KR20200130890A - 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 kcc-36 균주 - Google Patents

신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 kcc-36 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 KCC-36 균주에 관한 것으로, 구체적으로 알팔파 사료에서 분리된 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KCC-36 균주(미생물 수탁번호 KACC 92223P)에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 항박테리아 및 항진균 활성, 다양한 탄수화물의 발효능, 다양한 효소 생산능, 항균제를 이용한 조절성, 내산성, 내담즙성, 응집성, 소수성, 항산화 활성 등 매우 우수한 프로바이오틱스의 특성을 갖는 신규 유산균이므로, 프로바이오틱스 생균제제, 또는 식품이나 사료에 포함시키거나 발효식품의 발효균으로 매우 유용하다.

Description

신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 KCC-36 균주{Novel Lactobacillus plantarum KCC-36}
본 발명은 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 KCC-36 균주에 관한 것으로, 구체적으로 알팔파 사료에서 분리된 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KCC-36 균주(미생물 수탁번호 KACC 92223P)에 관한 것이다.
사람의 위장관은 복잡하고 강력한 미생물 환경을 갖고 있다. 이러한 미생물 환경은 나이, 건강 및 생활양식에 따라 변화하며, 병원체와 유해음식물질의 작용을 저해하고 숙주에게 유익한 효과를 촉진하는 중요한 역할을 한다. 이러한 효과는 위장관 내 미생물의 경향과 관련이 있으며, 위장관의 이러한 미생물의 균형은 위장병의 위험을 낮출 수 있다. 프로바이오틱스의 이점으로는 락토오스 불내성, 영양분의 생체이용률 및 알레르기 예방 개선이 포함되며, 항-돌연변이, 항암, 항-고콜레스테롤, 항-고혈압, 항-골다공증 및 면역기능조절 효과가 보고된 바 있다. 또한 프로바이오틱스는 염증성 장 질환, 과민성 장증후군, 간경변, 변비를 없애고 결장암, 간암 및 유방암 위험을 줄일 수 있는 것으로도 보고된 바 있다.
현재, 건강 증진 프로바이오틱 식품의 장점은 전세계적으로 널리 받아들여지고 있다. FAO/WHO에 따르면, 건강 증진용 프로바이오틱스는 충분한 양(적어도 106 ~ 107 cfu/g)으로 섭취하면 숙주의 건강에 긍정적인 영향을 미치는 생존 가능한 활성 미생물이다. 최근 연구에서 죽은 미생물의 면역학적 특성이 보고된 바 있다. 대부분의 프로바이오틱 미생물은 유산균을 생산하는 박테리아이며 그중 Lactobacillus는 인간의 건강을 향상시키는 가장 기본적인 속균 중 하나이다. 따라서 여러 락토바실러스 종들의 게놈 서열이 규명되었으며 광범위한 발효식품에 사용되어 왔다. 또한 이러한 락토바실러스와 관련된 대사경로, 유전자의 조절 및 기능이 보고되었다. 대부분의 연구자들은 프로바이오틱스를 전달하기 위한 가장 좋은 방법이 특히 발효유와 요구르트를 통한 발효유제품이라고 생각해왔다.
오늘날 연구자들은 새로운 바이오틱스를 생산하는 것에 더 많은 관심을 가지고 있으며, 비유제품 프로바이오틱스는 사람을 위한 프로바이오틱 기능성 식품의 개발을 위한 좋은 기반이 될 수 있을 것으로 생각한다. 잘 특성화된 프로바이오틱 미생물 중 몇몇은 전세계에서 상업적으로 이용가능하다. 그러나 신규한 미생물의 스크리닝은 여전히 발효식품산업으로부터 큰 관심을 받고 있다.
이에 본 발명자는 알팔파 사일리지로부터 프로바이오틱스의 우수한 특성을 갖는 신규 미생물을 스크리닝하였으며, 이의 결과 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 KCC-36 균주가 항박테리아 및 항진균 활성, 다양한 탄수화물의 발효능, 다양한 효소 생산능, 항균제를 이용한 조절성, 내산성, 내담즙성, 응집성, 소수성, 항산화 활성 등 매우 우수한 프로바이오틱스의 특성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
J. Nutr. Health Aging 5, 80-91. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 18, 299-313. Cell 124, 837-848. Age. Res. Rev. 9, 107-116.
