KR20170049292A - 락토바실러스 플란타룸 ｋｃｃ―２６ 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주 및 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-26(KACC92081P)의 항균 활성을 이용하여 다양한 항균용 조성물 및 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공하며, 특히 사일리지 제조용 미생물 첨가제를 제공한다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항균 활성이 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지에 관한 것이다.
최근, 소비자들은 인간과 동물 식품의 보존에 대한 새로운 대안 계획을 보고 식품산업에 사용되는 천연 및 화학 보존제에 대한 그들의 수요를 증가시켰다. 용어 "프로바이오틱(probiotic)"은 살아있는 미생물 배양균이 포함된 식품 보충제로 설명된다. 이는 숙주 동물의 장내 미생물 균형 향상을 통해 이로운 효과를 제공하고 영양 흡수 강화를 통해 장내 미생물 균형의 대단한 향상을 이끈다(Fuller R. (1989), Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, 66, 365 - 378). 또한, 위장관의 병원균에 강력한 길항제 효과를 나타낸다(Akbar, A and Anal, A. (2014b), Occurrence of Staphylococcus aureusand evaluation of anti-staphylococcal activity of Lactococcus lactis subsp. lactis in ready-to-eat poultry meat. Annals of Microbiology, 64, 131 - 138). 유산균(젖산균, lactic acid bacteria)은 다른 병원성 박테리아를 사멸시킬 수 있는 항균 대사물을 생산한다(Kobayashi, T., Kajiwara, M., Wahyuni, M., Wahyuni, M., Hamada-Sato, N., Imada, C. and Watanabe E. (2004) Effect of culture conditions on lactic acid production of tetragenococcus species. Journal of applied Microbiology, 96, 1215 - 1221). 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속에 속하는 프로바이오틱으로 분류할 수 있는 수많은 미생물이 존재한다. 그 중, 젖산균(Lactobacilli)은 발효 유제품, 고기, 채소 및 시리얼 제품 산업 가공의 장내 유기체로 간주된다. 식품이 프로바이오틱 상태에 이르기 위하여 WHO(세계 보건 기구)에 따르면, 미생물은 그들의 안전 및 생물학적 특성에 관련된 원칙을 충족시켜야만 한다. 안전의 관점에서, 프로바이오틱 미생물은 어떠한 병원성을 나타내지 않아야 하고, 항생제 내성 유전자로 전환되지 않아야 하며 유전적 안정성을 유지하여야 한다.
한편, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 젖산 생성 혐기성 박테리아이며, 그람-양성, 비-포자-생성 발효 박테리아이다. 이는 발효 식품에 살고 있고 동물의 위장관 및 비뇨기관에서 생존한다. 유산균은 숙주 동물에 어떠한 독성도 나타내지 않는다. 이는 다양한 긍정적인 생리학적, 생화학적 및 유전적 특성을 보여준다. 이러한 박테리아는 생물학적으로 중요한 펩티드, 엑소-다당류, 이차 대사물 및 다른 유기 화합물을 생산하는 능력을 가지고 있다(Tororov, S. D., Botes, M., Guigas, C., Cchillinger, U., Wiid, I. and Wachsman, M.B. (2008), Boza a natural source of probiotic lactic acid bacteria. Journal of applied Microbiology, 104, 465 - 477). 유산균은 많은 발효식품, 특히, 우유 기반 제품, 의 생산에 지배적인 역할을 한다(Caplice, E.and Fitzgerald, G.F.(1999), Food fermentation: role of microorganisms in food production and preservation. International Journal of Food Microbiology, 50,131 - 149). 유전자 변형 생물체(genetically modified organisms)는 수많은 식품을 개선하는데 기여해 왔다. 그러나, 이는 몇가지 이유 때문에 제한이 있다. 그래서, 천연 공급원으로부터 고유 균주의 발견은 신규한 유산균을 식별하기 위한 가장 최적의 접근법으로 간주되어야 한다. 따라서, 야생 젖산을 분리 및 특성화하고 이들의 생물학적 잠재력을 평가하기 위해 시험관 모델(in-vitro model)을 계획하였다.
한편, 간에서 합성된 담즙산은 포유동물에서 콜레스테롤 대사의 중요한 최종 산물이며, 타우린 또는 글리신과 접합 후에 답즙에서 분비된다. 식사 중에 포함되어 있는 지질의 섭취시에 담즙산은 혼합되며, 십이지장에서 흡수를 위해 지질과 유화된다.
최근에, 고콜레스테롤혈증 환자의 혈청 콜레스테롤 수준을 낮추거나 정상적인 콜레스테롤 수준을 갖는 사람의 고콜레스테롤혈증을 예방하기 위해, 포유동물의 장에 존재하는 장내 세균에 의한 담즙산염 분해 가능성에 대해 관심이 집중되었다 (Larsen et al. 2000. Blood Press 9: 91 - 97). 장내 세균에 의한 콜레스테롤의 조절은, 장내 세균이 담즙산염 가수분해효소 (bile salt hydrolase, Bsh)에 의해 접합된 담즙산염의 가수분해를 통해 혈중 콜레스테롤 수준을 현저하게 감소시킬 수 있다는 관찰에 기초한다. 장내 세균에 의해 생산된 Bsh는 글리신 또는 타우린 및 콜레스테롤 기재 담즙산 사이의 아미드 결합의 가수분해를 촉매한다 (Begley et al. 2006. Appl. Environ. Microbiol. 72: 1729 - 1738). 탈접합된 담즙산은 수용성이 낮기 때문에 대변으로 용이하게 배출된다. 담즙산의 대변 손실 및 간으로 되돌아오는 담즙산염의 감소된 양은 담즙산염 항상성을 유지하기 위해 콜레스테롤의 담즙산염으로의 전환을 증가시킬 수 있다. Bsh 활성을 갖는 락토바실러스의 경구 투여는 인간 및 기타 동물에서 혈중 콜레스테롤 수준을 낮춘다 (De Smet et al. 1994. Microbial Ecology in Health and Disease 7: 315 - 329; Ha et al. 2006. J. Microbiol. Biotechnol. 16: 1201 - 1209).
