사용될 수 있는 비스루트균을 대량으로 제공할 수 있다.
본 발명의 비스루트균의 연속배양에 사용되는 배지로는 탄소원, 무기질소원, 유기질소원, 유기영양원, 소량의 무기물을 함유하는 천연 및 합성 배지 어느것이나 사용할 수 있다. 이때 탄소원으로는 포도당, 사탕수수액, 사탕무우액, 전분 등이 이용될 수 있으며, 질소원으로는 펩톤류, 황산암모늄, 염화암모늄, 옥수수침지액, 대두박, 대두분 등이 이용될 수 있다.
한편, 연속배양법에서, 비스루트균의 성장을 제한할 수 있는 인자는 포도당, 구연산, 암모니아 이온 및 마그네슘 이온 등이다. 즉. 배지중의 포도당 등의 농도를 조절하여 연속배양하는 것을 특징으로 한다.
이하 각종 예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 비스루트균은바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)과,바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)을 NTG 처리하여 돌연변이시킨바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)을 글리세롤 스톡(glycerol stock)법으로 -70℃에서 보존한 후, 계대배양을 한달에 한번 한 것이다.
한편,바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)와 이것의 변이주인바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)은 하기 표 1과 같은 형태, 배양 및 생리학적 특징을 갖는다.
특 성 바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD (KCCM-10104) 바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)
형태 간 균 간 균
그람염색성 양 성 양 성
운동성 있 슴 있 슴
아포 형성능 있 슴 있 슴
산소 요구성 호 기 성 호 기 성
포도당으로부터 산 생성능 있 슴 있 슴
전분 가수분해능 양 성 양 성
젤라틴 가수분해능 양 성 양 성
카제인 가수분해능 양 성 양 성
버지스-프로스카우어 테스트(VOGES-PROSKAUER TEST) 양 성 양 성
질산염 환원 양 성 양 성
구연산 이용성 양 성 양 성
실시예 1
TSB(Trytic Soy Broth; Difco Laboratories, detroit, USA) 배지를 사용하여 500㎖ 배플 플라스크(baffled flask)에바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)를 한 백금이(one loopful)의 양으로 접종하여 37℃에서 교반속도 150rpm으로 10시간 진탕배양하여 종배양을 실시하였다.
2ℓ발효조(New brunswick scientific, USA)에 700㎖의 기본 배지(Peptone 15g/ℓ, (NH4)2SO42g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1g/ℓ, Glucose 20g/ℓ, MgSO4·7H2O 0.3g/ℓ, CuSO4·5H2O 0.01g/ℓ, MnSO40.02g/ℓ, ZnSO4·7H2O 0.02g/ℓ, FeSO4·7H2O 0.02g/ℓ, KH2PO42.0g/ℓ)를 삽입하고, 상기 종배양액 1%를 접종하여 37℃에서 10시간 동안 정치배양하였다. 배양중의 pH는 7.1±1로 조절하고, 통기량은 1.0vvm으로 유지하였으며, 회전교반수는 200rpm으로 하였다. 그런 다음, 상기 기본배지에서 포도당을 5g/ℓ로 제한한 당농도 제한배지를 0.03h-1, 0.05h-1, 0.1h-1, 0.2h-1, 0.3h-1, 및 0.4h-1의 희석속도로 흘려주면서 각 단계별 균주의 활성아포의 생산성을 측정하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 즉, 각각의 배양액을 80℃에서 2시간 동안 열처리하여 영양세포를 사멸시키고, 무균의 희석액(NaCl 5g/ℓ, peptone 10g/ℓ)으로 연속으로 희석시킨 다음, 페트리디쉬에 0.1㎖를 분주하고, TSA 연질아가(soft agar)를 부어 잘 혼합하여 굳힌 후, 다시 오버레이하여 37℃에서 24시간 배양하여 활성아포수를 계산하였다.
희석률(h-1)
0.03 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
활성아포수(CFU/㎖) 2.4 ×109 1.7 ×109 8.0 ×107 4.2 ×105 2.1 ×105 4.0 ×102
생산성(CFU/㎖/day) 1.7 ×109 2.0 ×109 1.9 ×108 2.0 ×106 1.5 ×106 3.8 ×103
표 2로부터, 연속생산방법으로바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)를 배양한 결과, 0.05h-1에서의 희석률에서 1.7 ×109CFU/㎖ 성장률을 보임으로써 최대 생산성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104) 대신에바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)을 사용한다는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 연속배양을 실시하여 활성아포수와 생산성을 측정하였다. 그 결과를 표 3과 같다.
희석률(h-1)
0.03 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
활성아포수(CFU/㎖) 3.4 ×109 3.3 ×109 2.1 ×108 2.1 ×106 2.4 ×105 4.2 ×103
생산성(CFU/㎖/day) 2.4 ×109 4.0 ×109 5.0 ×108 1.0 ×107 1.7 ×106 4.0 ×104
표 3으로부터, 변이주인바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)를 연속 배양한 결과, 0.05h-1에서의 희석률에서 3.3 ×109CFU/㎖ 성장률을 보임으로써 최대 생산성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
포도당 대신에 구연산을 성장제한 인자로 사용한다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속배양을 하여 최대활성아포 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 4
