KR19990025670A

KR19990025670A - 액체발효에 의한 비스판균의 제조방법

Info

Publication number: KR19990025670A
Application number: KR1019970047382A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 성승희; 김현수; 전경동; 김원석; 이백천
Original assignee: 이백천; 주식회사 순천당제약
Priority date: 1997-09-13
Filing date: 1997-09-13
Publication date: 1999-04-06
Also published as: KR100233615B1; JPH11103855A; JP3954711B2; US6010898A

Abstract

본 발명은 비스판균을 생산하기 위한 경제적이고 효율적인 액체 발효법을 제공한다. 본 발명의 방법에서는 포도당 1-3%; 옥수수전분 l-5%, 대두분 1-5%, 및 옥수수 침지액으로 이루어진 성분에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 성분; 그리고 미량성분으로서 제1인산칼륨 0.05-0.5%, 제2인산칼륨 0.05-0.5%, 염화칼슘 제 2수화물 0.05-0.5%, 황산마그네슘 7수화물 0.01-0.1%, 황산구리 5수화물 0.001-0.01%, 황산망간 0.001-0.01%, 황산철 7수화물 0.001-0.01%, 황산아연 7수화물 0.001-0.01%를 포함하는 액체배지를 이용하여 비스판균을 증식시키며, 배양 초기에 배지중의 포도당이 소모되었음을 확인한 후, 3-4회에 걸쳐 농축포도당을 공급한다.

Description

액체발효에 의한 비스판균의 제조방법

본 발명은 액체발효에 의해 비스판균을 대량으로 생산하여 그 활성 아포균을 획득할 수 있는 제법에 관한 것이다.

의약용 및 시판 생균을 응용한 정장제에 사용되고 있는 세균은 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermentucius) 등이다. 이 중에서도 B. polyfermenticus 균은 활성 아포를 형성하여 생균 대부분이 장에 도달되어 장기간 장질환에 대해 치료효과를 보이고 있는 가장 우수한 균으로서 일반적으로 비스판균이라고 불리고 있다.

비스판균은 일본약국방외의약품성분규격에 당화균(Amylolytic bacillus)이라 하여 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 메센테리쿠스와 같이 게재되어 있으나(일본후생성약무국심사과 감수 : 일본약국외의약품성분규격 735-1125, 1991), 국제명명규약(예를 들어 Bergey's manual)에 의한 분류명에는 존재하지 않는다 (Sneath, P.H.A. : Endospore-forming gram-positive rods and cocci. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1st ed. 1104-1207, Williams Wilkins, Baltimore, 1986). 그러나 여러 연구에 의하면, 형태 및 생화학적인 성상을 비교해 볼 때, 바실러스 서브틸리스와 상당히 유사한 것으로 인정되고 있으나, 바실러스 서브틸리스와 다른 점은 비스판균은 락토스를 분해하는 능력이 있고 글루코스와 락토스에서 초산과 유산을 더욱 많이 생산하는 것등이다.

비스판균은 1933년 일본의 미생물학자인 寺門賀述 박사팀이 공기로부터 분리한 아포성 간균이며 여러 종류의 효소를 분비하여 병원성균들인 티프스균, 파라티프스균, 적리균, 콜레라균등을 용균시켜 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 또한 섭취할 경우 비타민 B₁, B₂를 공급하여 식욕 및 소화작용을 촉진시키고, 비 경구적 감염방어 작용과 경구적 면역능이 증강된다는 사실도 밝혀져 있다.

지금까지 비스판균의 배양과 이 균의 응용에 관해서는 일본특허공보 소화 11-123호 (일본특허 제 115281호) 세균을 이용하여 장질환 치료약을 제조하는 방법을 들 수 있다. 상기 특허는 비스판균의 배양액을 65^oC로 1시간 가열하고 난 후 33^oC로 24시간 두고 다시 65^oC로 1시간 가열하는 조작을 4회 반복한 후 초산으로 약산성으로 하여 가온건조하는 공정과 이 비스판균의 배양균체에 0.3-0.5% 황산수를 가하여 37^oC로 둔 후 가온건조시키는 공정과 이 균체의 일정량을 전분 및 유당에 혼합하여 만드는 각 공정의 결합을 특징으로 하고 있다.