조사료는 일시에 다량 생산되므로 연중 안정적인 급여를 위해서는 저장을 해야 하는데, 수분을 제거한 저장이 건초인 반면 수분이 있는 상태에서 저장을 하는 것이 사일리지(silage)이다. 최근 들어 사일리지의 품질 향상을 위한 첨가제의 필요성에 대한 인식이 확산되면서 국내산 사일리지용 첨가제를 개발하기 위한 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 사일리지는 가열공정을 거치지 않기 때문에 곰팡이 등과 같은 미생물들은 적당한 환경(온도, 영양 및 pH 조건)이 구비되면 번식이 용이하여 사일리지의 보관에 어려움을 겪고 있다. 또한, 사일리지 제조기술 부족과 유통, 보관 시 부주의로 곰팡이 등이 발생하면서 가축의 기호성이 감소되고 섭취량이 줄어드는 문제가 발생한다. 또한, 호기조건에 있는 사일리지는 영양적으로도 커다란 손실을 유발한다.
따라서, 사일리지에 발생하는 곰팡이를 억제함으로써 발효 효율 및 사료 저장성을 증진시킬 뿐만 아니라 사료의 영양성, 기호성 및 소화율도 향상시킬 수 있는 첨가제의 개발이 필요하다. 또한 병원성 균을 사멸시키며, 면역 시스템을 가속화하여, 생리학적 기능을 향상시킬 수 있는 생균제의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 균주를 포함하는 항균용 조성물, 프로바이오틱 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물, 사일리지 발효용 미생물 첨가제, 사일리지 제조방법, 또는 사료용 조성물 등을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 처리하여 발효 대사 생성물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 제공한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-26 균주는 2015년 06월 29일자로 농업생명공학연구원(KACC)에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC92081P를 부여받았다.
상기 KCC-26 균주는 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 비-운동성, 막대-형태, 카탈라아제-음성 또는 중온성(mesophilic);
b) D-아라비노스(D-Arabinose), L-아라비노스(L-Arabinose), D-리보오스(D-Ribose), D-자일로스(D-Xylose), L-자일로스(L-Xylose), D-갈락토오스(D-Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프룩토오스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose), D-만니톨(D-Mannitol) 또는 메틸-αD-만노사이드(Methyl-αD-mannoside) 를 발효시킬 수 있음;
c) 글리세롤(glycerol), 메틸-β-자일로사이드(Methyl-β-D-xiloside), D-아도니톨(D-Adonitol), L-소르보스(L-Sorbose) 또는 L-람노스(L-Rhamnose) 를 발효시킬 수 없음;
d) 발효 대사 생성물로서 젖산, 아세트산 또는 숙신산을 생산할 수 있음;
e) pH 2 내지 3의 환경에서 성장율이 우수함;
f) 담즙염이 포함된 환경에서 성장율이 우수함; 또는
g) Bsh(Bile salt hydrolase) 활성이 우수함.
상기 KCC-25 균주는 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 비-운동성, 막대-형태, 카탈라아제-음성 또는 중온성(mesophilic);
b) D-아라비노스(D-Arabinose), L-아라비노스(L-Arabinose), D-리보오스(D-Ribose), D-자일로스(D-Xylose), L-자일로스(L-Xylose), D-갈락토오스(D-Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프룩토오스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose), D-만니톨(D-Mannitol) 또는 메틸-αD-만노사이드(Methyl-αD-mannoside) 를 발효시킬 수 있음;
c) 글리세롤(glycerol), 메틸-β-자일로사이드(Methyl-β-D-xiloside), D-아도니톨(D-Adonitol), L-소르보스(L-Sorbose) 또는 L-람노스(L-Rhamnose) 를 발효시킬 수 없음;
d) 발효 대사 생성물로서 젖산, 아세트산 또는 숙신산을 생산할 수 있음;
e) pH 2 내지 3의 환경에서 성장율이 우수함;
f) 담즙염이 포함된 환경에서 성장율이 우수함; 또는
g) Bsh(Bile salt hydrolase) 활성이 우수함.
상기 KCC-27 균주는 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 비-운동성, 막대-형태, 카탈라아제-음성 또는 중온성(mesophilic);
b) D-아라비노스(D-Arabinose), L-아라비노스(L-Arabinose), D-리보오스(D-Ribose), D-자일로스(D-Xylose), L-자일로스(L-Xylose), D-갈락토오스(D-Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프룩토오스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose), D-만니톨(D-Mannitol), 글리코겐(glycogen), 메틸-αD-만노사이드(Methyl-αD-mannoside), D-타가토스(D-Tagatose), D-퓨코스(D-Fucose) 또는 L-퓨코스(L-Fucose)를 발효시킬 수 있음;
c) 글리세롤(glycerol), 메틸-β-자일로사이드(Methyl-β-D-xiloside), D-아도니톨(D-Adonitol), L-소르보스(L-Sorbose) 또는 L-람노스(L-Rhamnose) 를 발효시킬 수 없음;
d) 발효 대사 생성물로서 젖산, 아세트산 또는 숙신산을 생산할 수 있음;
e) pH 2 내지 3의 환경에서 성장율이 우수함;
f) 담즙염이 포함된 환경에서 성장율이 우수함; 또는
g) Bsh(Bile salt hydrolase) 활성이 우수함.