따라서 본 발명의 주된 목적은 프로바이오틱스로서의 우수한 특성을 갖는 새로운 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용한 프로바이오틱스 생균제제, 식품 및 사료를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KCC-36 균주(미생물 수탁번호 KACC 92223P)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 프로바이오틱스 생균제제를 제공한다.
본 발명의 생균제제에 있어서, 사람 또는 가축용 프로바이오틱스 생균제제인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주로 발효하여 제조된 발효식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 사료를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주로 발효하여 제조된 발효사료를 제공한다.
본 발명의 균주는 항박테리아 및 항진균 활성, 다양한 탄수화물의 발효능, 다양한 효소 생산능, 항균제를 이용한 조절성, 내산성, 내담즙성, 응집성, 소수성, 항산화 활성 등 매우 우수한 프로바이오틱스의 특성을 갖는 신규 유산균이므로, 프로바이오틱스 생균제제, 또는 식품이나 사료에 포함시키거나 발효식품의 발효균으로 매우 유용하다.
도 1은 본 발명 균주(KCC-36)의 항박테리아 활성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 2는 본 발명 균주(KCC-36)의 항진균 활성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주; S.B, Scopulariopsis brevicaulis; A.C, Aspergillus clavatus; P.C, Penicillium chrysogenum; A.F, Aspergillus fumigatus; F.O, Fusarium oxisporum.
도 3은 본 발명 균주(KCC-36)의 다양한 pH에 대한 저항성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 4는 본 발명 균주(KCC-36)의 위액 환경에 대한 저항성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 5는 본 발명 균주(KCC-36)의 담즙염 내성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 6은 본 발명 균주(KCC-36)의 소수성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 7은 본 발명 균주(KCC-36)의 자동응집 활성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 8은 본 발명 균주(KCC-36)의 프리바이오틱스 사용성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 9는 본 발명 균주(KCC-36)의 콜레스테롤 동화성을 실험한 결과이다. 파란색 그래프, KCC-36; 붉은색 그래프, KACC 91016.
도 10은 본 발명 균주(KCC-36)의 과산화수소 라디칼 소거활성을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 11은 본 발명 균주(KCC-36)의 DPPH 라디칼 소거활성을 실험한 결과이다. vit-c, 비타민C; KACC, KACC 91016 균주.
도 12는 본 발명 균주(KCC-36)의 저수분 IRG 사료의 발효능을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 13은 본 발명 균주(KCC-36)의 저수분 옥수수 사료의 발효능을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
도 14는 본 발명 균주(KCC-36)의 저수분 수수 사료의 발효능을 실험한 결과이다. KACC, KACC 91016 균주.
본 발명의 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KCC-36 균주는 알팔파(Alfalfa, Medicago sativa) 사일리지에서 분리되었으며, 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC: Korean Agricultural Culture Collection)에 미생물 수탁번호 KACC 92223P로 기탁되어 있다.
본 발명에서 확인된 본 발명 균주의 16S rRNA 유전자의 일부 염기서열은 서열번호 1과 같으며, NCBI Genbank에 KP091752.1(accession number)로 기탁되어 있다. 이 염기서열을 통한 계통 분류결과를 바탕으로 본 발명의 균주는 락토바실러스 플란타럼에 속하는 새로운 균주로 분류될 수 있다.
본 발명의 균주는 Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus 및 Pseudomonas aeruginosa에 대해 항박테리아 활성을 나타내며, Scopulariopsis brevicaulis, Aspergillus clavatus, Penicillium chrysogenum, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxisporum에 대해 항진균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 균주는 갈락토스(galactose), 글루코스, 프럭토스(fructose) 등의 탄수화물(표 1 참조)을 발효할 수 있다. 따라서 이들 탄소원이 함유된 재료를 발효하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 균주는 α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), α-글루코시다제(α-glucosidase) 등의 효소를 생산할 수 있다. 따라서 이들 효소의 활성이 필요한 분야에 사용될 수 있다.
본 발명의 균주는 카나마이신(kanamycin), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 스트렙토마이신(streptomycin) 등의 항생제에 감수성을 나타내므로 이들 항생제를 이용하여 생장을 조절할 수 있으며, 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin) 등의 항생제에 저항성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 균주는 pH 2 ~ 3의 위액 환경에서도 생존할 수 있고 담즙염이 높은 농도로 존재하는 조건에서도 생존할 수 있어, 동물의 위나 소장 등의 소화기관을 지나는 동안 생존하여 장까지 살아있는 채로 도달할 가능성이 높다.
