KR100825111B1

KR100825111B1 - 항산화 물질을 생산하기 위한 바실러스 폴리퍼멘티커스의 최적화 배양 방법

Info

Publication number: KR100825111B1
Application number: KR1020060114105A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 이장현; 채미승
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2008-04-25

Abstract

본 발명은 탄소원 및 질소원을 인자로 하는 프로바이오틱 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD, 기탁번호 KCCM 10104)의 최적화 배양 방법에 관한 것으로 이 방법으로 배양된 폴리퍼멘티커스 SCD는 항산화 물질의 생산능이 획기적으로 증가되었다.

비스판균, 바실러스 폴리퍼멘티커스, 최적화 배양, 항산화 활성

Description

항산화 물질을 생산하기 위한 바실러스 폴리퍼멘티커스의 최적화 배양 방법{Optimized culture method of Bacillus polyfermenticus SCD for production of antioxidant substances}

도 1은 본 발명의 탄소원 종류에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)의 항산화 활성도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 프락토스 농도에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)의 항산화 활성도를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 질소원 종류에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)의 항산화 활성도를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 트립톤 농도에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)의 항산화 활성도를 나타낸 것이다.

도 5는 500 mL 플라스크에서 본 발명 2% 프락토스와 1% 트립톤을 첨가한 배지 중 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)의 생균수, 항산화 활성 및 pH를 나타낸 것이다.

도 6은 7 L 발효조에서 본 발명 2% 프락토스와 1% 트립톤을 첨가한 배지 중 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)의 생균수, 항산화 활성 및 pH를 나타낸 것이다.

본 발명은 항산화 물질을 생산하는 바실러스 폴리퍼멘티커스의 최적화 배양 방법에 관한 것이다.

산소는 정상 대사과정 중 진핵세포에서는 미토콘드리아, 원핵세포에서는 세포막의 전자전달계에서 일렉트론 싱크(electron sink)로 작용하고 물로 환원된다. 이 과정에서 부분적인 산소의 환원에 의해 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion), 하이드록실 라디칼, 과산화수소 등의 활성산소가 형성된다.

이러한 라디칼은 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 산화시키고, 단백질과 DNA 등 여러 조직에 비가역적인 손상을 입힌다. 라디칼에 의한 조직의 손상이 축적되면 생체 기능이 떨어지게 되고, 암, 동맥경화증, 고혈압과 노화를 초래하게 된다.

생체 내에는 이러한 유해 라디칼들을 효과적으로 제거하기 위하여 여러 항산화 효소 및 항산화제가 존재한다. 슈퍼옥사이드 음이온은 항산화효소 (Super oxide dismutase; SOD)에 의해 일단 과산화수소로 변환되고 카탈라제가 과산화수소를 물로 변환시킨다. 한편 글루타티온 페록시다아제(glutathione peroxidase)는 글루타티온(glutathione)의 환원력을 이용하여 과산화수소 및 과산화물을 환원시킨다.

자유라디칼(free radical)을 소거할 수 있는 화합물이나 과산화 억제물질과 같은 항산화제를 함유한 식품은 인체의 산화적 스트레스에 의한 손상으로부터 보호해줄 수 있는 것으로 판단되어 식품첨가물로서의 항산화제가 개발되고 있고, 각종 질병 및 노화 등에 활성산소 및 과산화물이 직접적으로 작용한다는 사실이 밝혀져 질병예방 및 치료제로서의 항산화 연구가 수행되고 있다.

산업적으로 비스판균이라 불리는 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD는 생균제로서 만성 장질환을 개선하는데 사용되어 왔다. 생균제로서의 비스판균은 장티푸스 바실러스, 시겔라, 콜레라와 같은 병원성 세균을 분해하는 여러 가지 효소들을 생산한다. 비스판균 생균제는 면역 기능 강화는 물론 비타민 B₁, B₂의 훌륭한 공급원으로서 생체 내에서 생리활성을 향상시키고 소화를 돕는다.