상기 KCC-28 균주는 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 비-운동성, 막대-형태, 카탈라아제-음성 또는 중온성(mesophilic);
b) 글리세롤(glycerol), 에리스리톨(Erythritol), D-아라비노스(D-Arabinose), L-아라비노스(L-Arabinose), D-리보오스(D-Ribose), D-자일로스(D-Xylose), L-자일로스(L-Xylose), D-갈락토오스(D-Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프룩토오스(D-Fructose), 자일리톨(xylitol), D-만노스(D-Mannose), D-만니톨(D-Mannitol) 또는 메틸-αD-만노사이드(Methyl-αD-mannoside) 를 발효시킬 수 있음;
c) 메틸-β-자일로사이드(Methyl-β-D-xiloside), D-아도니톨(D-Adonitol), L-소르보스(L-Sorbose), L-람노스(L-Rhamnose), D-라피노스(D-Raffinose), D-투라노스(D-Turanose) 또는 D-릭소스(D-Lyxose) 를 발효시킬 수 없음;
d) 발효 대사 생성물로서 젖산, 아세트산 또는 숙신산을 생산할 수 있음;
e) pH 2 내지 3의 환경에서 성장율이 우수함;
f) 담즙염이 포함된 환경에서 성장율이 우수함; 또는
g) Bsh(Bile salt hydrolase) 활성이 우수함.
상기 본 발명의 균주는 프로바이오틱(probiotic) 활성을 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 균주는 장내의 소화기관에서 분비되는 여러 가지 물질들을 견뎌낼 수 있는 내산성 또는 내담즙성을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 균주는 장내 생존력이 우수할 수 있으며, 특히 위액 또는 담즙염 환경에서의 생존력이 우수할 수 있다. 또한, 우수한 프로바이오틱 활성을 나타내기 위한 장내 정착(colonization)의 첫 단계인 장 부착성 또는 병원성 세균 억제능이 우수할 수 있다.
따라서, 상기 균주는 위액 또는 담즙염이 포함된 환경에서 생존 능력이 향상된 것일 수 있다. 상기 환경은 pH 1 내지 4의 낮은 pH 환경 일 수 있고, 바람직하게는 pH 2 내지 3의 환경일 수 있다. 또한, 상기 환경은 담즙염의 성분이 포함된 환경일 수 있으며, 상기 환경을 갖추고 있다면 체내뿐만 아니라 그 외 다른 장소에서도 생존 능력이 향상될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 곰팡이 등은 발효가 불량한 사일리지에서 다량 발견되고 발효가 양호하게 된 사일리지에서는 육안으로 판별하기 어려울 정도이기 때문에 사일리지 곰팡이 억제기능이 우수한 젖산균을 선발 및 분리하여 사일리지 보존성을 높이고자 하였다.
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 균주를 동물의 분뇨로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 락토바실러스 플란타룸 균주의 효소 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸 균주의 동정 단계; 및 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 프로바이오틱 특성을 검정하는 단계를 거쳐, 항균 활성, 콜레스테롤 저하 활성이 우수한 신규 미생물인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 및 KCC-28 균주를 얻었다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 및 KCC-28 균주는 부패 미생물의 활성을 저하시키고 생육을 억제시켜 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 포함하는 항균용 조성물 및 항균용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 부패 미생물은 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus Fumigates), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium Chrysogenum), 페니실리움 로케포티(Penicillium Roqueforti), 보트리티스 엘립티카(botrytis elliptica), 및 후자리움 옥시스포룸(Fusarium Oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기와 같은 우수한 항균 효과로 인해 상기 균주는 항균용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 프로바이오틱 효과로 인해서 다양한 항균용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
따라서, 상기 항균용 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 약학 조성물 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.
따라서, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다. 이때, 상기 균주의 배양액에는 상기 균주가 생산해 낸 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균물질들이 포함되어 있어 프로바이오틱 조성물에 포함되었을 때, 균주를 포함한 조성물과 동등한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 발명자들은 상기 균주가 포함된 조성물을 프로바이오틱 조성물로서 활용할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다. 상기 프로바이오틱 조성물은 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 pH 2 내지 3의 환경에서 우수한 활성을 나타낼 수 있다. 상기 낮은 pH 의 환경은 위액을 포함하는 환경일 수 있다.
또한, 상기 프로바이오틱 조성물은 담즙염이 포함된 환경에서도 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 프로바이오틱 조성물 제조방법에 따라 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조하여 이용할 수 있다.
상기와 같은 우수한 프로바이오틱 효과로 인해 상기 균주는 프로바이오틱 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 효과로 인해서 다양한 프로바이오틱 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 균주는 바람직하게는 상기 우수한 항균 활성으로 인해 사일리지 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.
또한, 부패 미생물등과 같은 원하지 않는 미생물에 의한 사일리지 풍미 감소 등을 예방하여, 가축의 기호성을 증진시킬 수 있는 추가 효과까지 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 신규 균주는 우수한 콜레스테롤 저하 활성을 가지며, 본 발명의 균주를 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물 제조방법 및 상기 균주를 포함하는 조성물을 처리하여 콜레스테롤을 저하하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 신규 균주는 Bsh 활성이 향상된 것일 수 있다. 상기 Bsh 활성이 향상된 상기 신규 균주가 포함된 조성물은 체내 콜레스테롤 이용율을 향상시켜 효과적으로 체내 콜레스테롤을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25), KCC-26(KACC92081P), KCC-27 및 KCC-28 균주가 항균 효과뿐만 아니라, 상기 Bsh 활성 향상 효과, 즉 콜레스테롤 저하 효과가 우수함을 실험을 통해 확인하였다.
상기와 같은 우수한 콜레스테롤 저하 효과로 인해 상기 균주는 콜레스테롤 저하용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 효과로 인해서 다양한 콜레스테롤 저하용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
따라서, 상기 콜레스테롤 저하용 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 약학 조성물 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 콜레스테롤 저하용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 균주는 Bsh(Bile salt hydrolase) 활성이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, Bsh 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.