그러나 상기와 같은 배양공정은 비스판균의 배양 균체를 회수함에 있어 지나치게 많은 단계를 거치고 장시간을 요하므로 경제성이 현저하게 떨어지는 단점을 안고 있다. 특히 종래에 비스판균의 배양에 사용되던 배지 (부이욘 (Bouillon) 배지)는 값이 비싸기 때문에 경제성이 더욱 떨어지는 단점이 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 보다 경제적이고 높은 효율로서 비스판균을 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면 비스판균의 대량 제조방법이 제공된다.

본 발명에 따른 비스판균의 제조방법은 배양액중의 활성 아포균의 수를 증가시킬 수 있게 한다.

본 발명의 제조방법은 비스판균 (Bacillus polyfermenticus) SCD를 포도당 1-3 중량%; 옥수수전분 l-5 중량%, 대두분 1-5 중량%, 및 옥수수 침지액으로 이루어진 성분에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 성분; 그리고 미량성분으로서 제1인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 제2인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 염화칼슘 2수화물 0.05-0.5 중량%, 황산마그네슘 7수화물 0.01-0.1 중량%, 황산구리 5수화물 0.001-0.01 중량%, 황산망간 0.001-0.01 중량%, 황산철 7수화물 0.001-0.01 중량%, 황산아연 7수화물 0.001-0.01 중량%를 포함하는 액체 생산배지에 접종하는 단계; 및 30-37^oC에서 pH를 6.8-7.2로 조절하면서 호기적으로 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

배지조성에 따라서 균의 생산에 영향을 주고 있음은 공지된 바 있으나, 본 발명자들은 가장 경제적인 즉, 가격이 저렴하고 효과가 우수한 탄소원, 질소원, 미량원소를 선정하고, 이에 가장 적합한 배양조건을 규명함으로써 생산 여건의 경제성을 높일 수 있도록 하였다.

한편, 비스판균의 총 생균수는 발효배양액을 0.1% 펩톤수로 연속적으로 희석을 시킨다음, 평판배지에 0.1ml씩 분주한 후, 37^oC에서 24시간 배양한 후, 콜로니 형성단위(Colony forming unit; CFU)를 측정하여 계산하였다. 활성아포균수는 발효배양액을 80^oC에서 2시간 열처리하여 영양세포를 사멸시키고, 무균의 희석액으로 연속적으로 희석시킨후, TSA (Tryptic Soy Agar) 평판배지에 0.1ml을 떨어뜨린다음 연질 아가(soft agar)로 오버레이하여 37^oC에서 24시간 배양하여 측정하였다.

본 발명의 방법에 의해 배양된 배양액은 적의의 방법으로 처리하여 분제 또는 액제 등으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 분제로 제제화하고자 하는 경우에는 분무식건조법, 동결건조법등을 사용할 수 있다. 분무식건조법에서는 전착제, 안정제, 희석제등을 건조시에 첨가함으로써 분말을 획득할 수 있다. 이 때 사용되는 전착제, 안정제 또는 희석제등은 당업계에 주지되어 있으며, 그 구체적인 종류와 양은 제제의 종류 및 사용 목적에 맞게 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하 각종 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한된 것은 아니다. 하기 각종 예에서, % 단위는 다른 언급이 없는 한 중량%이다.

참고예 1

본 발명자들은 시판중인 비스판제제로부터 비스판균을 분리하고 동정하였다.

즉, 수입 생균제제의 원 분말을 영양 한천(Nutrient Agar) 또는 트립틱 소이 한천 (Tryptic Soy Agar)에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 콜로니 형태, 색상 및 표면의 특징이 다르다고 생각되는 집락을 선택하여 희석법으로 순수분리하고 각각 균들을 그램 염색법, 말라카이트 그린 (Malachite Green) 포자 염색법, 편모 염색법 등을 사용하여 현미경으로 관찰하였다. 생화학적 성질 및 자화성은 문헌 (Biochemical tests for Identification of medical bacteria; Manual for the Identification of medical bacteria)에 제시된 방법으로 시험하였으며, 결과를 일본에서 발표된 장질환 유효세균의 실험결과와 비교하였다.