본 발명의 균주는 우수한 응집력 및 소수성을 나타내므로 동물의 장내에 정착하는데 유리하다.
본 발명의 균주는 라피노스, 이눌린과 같은 프리바이오틱스를 이용할 수 있다.
본 발명의 균주는 콜레스테롤 동화성 및 항산화 활성이 우수하여 프로바이오틱스로서 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 균주는 수분이 낮은 조건에서도 여러 가지 사료작물을 발효할 수 있어 발효사료의 제조를 위한 유산균으로 유용하게 활용할 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 균주는 프로바이오틱스로서의 매우 우수한 특성을 가지므로, 프로바이오틱스 생균제제로 이용할 수 있다.
이때 생균제제는 본 발명의 균주 자체 또는 균주의 배양물로 이루어질 수 있으며, 제제화의 용이성을 위한 부형제 등의 첨가제가 포함된 형태일 수도 있다.
또한 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 식품이나 사료의 재료 또는 첨가제로 이용될 수 있다. 이때 배양물은 균체가 포함되지 않은 형태로도 이용할 수 있으나, 프로바이오틱스로서의 효과를 기대하기 위해서는 균체가 포함된 형태로 이용하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 균주는 발효식품 또는 발효사료의 발효균주로도 이용할 수 있다. 이때 발효식품 또는 발효사료에는 표 1에서와 같이 본 발명의 균주가 발효할 수 있는 성분이 함유된 원료를 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 방법
1-1. 균주의 분리 및 예비 스크리닝
대한민국 천안에 위치한 국립축산과학원으로부터 발효된 알팔파(Alfalfa, Medicago sativa) 사일리지(silage) 샘플을 수집하였다. 1g의 사일리지 샘플을 멸균수로 연속희석(107)하고, Ilavenil 등(J Sci Food Agric. 96(2):593-601)과 같은 방법으로 균주 분리를 시도하였다.
성장 프로파일 분석 및 항진균 실험결과를 바탕으로, 효과적인 균주를 추가 특성분석을 위해 선별하고 이를 KCC-36으로 명명하였다. 균주를 하룻밤 배양하여 생화학 및 생리학적 특성 분석을 위해 사용하였다.
Megazyme 어세이 키트(Bray, Co. WIcklow, Ireland)를 발효산의 정량에 사용하였고, API 50 CH 및 API-ZYM 키트(Marcy-I' Etoile, France)를 탄수화물 발효 및 효소 생산 분석에 사용하였다. 항생제 민감성 스크리닝은 Valan Arasu 등(J Appl Microbiol. 115(5):1172-1185)의 디스크 확산법을 적용하였다.
본 실험 및 이하의 실험에서 비교균주로는 대한민국 등록특허 제10-0496022호의 KACC 91016(락토바실러스 플랜타럼 NLRI 201)을 사용하였다.
1-2. 분자적 특성 분석 및 기탁
16s rRNA 유전자 서열분석을 Solgent 사(서울, 한국)를 통해 Sanger의 방법에 따라 수행하였다. KCC-36 균주의 게놈 DNA를 추출하고, QIAquick® 키트(Qiagen Ltd., Crawley, UK)로 정제하였으며, 유니버셜 프라이머 27F(5'-AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG-3') 및 1492R(3'-GCT TAC CTT GTT ACG ACT T-5')을 사용하여 증폭산물의 서열을 분석하였다. NCBI gene bank의 데이터베이스에서 BLAST를 사용하여 KCC-36의 16s rRNA 서열을 얼라인 분석하였으며, 이 서열을 NCBI Genebank에 기탁하였다.
1-3. 항진균 활성 분석
Fusarium Oxysporum, Aspergillus clavatus, Penicillium chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis 및 Aspergillus Flavus을 KACC(전주, 한국)로부터 입수하고, 약간의 변형이 수반된 Ilavenil 등(J Sci Food Agric. 96(2):593-601)의 pour-plate 방법으로 항진균 활성을 스크리닝하였다. KCC-36 균주에 의한 진균의 성장 저해 및 진균 바이오매스는 Valan Arasu 등(J Appl Microbiol. 115(5):1172-1185)의 방법으로 분석하였다.