본 발명의 균주를 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물의 경우, 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 약학 조성물 제조방법에 따라 제조하여 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공하며, 더욱 자세하게는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사료로 이용될 수 있는 식물체라면 모두 이용될 수 있다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물체에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료용 조성물은 업계에서 일반적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있고, 이러한 신규 균주는 우수한 항균 활성으로 인해 사료용 조성물로 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28 균주를 처리하여 발효 대사 생성물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 발효 대사 생성물은 상기 균주가 세포 내에서 발효 과정을 거쳐 세포 외로 분비 또는 세포 내에 저장하고 있는 생성물을 의미하며, 바람직하게는 젖산, 아세트산 또는 숙신산일 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 또는 KCC-28은 우수한 항균 활성 및 콜레스테롤 저하 효과를 가진다. 본 발명의 항균용 조성물 또는 콜레스테롤 저하용 조성물은 독성이 없어 우수한 프로바이오틱 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.
도 1은 A.fumigatus에 대한 Lactobacillus plantarum 균주의 항균 활성을 나타낸 사진이다. 1 : KCC-25, 2 : KCC-26, 3 : KCC-27, 4 : KCC-28
도 2는 호기성 및 미세-호기 조건하에서 MRS 부용, 보리 주스, 옥수수 주스, 이탈리아 라이그라스 주스의 L. plantarum KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 발효 배양물을 나타낸 그래프이다. A : 젖산(mg/ml), B : 아세트산(mg/ml), C : 숙신산(mg/ml)
도 3은 L. plantarum KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 pH 저항 특성을 나타낸 그래프이다. A : pH 2 에서 L. plantarum 생존 능력, B : pH 3 에서 L. plantarum 생존 능력
도 4는 소듐 데옥시콜레이트(DCA)에서의 L. plantarum KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 성장에서 담즙염 저항 특성을 나타낸 그래프이다. B : 옥시갈에서의 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 성장을 나타낸 그래프이다. 상이한 abcd 문자는 서로 현저한 차이를 나타낸다(p<0.05)
도 5는 A : 위액(pH 2 및 pH 3) 스트레스 조건에서의 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 성장을 나타낸 그래프이다. B : 락토바실러스 균주의 콜레스테롤 저하 특성을 나타낸 그래프이다. 상이한 abcd 문자는 서로 현저한 차이를 나타낸다(p<0.05)
도 2는 호기성 및 미세-호기 조건하에서 MRS 부용, 보리 주스, 옥수수 주스, 이탈리아 라이그라스 주스의 L. plantarum KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 발효 배양물을 나타낸 그래프이다. A : 젖산(mg/ml), B : 아세트산(mg/ml), C : 숙신산(mg/ml)
도 3은 L. plantarum KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 pH 저항 특성을 나타낸 그래프이다. A : pH 2 에서 L. plantarum 생존 능력, B : pH 3 에서 L. plantarum 생존 능력
도 4는 소듐 데옥시콜레이트(DCA)에서의 L. plantarum KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 성장에서 담즙염 저항 특성을 나타낸 그래프이다. B : 옥시갈에서의 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 성장을 나타낸 그래프이다. 상이한 abcd 문자는 서로 현저한 차이를 나타낸다(p<0.05)
도 5는 A : 위액(pH 2 및 pH 3) 스트레스 조건에서의 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28 성장을 나타낸 그래프이다. B : 락토바실러스 균주의 콜레스테롤 저하 특성을 나타낸 그래프이다. 상이한 abcd 문자는 서로 현저한 차이를 나타낸다(p<0.05)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
1.
락토바실러스
플란타룸의
샘플 수집 및 분리
동물의 분뇨는 대한민국 천안시에서 멸균 프로필렌 가방에 수집하였다. 10g의 샘플을 90ml의 멸균수에 혼합하고 107 cfu/g 까지 일련의 희석을 하고, 100μl의 샘플을 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 배지를 함유하는 플레이트 상에 도말하였다. 이어서, 플레이트를 30±2℃에서 24 내지 48시간 배양하였다. 콜로니 30개를 집어 서로 다른 쥬스(juice), 예컨대 보리, 옥수수 및 이탈리아 라이그라스(ryegrass), 에서 성장 능력을 분석하고 항균 활성을 분석하였다. 성장 및 항균 활성을 바탕으로, 본 발명자들은 4 균주를 선택하고 KCC-25, KCC-26(KACC92081P), KCC-27 및 KCC-28로 명명하였다(Valan Arasu, M., Kim, D.H., Kim, P.I., Jung, M. W., Ilavenil, S., Jane, M., Lee. K. D., Al-Dhabi., N, A. and Choi, K.C. 2014. In vitro antifungal, probiotic and antioxidant properties of novel Lactobacillus plantarum K46 isolated from fermented sesame leaf. Annals of Microbiology, 64 , 1333 - 1346).
2. 생화학적 및 생리학적 특성 분석
생화학 테스트는 Kozaki et al.1992(Kozaki, M., Uchimura, T. and Okada S.1992. Experimental manual of lactic acid bacteria. Asakurasyoten, Tokyo, Japan. 34 - 37) 에 설명된 방법에 따라 수행하였다. MRS 부용 및 쥬스, 예컨대 이탈리아 라이그라스, 보리, 옥수수 및 호밀, 의 젖산, 아세트산 및 숙신산은 메가-자임 분석 키트(mega-zyme assay kit)와 자외선 분광광도계(UV-spectrophotometer)[Tecan-infinite m200]를 이용하여 측정하였다. API 50 CH 테스트 키트는 탄수화물 테스트를 수행하기 위하여 사용하였다. 세포 효소는 api-ZYM 키트[Biomeriux]로 분석하였다. MRS 배지에서 성장된 분리 형태는 도립 현미경[CKX41, Olympus Corporation, Tokyo, Japan]을 이용하여 직접 관찰하였다.