본 발명자들은 이렇게 하여 분리된 비스판균을 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD)라 명명하고 1997년 8월 5일자로 한국종균협회부설 미생물보존센타에 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁하고 KCCM 10104의 수탁번호를 부여받았다.

본 발명에 따라 분리된 비스판균의 균주 특성을 동정한 결과는 다음과 같다.

비스판균(KCCM 10104)의 형태, 배양 및 생리학적 특성

특 성	비스판균 SCD(KCCM 10104)	시판 비스판균
형태	간 균	간 균
그람염색성	양 성	양 성
운동성	있 슴	있 슴
아포 형성능	있 슴	있 슴
산소요구성	호 기 성	호 기 성
포도당으로부터 산 생성능	있 슴	있 슴
전분 가수분해능	양 성	양 성
젤라틴 가수분해능	양 성	양 성
카제인 가수분해능	양 성	양 성
버지스-프로스카우어 테스트(VOGES-PROSKAUER TEST)	양 성	양 성
질산염 환원	양 성	양 성
구연산 이용성	양 성	양 성

실시예 1

사용균주 : 비스판균(Bacillus polyfermenticus) SCD (KCCM 10104)

종배양 : 배지는 TSB (트립틱 소이 브로스)를 사용하여 500ml 배플 플라스크에 종균을 한 백금이 (one loopful)의 양으로 접종하여 37^oC에서 교반속도 200rpm으로 10시간 진탕배양하여 종배양을 실시하였다.

생산배지의 조성 및 조제방법

포도당 20g/l

옥수수전분 10g/l

대두분(콩가루) 30g/l

미량성분: 제1인산칼륨 1g/l

제2인산칼륨 1g/l

염화칼슘 2수화물 0.1g/l

황산마그네슘 7수화물 0.3g/l

황산구리 5수화물 0.01g/l

황산망간 0.02g/l

황산철 7수화물 0.02g/l

황산아연 7수화물 0.02g/l

상기 배지 성분 중 열에 안정한 것, 즉 옥수수전분, 대두분, 염화칼슘 2수화물은 121^oC에서 20분간 가압살균하고 열에 불안정하거나, 착화합물을 생성하는 성분, 즉 포도당 및 염화칼슘 2수화물을 제외한 미량성분들은 구멍크기가 0.45μm인 일회용 무균여과기(disposable membrane filter)를 통과시킨 후 무균적으로 발효조에 첨가하였다.

배양방법

5리터 발효조에 3리터의 상기 생산배지를 사입하고, 상기 종배양액 30-60ml을 접종하여 30-37^oC에서 배양중에 pH를 6.8-7.2로 조절하고, 통기량은 1.0vvm으로 유지하였다. 회전교반수는 500-700rpm으로 배양하였다. 접종후 72-96시간이 경과한 후 배양을 종료하였다.

배양초기에 배지중에 포도당이 소모되었음을 확인한 후, 3-4회에 걸쳐 포도당 농도가 배지중에 1%가 되도록 살균된 농축 포도당을 공급하는 유가배양법을 채택하였을 때, 회분식 배양과 비교하여 표 2에서 보는 바와 같이 비스판균 수의 상당한 증가를 보았는데, 최대 활성아포수가 약 58% 증가하였다.

배양시간 (시간)	활성아포수/ml
배양시간 (시간)	회분식 배양	유가식 배양
24	1.70 x 10⁸	1.95 x 10⁸
36	6.55 x 10⁸	8.24 x 10⁸
48	1.80 x 10⁹	2.20 x 10⁹
60	2.17 x 10⁹	4.26 x 10⁹
72	2.34 x 10⁹	5.10 x 10⁹
96	3.28 x 10⁹	5.20 x 10⁹
120	2.96 x 10⁹	5.20 x 10⁹

실시예 2 - 4

실시예 1과 같은 조건에서 배양을 행하되, 이때 이용된 생산배지의 조성은 다음의 표 3과 같다.

배지성분	실시예 2	실시예 3	실시예 4
포도당	20 g/l	20 g/l	30 g/l
옥수수전분	10 g/l	-	20 g/l
옥수수침지액	100 ml/l	-	40 ml/l
대두분	-	25 g/l	15 g/l
미량성분	+	+	+

상기 표 3에 나타낸 각각의 배지들을 이용하여 비스판균 SCD를 회분식으로 배양하거나, 또는 상기 실시예 1과 같은 조건의 유가식으로 배양한 배양액의 최대 활성아포균수는 표 4와 같다.