1-4. 항박테리아 활성 분석
Ilavenil 등(J Sci Food Agric. 96(2):593-601) 및 Gaudana 등(Br J Nutr. 103:1620-1628)의 아가 스팟 테스트(agar spot test)를 사용하여 KCC-36 균주의 항박테리아 활성을 측정하였다.
KCC-36 균주의 24시간 배양액(5㎕)을 MRS 배지 상에 접종하고, 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후 병원균의 하룻밤 배양액을 각 소프트 아가(tryptone soy 및 brain heart infusion)와 혼합하고, KCC-36의 24시간 배양된 콜로니가 함유된 MRS 한천배지에 부은 다음 37℃에서 24시간 배양하여 저해구역의 반지름을 측정하였다.
1-5. 항진균 활성의 생리학적 요인 분석
KCC-36 균주의 항진균 활성 상에서 온도 및 pH에 따른 효과를 조사하였다. 균주를 MRS 액체배지에서 서로 다른 온도 및 pH 상에서 배양하고, 배양 상층액의 항진균 활성을 Valan Arasu 등(J Appl Microbiol. 115(5):1172-1185)의 배양액 마이크로희석법으로 조사하였다.
1-6. pH 환경에 대한 저항성 분석
Ilavenil 등(J Sci Food Agric. 96:593-601)의 방법에 따라 KCC-36 균주의 낮은 pH에 대한 내성을 조사하였다. 배양된 균주를 다양한 pH의 MRS 배양액에 접종하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 각 배양액 100㎕를 pour plate 방법으로 MRS 배지에 접종하고, 37℃에서 48시간 배양하여 콜로니를 계수하였다.
1-7. 위의 pH에 대한 내성 분석
Charteris 등(J Appl Microbiol. 84:759-768)의 방법에 따라 KCC-36 균주의 위액에 대한 저항성을 조사하였다. 펩신(pepsin, 3㎎/㎖), 0.5%(w/v) NaCl 및 물을 사용하여 위액을 준비하고, 1mol/L HCl을 사용하여 pH를 약 2 및 3으로 맞추었다. 30㎖의 균주 배양액을 4℃에서 6000xg로 20분간 원심분리하고, 펠렛을 수득하여 K2HPO4(50mmol/L, 6.5pH)로 3회 세척하였다. 펠렛을 재현탁한 다음 1㎖의 현탁액을 9㎖의 위액과 혼합하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 배양전 및 배양후의 총 생균을 계수하였다.
1-8. 농축된 담즙염 환경에 대한 내성 분석
KCC-36 균주의 배양액을 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 및 0.3% 옥스갈(DCA Sigma, St Louis, MO, USA)과 같은 담즙염이 함유된 MRS 액체배지에 접종하고 37℃에서 배양하였다. 일정 시간 간격(24시간 및 48시간 후)으로 배양액을 분취하고 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 담즙염을 첨가하지 않은 MRS 배지를 대조군으로 사용하였다.
1-9. 콜로니 형성능(자동응집) 스크리닝
Del Re 등(Letters in Applied Microbiology, 31:438-442)의 방법으로 표면 상호작용을 통한 세포막의 응집을 조사하였다. 균주 배양액을 8000xg로 10분간 원심분리하고, 펠렛을 108 CFU/㎖로 PBS(pH 7)에 재현탁하였다. 세포 현탁액 4㎖을 10초간 볼텍싱하고 상온에서 3시간 배양하여 자동응집을 조사하였다. 각 시간에 상층의 세포현탁액 100㎕을 PBS 3.9㎖과 혼합하고 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 자동응집은 다음의 계산식으로 계산하였다.
[계산식]
1-(At/A0) x 100
At : 각 배양시간(1, 2, 3시간)에 따른 흡광도
A0 : 0시간의 흡광도
1-10. 접착력 스크리닝
Rosenberg 등(FEMS Microbiology Letters, 9:29-33)의 방법에 따라 KCC-36 균주의 소수성을 조사하였다. 세포표면 소수성은 인산완충액으로부터 탄화수소에 결합하는 미생물의 능력을 부여한다. 1일간 배양한 균주배양액을 5000xg로 15분간 원심분리하고, 세포를 수집하여 PBS(pH 7)로 세척하였다. 흡광도는 540nm에서 측정하였다. 세포현탁액 1㎖를 동부피의 탄화수소(자일렌 및 클로로포름)와 혼합하고, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 30초 후 수성용액의 흡광도(ODfinal)를 측정하고 초기값(ODinitial)과 비교하였다. 소수성은 다음 계산식으로 계산하였다.