3. 16S
rRNA의
PCR
증폭 및
Lactobacillus
균주의 분자의 식별
DNA는 상업적으로 이용가능한 키트의 방법[QlAamp DNA mini kit-Qiagen]을 이용하여 추출하였다. 16S rRNA는 보편적인 프라이머인 27F(서열번호 1) 및 1492R(서열번호 2) 프라이머[27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG, 1492R GTA TTA CCG CGG CTG CTG G]를 이용하여 PCR[Applied Bio system-9700]로 증폭하였고, 시퀀싱은 Solgent Co. Ltd.[16S rRNA, Seoul, Korea]에서 Genetic Analyzer 3130[Applied Bio-system, USA]를 이용하여 수행하였다. 정렬된 16S rRNA는 NCBI Gene Bank의 데이터베이스에서 BLAST를 수행하였다. 최대 동일 점수(maximum identity score)에 기초한 것을 선택하고 ClustalW 다중 정렬 소프트웨어(ClustalW multiple alignment software)를 이용하여 정렬하였다(Valan Arasu, M., Jung, W., Ilavenil, S., Jane., M, Kim, D. H., Lee, K.D., Park,H.S., Hur, T.Y., Choi, G.J., Lim, M. Y.C., Al-Dhabi, N.A. and Choi, K.C.(2013), Isolation and characterization of antifungal compound from Lactobacillus plantarum KCC-10 from forage silage with potential beneficial properties. Journal of Applied Microbiology, 115, 1172 - 1185).
4. 분리주의 항생제 민감성 테스트
항생제 민감도 패턴은 상업적으로 이용가능한 키트 방법을 이용하여 측정하였다. 상이한 타입의 일반적인 항생제 디스크를 배지 표면상에 로딩하고 실온에서 10분간 유지하였다. 그 이후, 플레이트를 30℃에서 24시간동안 배양기에서 배양하였다. 이어서, 억제 영역을 표준 항생제 디스크 차트를 이용하여 측정하였다(Ilavenil, S., Vijayakumar, M., Kim, D.H., Valan Arasu, M. , Park, H.S., Ravikumar, S, Choi, K. C. (2015). Assessment of probiotic, antifungal, cholesterol lowering properties of Pediococcus pentosaceus-KCC-23 isolated from Italian ryegrass. Journal of Science of the food and agriculture, [DOI]10.1002/jsfa.7128).
5. 진균 배양 및 준비
아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)[KACC 40080] 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)[KACC 40399], 페니실리움 로케포티(Penicillium roqueforti)[KACC 41354], 보트리티스 엘립티카(Botrytis elliptica)[KACC 43461] 및 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)[KACC 40051]은 한국 농업 미생물 자원센터(Korean agricultural culture collection)(KACC)에서 얻었다. 1주일 된 분생포자를 0.05% 트리톤-X 100이 포함된 감자 덱스트로스 아가 플레이트에 준비하였다. 약 5x102의 분생자가 함유된 10μl 분생자 현탁액(conidial suspension)을 항진균 분석에 사용하였다.
6. 분리주의 항진균 특성 스크리닝
6-1. Pour plate 방법
MRS 부용에서 24시간 성장한 분리주를 고체화된 MRS 아가 플레이트에 로딩[discreet spot]하였다. 그 이후, 플레이트를 30±2℃에서 24시간 동안 배양한 후, MRS 배지 상의 각각 5μl 분생자 현탁액을 함유한 감자 덱스트로스 배지(0.8%)로 입혔다. 그 이후, 플레이트를 30±2℃에서 1주일 동안 호기적으로 배양하고 진균 성장을 관찰하였다(Valan Arasu, M., Kim, D.H., Kim, P.I., Jung, M. W., Ilavenil, S., Jane, M., Lee. K. D., Al-Dhabi., N, A. and Choi, K.C. 2014. In vitro antifungal, probiotic and antioxidant properties of novel Lactobacillus plantarum K46 isolated from fermented sesame leaf. Annals of Microbiology, 64 , 1333 - 1346).
6-2. 극소 희석(
Microdilution
) 방법
분리주의 항균 활성을 Lavermicocca et al. 2003를 조금 변형한 방법을 이용하여 분석하였다. 활성 분리주를 MRS 부용을 함유하는 100ml 분생자 플라스크에 심고 30±2℃에서 48시간 동안 약간의 흔들림과 함께 배양하였다. 48시간 후, 상기 부용을 9000rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 수집한 후 0.22μM 멤브레인 필터(membrane filter)를 통해 여과하였다. 190μl의 분리주 상청액 및 MRS 부용에 10% 유기산 혼합물(젖산, 아세트산 및 숙신산)을 96웰에 분배하고 10μl 분생자 현탁액을 접종하였다. 발효 대사물 없는 것을 대조군으로 간주하였다. 모든 실험 플레이트를 30±2℃에서 72시간 동안 배양하였다. 진균 성장을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여 600nm에서 측정하였다(Lavermicocca, P., Valerio, F. and Visconti, A.(2003) Antifungal activity of Phenyllactic acid against molds isolated from bakery products. Applied Environmental Microbiology, 69: 634 - 640). 여기서, 대조군에서 진균의 성장을 100% 성장으로 간주하였으며, 그로부터 본 발명자들은 진균 성장 억제 백분율을 계산하였다.
7. 분리주의
프로바이오틱
특성
7-1. pH 저항
상이한 pH의 MRS 부용은 1N HCl로 준비하였다. 신선한 배양물을 상이한 MRS 부용에 접종하고 30±2℃에서 3시간 동안 배양하였다. 알리쿼트(Aliquots) 배양물을 각 튜브(0 내지 3 시간 후)에서 버리고 BCP 및 MRS 배지 상에 도말하였다. 박테리아의 수(CFU/ml)를 기록하였다.
7-2.