실시예	최대 활성아포수/ml	증가율(%)
실시예	회분식 배양	증가율(%)	유가식 배양
2	2.80 x 10⁹	4.25 x 10⁹	51.0
3	2.40 x 10⁹	4.10 x 10⁹	70.8
4	3.10 x 10⁹	4.84 x 10⁹	56.1

실시예 5

본 발명에 따른 배지가 비스판균 생산에 우수한 것을 확인하기 위하여, 실시예 1의 배지 및 바실러스 균의 배양에 통상적으로 널리 사용되는 TSB (Tryptic Soy Broth) 배지를 이용하여 실시예 1과 같은 조건에서 회분식 배양을 행하고, 최대활성 아포수 및 생산성을 비교하였다. 결과는 하기 표 5와 같다.

배양배지	최대활성아포수(CFU/ml)	생산성
TSB	1.71 × 10⁹	5.7 × 10⁸CFU/ml/day
실시예 1	3.28 × 10⁹	8.2 × 10⁸CFU/ml/day

상기 표 5의 결과로부터, 본 발명에 따른 배지를 이용한 배양에 있어서, 비스판균의 생산이 약 44% 정도 증가되는 것을 확인할 수 있다.

실시예 6

본 발명에 따른 배지가 비스판균 생산에 우수한 것을 확인하기 위하여, 실시예 6과 동일하게 실시하되, 회분식의 배양방식 대신에 배지중의 포도당이 소모된 후 농축 포도당을 1%의 농도로 첨가하는 유가식의 배양방식을 채택하였다. 두 가지 배지를 이용하여 행한 배양의 결과 얻어진 배양액의 최대활성 아포수 및 생산성을 비교하였다. 결과는 하기 표 6과 같다.

배양배지	최대활성아포수(CFU/ml)	생산성
TSB	2.05 × 10⁹	6.8 × 10⁸CFU/ml/day
실시예 1	5.2 × 10⁹	13.0 × 10⁸CFU/ml/day

상기 표 6의 결과로부터, 본 발명에 따른 배지를 이용한 유가식 배양에 있어서, 비스판균의 생산이 약 90% 정도 증가되는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 방법은 기존의 비스판균 배양방법에 비해 값이 저렴한 배지를 이용하면서도 종래 방법에 비해 월등히 우수한 생산성의 향상을 가져올 수 있다.

Claims

비스판균 (Bacillus polyfermenticus)을 포도당 1-3 중량%; 옥수수전분 l-5 중량%, 대두분 1-5 중량%, 및 옥수수 침지액으로 이루어진 성분에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 성분; 그리고 미량성분으로서 제1인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 제2인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 염화칼슘 2수화물 0.05-0.5 중량%, 황산마그네슘 7수화물 0.01-0.1 중량%, 황산구리 5수화물 0.001-0.01 중량%, 황산망간 0.001-0.01 중량%, 황산철 7수화물 0.001-0.01 중량%, 황산아연 7수화물 0.001-0.01 중량%를 포함하는 액체 생산배지에 접종하는 단계; 및

30-37^oC에서 pH를 6.8-7.2로 조절하면서 호기적으로 배양하는 단계

를 포함함을 특징으로 하는 액체배양에 의해 비스판균을 증식하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 액체 생산배지는 포도당 1-3 중량%, 옥수수전분 1-5 중량%, 옥수수침지액 5-20 중량% 및 미량성분을 증류수에 녹여 혼합한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 액체 생산배지는 포도당 1-3 중량%, 대두분 1-5 중량% 및 미량성분을 증류수에 녹여 혼합한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 액체 생산배지는 포도당 1-3 중량%, 옥수수전분 1-3 중량%, 옥수수침지액 2-10 중량%, 대두분 1-3 중량% 및 미량성분을 증류수에 녹여 혼합한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 비스판균은 비스판균 SCD (KCCM 10104)이고, 배양 도중에 배지 중의 포도당이 소모되었을 때 일정한 간격으로 살균 농축포도당을 약 1중량%로 첨가하는 유가식으로 실시함을 특징으로 하는 방법