또한 in vitro 와 in vivo 실험에서 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 콜레스테롤 저하 및 항산화능 효과를 검증한바 있다.

종래 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD를 이용한 기술로는 정장기능성 건강보조식품 조성물(대한민국 특허등록 10-0424661), 정장기능성 영양식품 조성물(대한민국 특허등록 10-0424660), 생체 산화 방지용 조성물(대한민국 특허등록 10-0518261), 콜레스테롤 저하용 조성물(대한민국 특허등록 10-0518266), 항산화 물질을 최대로 생산하는 방법(대한민국 특허출원 2005-113142) 등으로 공지된 바 있다.

본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 항산화 물질을 생산하는 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 최적화 배양 방법을 제공하 는데 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 항산화 효과가 있는 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(기탁번호 KCCM 10104)의 탄소원, 질소원을 측정하고 배양시간에 따른 항산화 활성을 측정한 후 상기 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 총 균수를 측정함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위를 본 발명의 실시예에만 한정하지는 않는다.

본 발명은 탄소원 1.0 내지 2.5 %(w/w), 질소원 0.5 내지 3 %(w/w), 무기염 0.78 %가 함유된 배지에서 배양온도 37℃, 배양시간 12 시간, pH 7.0으로 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 배양방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 탄소원이 프락토스, 락토스, 덱스트로스 또는 만니톨로 구성된 군으로부터 선택되고, 질소원은 트립톤, 소이톤, 이스트 익스트렉트, 트립톤 펩톤 또는 펩톤으로 구성된 군으로부터 선택되고, 무기염이 0.5 %(w/w) NaCl, 0.25 %(w/w) K₂HPO₄, 0.03 %(w/w) MgSO₄·7H₂O인 것임을 특징으로 하는 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 배양방법을 제공한다.

본 발명은 더욱 바람직하게는 탄소원이 프락토스, 질소원이 트립톤인 것임을 특징으로 하는 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 배양방법을 제공한다.

본 발명에서 탄소원은 생물의 영양원으로서 유기화합물로 구성된 것으로 덱스트로스, 프락토스, 락토스 등이 이에 속한다.

본 발명에서 질소원은 생물의 영양원으로서 몸체를 구성하는 단백질과 핵산, 그 밖의 질소 화합물을 만들기 위하여 외계에서 받아들이는 질소 화합물이나 질소 가스 등을 뜻하며 펩톤, 트립톤, 이스트 익스트렉트 등이 이에 속한다.

본 발명에서 무기염은 인체 내에서 여러 가지 생리적 의의를 지니고 있으며 그 대사(代謝)도 제각기 다르며 인체를 구성하는 원소로 칼슘(Ca), 인(P), 칼륨(K), 나트륨(Na), 염소(Cl), 마그네슘(Mg), 철(Fe), 요오드(I), 구리(Cu), 아연(Zn), 코발트(Co), 망간(Mn) 등의 원소가 이에 속한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 사용한 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(KCCM 10104)는 20% 글라이세롤법으로 -70℃에서 보존하였으며, 최초 배양배지는 트립틱 소이 액상(tryptic soy broth; TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였다.

하기 각각의 배양 조건으로 배양된 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 상등액을 항산화 측정 물질로 이용하여 항산화 제거 능력(1,1-diphenyl-2-picyryl hydrazyl; 이하 DPPH)에 대한 전자공여능을 측정하였다.

본 발명에서 각각의 배양 조건으로 배양된 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 총균수는 배양액을 0.1% 펩톤수로 10배씩 연속적인 희석을 시킨 다음, 평판배지에 0.1 mL씩 분주하여 도말한 후 37℃에서 배양하여 콜로니형성 단위 (colony forming unit, CFU)를 측정하였다. 또한 채취한 배양액을 pH 측정기를 이용하여 pH를 측정하였다.

본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양에 있어서 최적의 탄소원을 탐색하는 단계; 최적의 질소원을 탐색하는 단계 및 최적의 배양시간을 탐색하는 단계로 구성된다.