담즘염
저항
신선한 배양물을 0.3%의 옥스갈(oxgall) 및 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(DCA) 담즙염[Sigma, USA]를 함유하는 MRS 부용에 접종하고 30±2℃에서 배양하였다. 그 알리쿼트(Aliquots)로 부터 상이한 시간 간격으로 버리고 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 담즙염이 없는 배지를 대조군으로 간주하였다. 결과는 대조군에 대하여 담즘염의 존재에 600nm에서 박테리아의 성장으로 표현하였다(Ilavenil, S., Vijayakumar, M., Kim, D.H., Valan Arasu, M. , Park, H.S., Ravikumar, S, Choi, K. C. (2015). Assessment of probiotic, antifungal, cholesterol lowering properties of Pediococcus pentosaceus-KCC-23 isolated from Italian ryegrass. Journal of Science of the food and agriculture, [DOI]10.1002/jsfa.7128).
7-3. 분리주의 용혈,
담즙염
가수분해효소(Bile salt
hydrolase
)(
Bsh
) 활성, 소수성 및 응집 특성
용혈 활성을 신선한 혈액을 함유하는 콜롬비아 아가 플레이트 상에 락토바실러스 플란타룸을 도말하고 30±2℃에서 24시간 동안 배양한 후 용혈 활성을 측정하여 결정하였다. 용혈 대조군으로서 E.coli를 사용하였다(Maragkoudakis, P.A., Zoumpopoulou, G., Miaris, C., Kalantzopoulos, G., Pot, B., Tsakalidou, E. (2006) Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products. International Dairy Journal, 16:189 - 199). Bsh 활성을 측정하기 위하여, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트가 함유된 MRS 배지상에 락토바실러스 플란타룸을 접종하고 37℃에서 72시간 동안 혐기적으로 배양하였다. Bsh 활성의 존재는 흰색의 불투명한 콜로니로 보여졌다. 담즙염 없는 것을 대조군으로 간주하였다(Dashkevicz, M. P. and Feighner, S. D. (1989), Development of a differential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillus spp. Applied Environmental Microbiology, 55, 11 - 16).
소수성 측정을 위하여, MRS 부용에서 성장한 신선한 락토바실러스 플란타룸을 1200xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 펠렛을 PBS로 두번 세척하였다. 또한, 펠렛을 5ml의 PBS에 재부유 시켰다. 3ml의 락토바실러스 플란타룸 현탁액 또는 1ml의 자일렌 또는 클로로포름을 취하여 볼텍스(vortex)로 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하여 상분리하였다. 수상(aqueous phase)을 조심스럽게 취하여 600nm에서 이의 흡광도를 측정하고 하기 수학식을 이용하여 소수성의 %를 계산하였다(Rosenberg, M., Gutnick, D. and Rosenberg, E.(1980), Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbial Letter, 9, 29 - 33).
[수학식 1]
ΔOD = 100 x (ODinitial- OD final)/OD initial,
= ΔOD/ODinitial x 100
응집 특성을 측정하기 위하여, MRS에서 신선하게 성장한 락토바실러스 플란타룸(4 x 108 세포수)을 1200xg로 10분간 4℃에서 원심분리하고, 펠렛을 수집하고 PBS로 두 번 세척한 후, 4ml의 PBS에서 재부유시키고 600nm에서 초기 흡광도를 읽고 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상층의 최상부로부터 일정하게 1 시간 간격으로 빼낸 알리쿼트(aliquots)(100μl) 및 3.9ml의 PBS와 혼합하고 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 응집율을 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.
[수학식 2]
%AA= 1-(At /A0) x 100
At = 상이한 시간 간격에서의 흡광도(1, 2 및 3h), A0 = 0h 에서 초기 흡광도
공동 응집 특성은 E.coli를 병원균으로서 이용하여 분석하였다(Kos, B., Suskovic, J., Vukovic, S., Simpraga, M., Frece, J. and Matosic, S. (2003), Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of Applied Microbiology, 94,981 - 987).
7-4. 분리주의 위액 스트레스
분리된 배양액의 위액 저항성을 Charteris et al., 1998(Charteris, W.P., Kelly, P.M, Morelli, L. and Collins, J.K. (1998), Development and application of an in vitro methodology to deter mine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. Journal of Applied Microbiology, 84, 759 - 768)의 방법으로 가상의 위에 대해 수행하였다. 락토바실러스 균주의 콜레스테롤 흡수 특성을 결정하였다(Iranmanesh, M., Ezzatpanah, H. and Mojgani, N. (2014), Antibacterial and cholesterol assimilation activity of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. Food Science Technology, 583,55 - 359).
7-5. 통계 분석
모든 수치화된 데이터를 6개의 독립적인 실험으로부터 얻고, 이들 데이터 분석은 MS-엑셀 및 SPSS 16 통계 분석을 이용하여 수행하였다(SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로서 표시하였다.
결과
1. 분리주의 분리 및 형태 특성
30개의 락토바실러스 균주는 대한민국 천안시 RDA 농장으로부터 수득한 동물 분뇨로부터 분리하였다. 모든 락토바실러스 균주는 A. fumigatus, P. chrysogenum , P. roqueforti, B. elliptica 및 F. oxysporum 에 대한 항균 활성을 위해 스크리닝하였다. 30개의 균주 중에서, 4개의 균주가 A. Fumigatus, P. chrysogenum , P. roqueforti, B. elliptica 및 F. oxysporum 에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었으며, 특히 A. fumigatus 에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었다(도 1). 이들 락토바실러스 균주는 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28로 명명하였다. 락토바실러스 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 특성은 생화학적 및 생리학적 특성뿐만 아니라 16S rRNA 유전자 서열에 의해 확인하였다. 이들 균주의 생화학적 및 생리학적 특성으로 크리미한 본질(creamy nature), 비-운동성, 막대-형태, 카탈라아제-음성 및 중온성(mesophillic)이다. 이들 균주는 락토바실러스 종과 관련 있을 것으로 예측하였다. 락토바실러스 종 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28은 D-Arabinose, L-Arabinose, D-Ribose, D-Xylose, L-Xylose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, D-Mannitol, Methyl-αD-mannoside 등을 발효시킬 수 있는 능력이 있고, 이들 균주는 glycerol, Methyl-β-D-xiloside, D-Adonitol, L-Sorbose, L-Rhamnose 등을 발효시킬 수 없다(표 1).