소수성% = (ODinitial - ODfinal) / ODinitial x 100
1-11. 콜레스테롤 동화성 분석
Ilavenil 등(J Sci Food Agric, 96:593-601)의 방법에 따라 KCC-36 균주의 콜레스테롤 동화성을 조사하였다. 0.3% 옥스갈 및 100㎍/㎖의 수용성 콜레스테롤을 함유하는 MRS 액체배지를 준비하고, 3개의 50㎖ 튜브에 나누어 담은 다음 각각 KCC-36 균주를 접종하였다. 접종한 배양액을 37℃에서 6, 12, 24시간 배양한 다음, 튜브를 10000xg로 15분간 원심분리하고, 상등액에 콜레스테롤의 존재여부를 조사하였다.
1-12. 프리바이오틱스 사용성 분석
본 실험은 Ilavenil 등(J Sci Food Agric, 96:593-601)의 방법을 사용하여 수행하였다. 본 실험에서 MRS 액체배지에는 2% 라피노스(raffinose), 글루코스(glucose) 및 이눌린(inulin)이 첨가되었다. 새롭게 배양된 KCC-36 균주 배양액을 프리바이오틱스가 첨가된 액체배지에 첨가하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 글루코스를 첨가한 MRS 액체배지를 대조군으로 사용하였다. 최종 흡광도는 600nm에서 측정하였다. 균주에 의한 프리바이오틱스의 사용성은 계산식 [((MRSp - MRSb) x 100) / MRSg - MRSb)] 로 계산하였다. 이때 MRSp는 라피노스 및 이눌린이 처리된 실험군의 흡광도이고, MRSb는 탄소원이 없는 실험군의 흡광도(음성대조군)이며, MRSg는 글루코스를 처리한 실험군의 흡광도(양성대조군)이다.
1-13. DPPH법에 의한 자유라디칼 소거력 분석
Li 등(Food Chemistry, 135:1914-1919)의 방법에 약간의 변경을 적용하여 KCC-36 균주의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성을 측정하였다.
다양한 농도(10, 20, 30, 40 및 50㎍)의 균주 배양액(109CFU/㎖)을 1㎖의 DPPH 용액(0.05mM)과 혼합하고, 상온에서 30분간 암실에서 배양하였다. DPPH 용액을 대조군(control)으로 사용하였다. 메탄올과 균주세포의 혼합액은 Blank로 사용하였다. 흡광도는 517nm에서 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 다음 계산식으로 계산하였다.
DPPH 소거활성(%) = [(Asample - Ablank) / Acontrol] x 100
1-14. 과산화수소 라디칼 소거력 분석
Li 등(Food Chemistry, 135:1914-1919)의 방법에 따라 과산화수소 저항성을 조사하였다. 균주 배양액 10㎖을 원심분리하고 펠렛을 수집한 다음 각기 다른 농도(0.5, 1.0 및 1.5mM)의 H2O2가 함유된 10㎖의 0.9% NaCl과 혼합하였다. 각 샘플을 희석하고 BCP 한천플레이트를 사용하여 초기 및 37℃ 배양 30분 후의 균체의 생존력을 측정하였다. 실험은 3반복 수행하였다.
1-15. 저수분 사료분말 상의 적용
이탈리안라이그라스(IRG), 옥수수 및 수수 분말을 NIAS로부터 입수하여 에틸렌 가스로 멸균하였다. 멸균조건에서 상온 건조하여 상기 분말의 수분함량을 30%로 고정시켰다. 각 분말을 비접종 및 KCC-36 접종그룹으로 나누었다. 비접종 그룹은 상기 분말만을 발효분석에 사용하였고, 접종그룹은 1x10-4/250g의 KCC-36을 나누어 첨가하였다. 각 그룹당 3개의 샘플을 준비하고 공기흐름이 차단되도록 단단히 밀봉하였다. 상기 샘플들을 혐기조건에서 45일간 보관하고, 발효된 사료분말의 미생물수 및 pH를 조사하였다.