포도당 대신에 암모니아 이온(NH4 +)을 성장제한 인자로 사용한다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속배양을 하여 최대활성아포 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 5
포도당 대신에 마그네슘 이온(Mg2+)을 성장제한 인자로 사용한다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속배양을 하여 최대활성아포 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 6
포도당 대신에 구연산을 성장제한 인자로 사용한다는 것을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 연속배양을 하여 최대활성아포 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
실시예 7
포도당 대신에 암모니아 이온(NH4 +)을 성장제한 인자로 사용한다는 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 연속배양을 하여 최대활성아포 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
실시예 8
포도당 대신에 마그네슘 이온(Mg2+)을 성장제한 인자로 사용한다는 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 연속배양을 하여 최대활성아포 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
비교예 1
5ℓ 발효조에 3ℓ의 H5 배지(공업용 배지)를 삽입하고, 상기 실시예 1와 같이 종배양한바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)을 배양액 30∼60㎖을 접종하여 37℃에서 1.5일 동안 배양하면서, 배양중의 pH를 6.9∼7.1로 조절하고, 통기량은 1.0vvm으로 유지하였다. 회전교반수는 500rpm으로 배양하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 활성아포의 생산성을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
비교예 2
배양초기에 배지중에 포도당이 소모되었음을 확인한 후, 3~4회에 걸쳐 포도당 농도가 배지중에 1%가 되도록 살균한 농축 포도당을 공급한다는 것을 제외하고는 비교예 1과 동일한 방법으로 연속배양한 후, 활성아포의 최대 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
비교예 3
바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)을 사용한다는 것을 제외하고, 비교예 1과 동일한 방법으로 연속배양한 후, 활성아포의 최대 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
비교예 4
바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)을 사용한다는 것을 제외하고, 비교예 2와 동일한 방법으로 연속배양한 후, 활성아포의 최대 생산성을 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)의 배양방법에 따른 최대 활성아포 생산성
배양방법 최대 활성아포 생산성(CFU/㎖/day) 증가율(%)
비교예 1(회분식) 8.2 ×108 -
비교예 2(유가식) 1.3 ×109 59
실시예 1(연속식: 포도당에 의한 성장제한) 2.0 ×109 144
실시예 2(연속식: 구연산에 의한 성장제한) 1.8 ×109 120
실시예 3(연속식: 암모니아 이온에 의한 성장제한) 1.5 ×109 83
실시예 4(연속식: 마그네슘 이온에 의한 성장제한) 1.6 ×109 95
표 4로부터, 연속배양법에 의한바실러스 폴리퍼멘티쿠스SCD(KCCM-10104)의 활성아포수 생산성은 회분식 및 유가식 생산법과 비교할 때 매우 우수하다는 것을 알 수 있다.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)의 배양방법에 따른 최대 활성아포 생산성
배양방법 최대 활성아포 생산성(CFU/㎖/day) 증가율(%)
비교예 3(회분식) 2.2 ×109 -
비교예 4(유가식) 2.6 ×109 18
실시예 2(연속식: 포도당에 의한 성장제한) 4.0 ×109 82
실시예 6(연속식: 구연산에 의한 성장제한) 3.6 ×109 64
실시예 7(연속식: 암모니아 이온에 의한 성장제한) 3.3 ×109 50
실시예 8(연속식: 마그네슘 이온에 의한 성장제한) 3.0 ×109 36
표 5로부터, 연속생산법에 의한바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC-11090)균주의 활성아포의 생산성 역시 회분식 방법 및 유가식 방법과 비교할 때 매우 우수하다는 것을 알 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 비스루트균을 연속배양 방법으로 생산하면, 비스루트균의 활성아포수의 생산성을 획기적으로 증가시킬 수 있으므로, 프로바이오틱 생균제로 사용되는 비스루트균을 대량으로 제공할 수 있다.

Claims (3)

  1. 비스루트균을 생산하는데 있어서,
    (1) 비스루트 균주를 TSB(Trytic Soy Broth)배지에서 진탕배양하여 종배양하는 단계;
    (2) 상기 종배양한 비스루트 균주를 공업용 배지에 접종한 후, 배양하는 단계; 및
    (3) 비스루트균의 성장제한인자를 조절하면서 연속배양하는 단계를 포함하고,
    상기 비스루트균이바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) SCD(KCCM 10104) 또는바실러스 폴리퍼멘티쿠스KD21(KFCC- 11090)임을 특징으로 하는 비스루트균의 생산성 향상방법.
  2. 제 1항에 있어서, 연속배양시 비스루트균의 성장을 제어하는 인자가 포도당, 구연산, 암모니아 이온 또는 마그네슘 이온임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 연속배양시 비스루트균의 성장을 제어하는 인자가 포도당임을 특징으로 하는 방법.
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KR100825111B1 (ko) * 2006-11-17 2008-04-25 건국대학교 산학협력단 항산화 물질을 생산하기 위한 바실러스 폴리퍼멘티커스의 최적화 배양 방법

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