실시예 1: 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 의 배양

바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD를 500 mL 플라스크에 100 mL의 TSB에 접종하여 150 rpm, 37℃에서 약 6시간 동안 전배양한 후 탄소원, 질소원 등 각각의 성분이 조제되어 있는 500 mL 플라스크에 2 % 접종비로 접종하여, 다시 150 rpm, 37℃, pH 7.0으로 12시간 본배양하였다.

실시예 2: 최적 탄소원의 영향

바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 항산화 물질의 항산화 물질 생산을 위한 최적의 탄소원과 그 농도를 알아보기 위해 0.5 % NaCl, 0.25 % K₂HPO₄, 0.03 % MgSO₄·7H₂O을 기본 배지로 하여 소비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 갈락토스(galactose),글라이세롤(glycerol), 사카로오스(saccharose), 락토스(lactose), 프락토스(fructose), 덱스트로스(dextrose)를 각각 1%의 농도로 첨가하고, 기본 질소원으로 1 % 펩톤(peptone)을 첨가하였다. 12시간 배양 후 14,320×g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상등액을 항산화 측정 물질로 이용하였다.

또한 첨가한 탄소원의 농도별 영향을 알아보기 위해 가장 우수한 항산화 활성을 나타낸 탄소원을 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4%의 농도로 첨가하여 배양한 후 상등액을 이용하여 DPPH에 대한 전자공여능을 측정하였다.

DPPH은 토코페롤, 아스코르브산염, 플라보노이드 화합물, 방향족 아민류, 메일라드형 갈변 생성물질, 펩타이드 등의 항산화 활성을 나타내는 생리활성 물질에 의해 환원됨으로써 짙은 자색이 탈색되는 정도에 따라 항산화 효과를 전자공여능으로 측정하였다.

DPPH 용액은 100 mL의 에탄올에 DPPH (1,1-diphenyl-2-picyryl hydrazyl, Sigma, USA) 6 mg을 녹인 후 증류수 100 mL를 혼합하여 조제하였다. DPPH에 대한 전자공여능은 상기 4℃에서 14,320×g의 속도로 15분간 원심분리한 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 상등액 0.2 mL을 실온에서 DPPH 용액 1 mL과 30분간 반응시킨 후 528 nm에서 흡광도를 측정한 값과 다음의 식을 이용하여 나타내었다.

탄소원의 종류에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양액의 항산화 활성을 DPPH에 대한 전자공여능으로 측정한 결과는 12.1 내지 55.1 %의 범위였으며, 도 1과 같이 프락토스, 글라이세롤, 덱스트로스, 만니톨, 사카로오스, 소비톨, 갈라토스, 락토스 순으로 나타났다.

탄소원의 종류에 따른 최종 pH와 생육 정도를 표 1과 같다. 탄소원의 종류에 따른 균체 성장은 프락토스 첨가군에서 가장 높게 나타났으며, 또한 pH 6.2로 가장 낮은 pH 값을 보였다.

[표 1] 탄소원의 종류에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 생육

탄소원	최종 pH	생균수 (CFU/mL)	배양시간(hr)
소비톨	6.6	1.2×10⁷	12
만니톨	6.5	3.3×10⁷	12
갈락토스	6.6	1.1×10⁷	12
글라세롤	6.9	3.1×10⁶	12
사카로오스	6.7	1.1×10⁷	12
락토스	6.3	3.8×10⁷	12
프락토스	6.2	4.9×10⁷	12
덱스트로스	6.3	4.5×10⁷	12

바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양시 첨가한 탄소원 중에서 항산화 활성이 월등히 우수한 프락토스의 농도별 효과를 검토한 결과는 13.5 내지 61.8%의 범위였으며, 도 2와 같이 2.5, 2, 1.5, 4, 1, 0.5, 0 % 순으로 나타났다.