1-16. 통계 분석
모든 수치데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 얻었고, 이들 데이터의 분석은 SPSS 소프트웨어(SPSS-16 Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 평균값들 사이의 유의적인 차이는 P < 0.05를 유의성 레벨로 하는 다중분석을 사용하여 분석하였다.
2. 결과
2-1. 분리 및 스크리닝
뚜렷한 형태학적 특성을 바탕으로 KCC-36 균주를 분리하였다. 기본 확인 실험을 통해 분리된 균주가 그람양성, 비운동성, 원형, 카탈라아제 음성 및 중온성임을 확인하였다. 이를 바탕으로 분자적 특성, 항진균 및 프로바이오틱스 잠재력에 대해 추가로 실험하였다. 16S rRNA 서열 분석을 통해 KCC-36의 분자적 특성을 분석한 결과, Lactobacillus plantarum에 속하는 것으로 나타났다. 이 16S rRNA 서열은 NCBI 유전자 은행 데이터베이스에 KP091752.1로 기탁되었다.
2-2. 생화학적 특성 및 항생제 감수성
KCC-36 균주는 갈락토스(galactose), 글루코스, 프럭토스(fructose) 등을 발효하며(표 1 참조), α-갈락토시다제(α-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), α-글루코시다제(α-glucosidase)와 같은 효소를 생산하는 것으로 나타났다(표 2 참조). 또한 KCC-36 균주는 카나마이신(kanamycin), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 스트렙토마이신(streptomycin) 등의 항생제에 감수성을 나타내고, 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin) 등의 항생제에 저항성을 나타내었다(표 3 참조).
2-3. 항박테리아 활성
식품매개 병원균에 대한 항박테리아 활성을 조사한 결과, KCC-36은 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 우수한 항박테리아 활성이 있는 것으로 나타났다(도 1 참조).
2-4. 항진균 활성
진균에 대한 항진균 활성을 조사한 결과, KCC-36은 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 우수한 항진균 활성이 있는 것으로 나타났다(도 2 참조). 또한, pH 및 온도에 따른 KCC-36의 항진균 활성을 조사한 결과에서도 우수한 항진균 활성이 있는 것으로 나타났다(표 4 및 5 참조).
2-5. 산성조건 및 담즙염 내성
KCC-36의 다양한 pH 환경에 대한 내성을 조사한 결과, 산성 환경이 될수록 콜로니의 성장이 감소하기는 하지만 우수한 산성조건 내성을 나타내었다. 특히, 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 산성조건에 대한 내성이 우수한 것으로 나타났다(도 3 참조).
또한, pH2 및 pH3의 위액 환경에서도 우수한 내성을 나타내었으며(도 4 참조), 0.3% oxgall 및 0.5% sodium deoxycholate의 높은 농도의 담즙염 환경에서도 우수한 내성을 나타내었다(도 5 참조).
2-6. 세포응집 및 소수성
KCC-36의 세포응집은 시간에 따라 증가하며, 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 응집력이 더 우수한 것으로 나타났다(도 7 참조).
소수성 또한 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 높고, 특히 자일렌에 비해 클로로포름에 대해 높은 소수성을 나타냈다(도 6 참조).
2-7. 프리바이오틱 이용성 및 콜레스테롤 동화성
라피노스 및 이눌린을 사용하여 프리바이오틱 이용성을 조사한 결과, KCC-36은 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 프리바이오틱 이용성이 우수하고, 이눌린에 비해 라피노스를 더 잘 이용하는 것으로 나타났다(도 8 참조).
또한, 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 콜레스테롤 동화성도 우수한 것으로 나타났다(도 9 참조).
2-8. 항산화 효과
과산화수소 라디칼 및 DPPH 라디칼 소거활성 분석 방법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 조사한 결과, KCC-36은 비교균주인 KACC 91016 균주에 비해 자유라디칼 소거활성이 우수한 것으로 나타났다(도 10 및 11 참조).
2-9. 저수분 사료의 발효성
IRG, 옥수수 및 수수 분말을 사용하여 혐기조건에서 저수분 사료의 발효성을 조사한 결과, 저수분 사료에 KCC-36을 접종하였을 때 콜로니 생성이 증가하고, 발효로 인해 pH가 낮아진 것으로 나타났다(도 12 내지 14 참조). 이는 KCC-36이 저수분 사료를 효율적으로 발효할 수 있음을 의미한다.