| 탄수화물의 명칭 | KCC-25 | KCC-26 | KCC-27 | KCC-28 |
| Glycerol | - | - | - | + |
| Erythritol | - | - | - | + |
| D-Arabinose | + | + | + | + |
| L-Arabinose | + | + | + | + |
| D-Ribose | + | + | + | + |
| D-Xylose | + | + | + | + |
| L-Xylose | + | + | + | + |
| D-Adonitol | - | - | - | - |
| Methyl-β-D-xiloside | - | - | - | - |
| D-Galactose | + | + | + | + |
| D-Glucose | + | + | + | + |
| D-Fructose | + | + | + | + |
| D-Mannose | + | + | + | + |
| L-Sorbose | - | - | - | - |
| L-Rhamnose | - | - | - | - |
| Dulcitol | - | - | - | - |
| Inositol | - | - | - | - |
| D-Mannitol | + | + | + | + |
| D-Sorbitol | - | - | - | - |
| Methyl-αD-mannoside | + | + | + | + |
| Methyl-α-D-glucoside | - | - | - | - |
| N-acetyl glucosamine | + | + | + | + |
| Amygdalin | + | + | + | + |
| Arbutin | + | + | + | + |
| Esculin ferric citrate | + | + | + | + |
| Salicin | + | + | + | + |
| D-Celiobiose | + | + | + | + |
| D-Maltose | + | + | + | + |
| D-Lactose | + | + | + | + |
| D-Melibiose | + | + | + | + |
| D-Saccharose | + | + | + | + |
| D-Trehalose | + | + | + | + |
| Inulin | - | - | - | - |
| D-Melezitose | + | + | + | + |
| D-Raffinose | + | + | + | - |
| Amidon | - | - | - | - |
| Glycogen | - | - | + | - |
| Xylitol | - | - | - | + |
| Gentiobiose | - | - | - | - |
| D-Turanose | + | + | + | - |
| D-Lyxose | + | + | + | - |
| D-Tagatose | - | - | + | - |
| D-Fucose | - | - | + | - |
| L-Fucose | - | - | + | - |
| D-Arabitol | - | - | - | - |
| L-Arabitol | - | - | - | - |
| Potassium gluconate | - | - | - | - |
| Potassium 2-Ketogluconate | + | + | + | - |
| Potassium 5-Ketogluconate | + | + | + | + |
2. 항생제 민감성 테스트
락토바실러스 종 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 항생제 민감성 패턴 분석은 일반적으로 사용되는 15개의 상이한 항생제에 대하여 테스트하였다. 얼룩은 일반적으로 사용되는 항생제에 민감성을 나타내며, 예컨대 Chloramphenicol, kanamycin, Nitrofurantoin, tetracycline, streptomycin, Colistin methanesulphonate, Dicloxacillin, ampicillin, Amikacin, Cefoxitin, Cefalexin, Cefuroxime 및 Co-Trimoxazole 이고, 이는 Sulphafurazole 및 Gentamicin 에는 저항성을 가지고 있다(표 2).
| S.No | 항생제 명칭 |
농도
( μg ) |
KCC-25 | KCC-26 | KCC-27 | KCC-28 |
| 1 | Chloramphenicol (C) | 50 | S | S | S | S |
| 2 | Kanamycin (K) | 30 | S | S | S | S |
| 3 | Nitrofurantoin (NIT) | 50 | S | S | S | S |
| 4 | Tetracycline (TE) | 100 | S | S | S | S |
| 5 | Streptomycin (S) | 25 | S | S | S | S |
| 6 | Sulphafurazole (SF) | 300 | R | R | R | R |
| 7 | Colistin methanesulphonate | 100 | S | S | S | S |
| 8 | Dicloxacillin (D/C) | 1 | S | S | S | S |
| 9 | Ampicillin (AMP) | 10 | S | S | S | S |
| 10 | Amikacin (AK) | 30 | S | S | S | S |
| 11 | Gentamicin (GEN) | 10 | R | R | R | R |
| 12 | Cefoxitin (CX) | 30 | S | S | S | S |
| 13 | Cefalexin (CN) | 30 | S | S | S | S |
| 14 | Cefuroxime (CXM) | 30 | S | S | S | S |
| 15 | Co-Trimoxazole (COT) | 25 | S | S | S | S |
S : 민감성, R : 저항성
3. 분리주의 분자 특성
락토바실러스 종 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 16S rRNA 유전자를 시퀀싱하고 NCBI BLAST를 이용하여 이들의 유사성을 분석하였다. 이들 데이터에서 이들 균주가 락토바실러스 플란타룸과 99%의 유사도를 갖는 것으로 나타났다. L.plantarum KCC-25, L. plantarum KCC-26, L. plantarum KCC-27 및 L. plantarum KCC-28의 16S rRNA 서열을 NCBI gene bank 데이터베이스에 등록하였다(Accesion numbers : KP099604, KP099605, KP099606, 및 KP099607).
4.
발효 대사
생성물(Fermentative metabolite productions)
KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28은 상당량의 발효 대사물을 생산하였으며, 예컨대, MRS 부용 및 상이한 작물 주스(이탈리아 라이그라스, 옥수수, 보리 및 호밀)에서 젖산, 아세트산, 및 숙신산을 생산하였다. 이들 산은 KCC-26이 다른 균주와 비교하여 최대량을 생산하였다(도 2).
5.