바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양액의 탄소원 첨가에 의한 항산화 활성은 측정값이 2.5 %의 프락토스 첨가군에서 61.8 %로 가장 높았지만 유의차가 없는 61.4 %의 활성을 보인 2% 프락토스를 보다 경제적인 배지로 판단하고 최적 탄소원 농도로 선택하였다. 프락토스의 농도에 따른 배양액의 최종 pH는 표 2와 같이 프락토스의 농도가 증가할수록 pH는 감소하는 경향을 보였다.

[표 2] 프락토스의 농도별 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 생육

프락토스의 농도 (%)	최종 pH	생균수 (CFU/mL)	배양시간(hr)
0.0	6.8	5.2×10⁶	12
0.5	6.6	1.9×10⁷	12
1.0	6.3	4.6×10⁷	12
1.5	6.3	4.7×10⁷	12
2.0	6.2	4.8×10⁷	12
2.5	6.2	5.0×10⁷	12
3.0	6.3	4.3×10⁷	12
4.0	6.2	4.5×10⁷	12

실시예 3: 최적 질소원의 영향

바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 항산화 물질의 항산화 물질 생산을 위한 질소원의 최적 조건을 확립하기 위해 0.5 % NaCl, 0.25 % K₂HPO₄, 0.03 % MgSO₄·7H₂O을 기본 배지로 하여 가장 우수한 항산화 활성을 보이는 탄소원인 2 %의 프락토스 첨가하고 소이톤(soytone), 이스트 익스트렉트(yeast extract), 펩톤(peptone), 트립톤 펩톤(tryptone peptone), 트립톤(tryptone), 암모니움 티오설페이트(ammonium thiosulfate), 암모니움 설페이트(ammonium sulfate), 소디움 카제이네이트(sodium caseinate)를 각각 1 %의 농도로 첨가하여 항산화 활성 및 균체 성장을 측정하였다. 선택된 질소원의 농도에 따른 영향을 알아보기 위해 농도를 달리하여 배양한 후 상등액을 이용하여 DPPH에 대한 전자공여능을 측정하였다.

DPPH에 대한 전자공여능 측정방법은 실시예2 같다.

바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양액의 질소원 종류에 따른 항산화 활성을 DPPH에 의한 전자공여능으로 측정한 결과 도 3과 같이, 49.0 내지 73.6 % 범위였으며 트립톤, 트립톤 펩톤, 이스트 익스트렉트, 소이톤, 펩톤, 암모니움 설페이트, 소디움 카제이네이트, 아모니움 티오설페이트 순으로 나타났다.

질소원의 종류에 따른 배양액의 최종 pH와 총균수를 표 3에 나타내었다. 질소원의 종류에 따른 균의 성장은 6.7×10⁷ CFU/mL으로 소이톤 첨가군에서 가장 높게 나타났다. 한편, 질소원 종류에 따른 pH는 소이톤 첨가군에서 가장 낮은 pH 5.9로 가장 낮은 값을 보였다.

[표 3] 질소원의 종류에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 생육

질소원	최종 pH	생균수 (CFU/mL)	배양시간 (hr)
소이톤	6.0	6.7×10⁷	12
이스트 익스트렉트	6.5	6.4×10⁷	12
펩톤	6.4	4.8×10⁷	12
트립톤 펩톤	6.0	5.8×10⁷	12
트립톤	5.9	6.1×10⁷	12
암모니움 티오설페이트	6.8	4.0×10⁶	12
암모니움 설페이트	6.9	2.8×10⁶	12
소디움 카제이네이트	6.5	2.2×10⁷	12

또한 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양시 첨가한 질소원 중에서 73.6 %의 항산화 활성을 보인 트립톤의 농도 변화에 따른 효과를 검토한 결과 도 4와 같이, 1, 1.5, 2.5, 3, 2, 0.5, 0 % 순으로 나타났으며, 75.1 %의 항산화 활성을 나타낸 트립톤 1 %를 최적 질소원 농도로 결정하였다.

가장 높은 항산화 활성이 관찰되었던 트립톤의 농도별 배양을 통해 측정된 pH와 균수를 표 4에 나타내었다. 트립톤의 농도가 높아질수록 낮은 pH 값을 보였으며, 1 내지 3 % 트립톤 첨가군까지 균수의 차이가 없었다.