Figure pat00001
+ : 양성반응, - : 음성반응, KACC : KACC 91016 균주
Figure pat00002
+ : 약한 생산, ++ : 보통의 생산, +++ : 강한 생산, KACC : KACC 91016 균주
Figure pat00003
S : 감수성(>10mm), R : 저항성, KACC : KACC 91016 균주
Figure pat00004
KACC : KACC 91016 균주
Figure pat00005
KACC : KACC 91016 균주
농업생명공학연구원 KACC92223P 20180220
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel Lactobacillus plantarum KCC-36 <130> PA-D18244 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1223 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus plantarum KCC-36 <400> 1 acgctggcgg cgtgctatac atgcaagtcg aacgaactct ggtattgatt ggtgcttgca 60 tcatgattta catttgagtg agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa acctgcccag 120 aagcggggga taacacctgg aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg 180 tccgagcttg aaagatggct tcggctatca cttttggatg gtcccgcggc gtattagcta 240 gatggtgggg taacggcctc accccattgg caatgatacc gtagccgaac cttgagaggg 300 taatcggcca catttgggac tgagaacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt 420 cggctcgtaa aacttctgtt gttaaagaag aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt 480 gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct 600 gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca 660 gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc 720 agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca 780 aacaggatta gataccctgg tagtccatac cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg 840 tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc 900 aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcta cgcgaagaac ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt 1020 agacgttccc tttcggggac atggatacag gtggtgcatg gcttgtcgtc agctcgtgtc 1080 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccat attatcagtt gccagcatta 1140 agttgggcac tctgttgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1200 atcatcatgc cccttaatga cct 1223

Claims (7)

  1. 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) KCC-36 균주(미생물 수탁번호 KACC 92223P).
  2. 제 1항의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 생균제제.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 생균제제는 사람 또는 가축용 프로바이오틱스 생균제제인 것을 특징으로 하는 생균제제.
  4. 제 1항의 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 식품.
  5. 제 1항의 균주로 발효하여 제조된 발효식품.
  6. 제 1항의 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 사료.
  7. 제 1항의 균주로 발효하여 제조된 발효사료.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2916398A1 (es) * 2020-12-30 2022-06-30 Univ Valencia Cepa de Lactobacillus plantarum, uso como probiótico y producto bioactivo derivado de ella

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160026948A (ko) * 2016-02-19 2016-03-09 대한민국(농촌진흥청장) 락토바실러스 플란타룸 kcc-19 및 이를 포함하는 조성물
KR20170049292A (ko) * 2015-10-28 2017-05-10 대한민국(농촌진흥청장) 락토바실러스 플란타룸 ｋｃｃ―２６ 및 이를 포함하는 조성물
KR20180020742A (ko) * 2016-08-19 2018-02-28 대한민국(농촌진흥청장) 락토바실러스 플란타룸 kcc-32 및 이를 포함하는 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170049292A (ko) * 2015-10-28 2017-05-10 대한민국(농촌진흥청장) 락토바실러스 플란타룸 ｋｃｃ―２６ 및 이를 포함하는 조성물
KR20160026948A (ko) * 2016-02-19 2016-03-09 대한민국(농촌진흥청장) 락토바실러스 플란타룸 kcc-19 및 이를 포함하는 조성물
KR20180020742A (ko) * 2016-08-19 2018-02-28 대한민국(농촌진흥청장) 락토바실러스 플란타룸 kcc-32 및 이를 포함하는 조성물

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Age. Res. Rev. 9, 107-116.
Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 18, 299-313.
Cell 124, 837-848.
Genbank Accession No.KP091751.1(2015.03.23.) *
Genbank Accession No.KP091752.1(2015.03.23.)* *
J. Nutr. Health Aging 5, 80-91.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2916398A1 (es) * 2020-12-30 2022-06-30 Univ Valencia Cepa de Lactobacillus plantarum, uso como probiótico y producto bioactivo derivado de ella
WO2022144483A1 (es) * 2020-12-30 2022-07-07 Universitat De València (60%) Cepa de lactobacillus plantarum, uso como probiótico y producto bioactivo derivado de ella

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