락토바실러스
플란타룸의
항균 활성
KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 항균 활성은 A. fumigatus, P.chrysogenum, P. roqueforti, B. elliptica 및 F. oxysporum 에 대하여 분석하였다. 이들 균주 중에서 KCC-26은 가장 강력한 항균 활성을 나타내었다(표 3).
| 테스트된 균주 | KCC-25 | KCC-26 | KCC-27 | KCC-28 | C1 배지 |
| A. fumigatus | 63.22 ± 0.8 | 76.02 ± 2.0 | 68.27 ±1.1 | 60.82 ±1.9 | 57.32 ± 2.51 |
| P. chrysogenum | 56.94 ± 1.3 | 69.07 ±0.4 | 65.65 ± 0.8 | 52.10± 0.2 | 52.08 ±1.52 |
| P. roqueforti | 60.51 ± 0.1 | 73.14 ±5.3 | 53.67 ± 1.2 | 53.34 ±1.9 | 48.46 ± 2.25 |
| B. elliptica | 25.80 ± 1.1 | 49.68 ±1.4 | 25.24 ± 0.9 | 26.26 ± 1.8 | 46.32 ± 2.65 |
| F. oxysporum | 56.01 ± 1.3 | 68.01± 1.5 | 52.59 ± 0.3 | 52.24 ± 0.3 | 51.42 ± 2.96 |
* C1 배지는 10% 유기산을 함유하고 있으며, 상기 수치는 대조군과 비교한 균주 성장 억제율을 계산한 것이다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
6.
락토바실러스
플란타룸의
프로바이오틱
특성
KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28의 낮은 pH 저항성을 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28를 상이한 pH(2 및 3)에서 배양하여 조사하였다. pH 2 및 3 에서 박테리아 성장의 미미한 감소가 관찰되었다. 이는 이들 균주가 낮은 pH 에서 성장할 수 있는 능력이 있음을 나타내었다(도 3A-B). 0.3% 옥스갈 및 0.5% 소듐 데옥시콜레이트를 첨가한 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28를 3시간 동안 배양한 결과 대조군과 비교하여 균주 생존 %에 미세한 감소를 보여주었다(도 4 A-B). 그러나, KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28은 척박한 위액 조건에서 현저한 %가 생존하였다(도 5 A). 이들 균주는 모두 낮은 pH, 담즙염, 및 위액에서 현저하게 생존하는 능력을 가지고 있었다. 이들 균주는 배양 24시간 이후 MRS 부용으로부터 콜레스테롤을 사용하는 능력을 가지고 있었다(도 5B). KCC-26은 다른 균주와 비교하여 최고 수준의 콜레스테롤 흡수 능력을 가지고 있었다. 락토바실러스 종 KCC-25, KCC-26, KCC-27 및 KCC-28은 상이한 종류의 세포 외 효소를 생산하는 능력을 가지고 있으며, 예컨대, β-Galactosidase, α-Galactosidase, α-Glucosidase, β-Glucosidase, Leucine arylamidase, Valine arylamidase, Acid phosphatase, Naphthol-AS-bi phosphohydrolase, Trypsin-like serine protease, 및 다른 효소(표 4). 모든 균주는 현저한 소수성 및 응집 특성을 보여주었다(표 5).
| 세포 외 효소 | KCC-25 | KCC-26 | KCC-27 | KCC-28 |
| Alkaline phosphatase | +++ | ++ | ++ | +++ |
| Esterase (C4) | ++ | ++ | + | +++ |
| Esterase lipase (C8) | ++ | ++ | + | ++ |
| Lipase (C14) | ++ | ++ | + | ++ |
| Leucine arylamidase | +++ | +++ | +++ | +++ |
| Valine arylamidase | +++ | +++ | +++ | +++ |
| Cystine arylamidase | ++ | ++ | ++ | +++ |
| Trypsin-like serine protease | ++ | ++ | ++ | ++ |
| α-Chymotrypsin | ++ | ++ | + | + |
| Acid phosphatase | +++ | +++ | +++ | +++ |
| Naphthol-AS-biphosphohydrolase | +++ | +++ | ++ | +++ |
| α-Galactosidase | ++ | +++ | ++ | ++ |
| β-Galactosidase | +++ | +++ | +++ | +++ |
| β-Glucuronidase | ++ | ++ | ++ | ++ |
| α-Glucosidase | +++ | +++ | +++ | +++ |
| β-Glucosidase | +++ | +++ | ++ | +++ |
| N-Acetyl-β-glucosaminidase | +++ | +++ | +++ | +++ |
| α-Mannosidase | + | +++ | ++ | + |
| α-Fucosidase | + | + | + | + |
* +++ : 강력한 생산, ++ : 보통 생산, + : 낮은 생산
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Lactobacillus plantarum KCC-26 and composition comprising the
same
<130> P15-174
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> primer
<400> 2
gtattaccgc ggctgctgg 19
Claims (14)
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 프로바이오틱(probiotic) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주. - 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주를 포함하는 항균용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 균주는 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus Fumigates), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium Chrysogenum), 페니실리움 로케포티(Penicillium Roqueforti), 보트리티스 엘립티카(botrytis elliptica), 및 후자리움 옥시스포룸(Fusarium Oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸 KCC-26(KACC92081P) 균주를 포함하는 항균용 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 약학 조성물 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 균주는 위액 또는 담즙염이 포함된 환경에서 생존 능력이 향상된 것을 특징으로 하는 균주. - 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주를 포함하는 사료용 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 사일리지 제조방법.
- 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주를 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 균주는 Bsh(Bile salt hydrolase) 활성이 향상된 것을 특징으로 하는 조성물. - 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCC-26(KACC92081P) 균주를 처리하여 발효 대사 생성물을 생산하는 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 발효 대사 생성물은 젖산, 아세트산 또는 숙신산인 것을 특징으로 하는 방법.
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