[표 4] 트립톤 농도별 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 생육

트립톤 농도 (%)	최종 pH	생균수 (CFU/mL)	배양시간 (hr)
0.0	6.9	2.6×10⁶	12
0.5	5.9	5.8×10⁷	12
1.0	5.7	6.5×10⁷	12
1.5	5.6	6.7×10⁷	12
2.0	5.6	6.5×10⁷	12
2.5	5.5	6.7×10⁷	12
3.0	5.5	6.5×10⁷	12

실시예 4: 배양시간의 영향

배양 시간에 따른 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD 배양액의 항산화 활성을 측정하기 위하여 상기 실시예 2에서 최적 탄소원으로 선택한 2 % 프락토스와 상기 실시예 3에서 최적 질소원으로 선택한 1% 트립톤을 첨가한 배지를 이용하여 500 mL 플라스크에서 12시간 배양하고 2시간 간격으로 상등액을 채취하여 DPPH에 대한 전자공여능을 측정하였다.

DPPH에 대한 전자공여능 측정방법은 실시예2 같다.

도 5와 같이 배양 12시간에 최대 항산화 활성인 73.1 %에 도달했으며, 배양 10시간 만에 최대 균수 (8.4×10⁷ CFU/mL)를 얻을 수 있었다. 따라서 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 항산화 활성에 대한 탄소원과 질소원의 영향을 측정한 결과를 종합하여 가장 높은 활성을 보인 최적의 배지 조성은 2 %의 프락토스, 1 %의 트립톤, 0.5 %의 NaCl, 0.25 %의 K₂HPO₄, 0.03 %의 MgSO₄·7H₂O가 첨가된 배지로 결정하였다.

본 발명자들은 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 항산화 활성을 위한 최적의 배지를 J24 배지로 명명하였다.

실시예 5: 발효조에서의 배양

상기 실시예 2 내지 4를 통해 확립된 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD의 항산화 활성에 대한 최적 배지의 산업적인 가능성을 알아보기 위해 7 L 발효조를 이용하였다.

배양 조건은 온도 37℃, 교반속도 500 rpm, 통기량 1 vvm, 배양량 5 L, 접종비 5 % (v/v), pH 7.0의 조건으로 12시간 동안 배양을 실시하여 항산화 활성, 총균수 및 pH를 측정하였다.

도 6과 같이, 배양 8시간 만에 71.3%의 항산화 활성과 최대 8.2×10⁷ CFU/mL 균수를 얻었으며, 500 mL 플라스크에서의 배양 시 보였던 최대 항산화 활성 73.1 %와 비슷한 항산화 활성을 보였다.

따라서 배양시간이 12시간에서 8시간으로 단축됨으로써 생산성은 30 %이상 증가되었다.

8.2×10⁷ CFU/mL균수를 얻었으나, 500 mL 플라스크에서의 배양시 보였던 최대 항산화 활성 73.1 % 보다 낮은 항산화 활성을 보였다.

이상 본 발명의 구성의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD으로부터 항산화 물질을 생산하는 최적의 배양 방법을 제공 하는 효과가 있으므로 식품 및 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

프락토스 2.0%(w/w), 트립톤 1.0%(w/w), NaCl 0.5%(w/w), K₂HPO₄ 0.25%(w/w), MgSO₄ 7H₂0 0.03%(w/w)가 함유된 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(Bacillus polyfermenticus SCD, 기탁번호 KCCM 10104)의 항산화물질 생산용 배지 조성물.
제 1항 기재의 배지에서, 배양온도 37℃, pH 7.0, 배양시간 8 내지 12시간으로 배양하는 것을 특징으로 하는 항산화물질을 생산하기 위한 바실러스 폴리퍼멘티커스 SCD(Bacillus polyfermenticus SCD, 기탁번호 KCCM 10104)의 배양방법.
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