KR100777402B1 - 항산화 활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 ｓｃｄ균주의 배양 상등액 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항산화 활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(Bacillus polyfermenticus) 균주의 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물을 제공하는 것으로서, 상세하게는 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물을 실험동물에 과량을 철을 투여하여 산화적 스트레스를 유발시킨 후 in vitro 예비실험 결과 혈장의 총항산화능을 증대시키고, 과산화지질의 농도는 현저히 감소시키는 항산화 활성이 있으며, DNA 손상 억제활성을 in vivo 수준에서 평가한 결과 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상이 억제되며 회복시키는 활성을 가지고 있어 본 발명의 배양 상등액은 의약 및 건강식품분야에 있어서 아주 유용한 발명이다.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD, 배양 상등액, 항산화 활성
Description
도 1은 철의 산화적 스트레스를 유발하는 과정을 도시한 도이며,
도 2는 실험동물에 대한 식이지급 및 실험계획을 도시한 도이며,
도 3은 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액을 실험식이에 첨가하였을 경우 체중변화를 나타내는 도이며,
도 4는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액의 혈장 TRAP에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 5는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액의 혈장 지질관산화 농도에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 6은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액의 백혈구 DNA 손상 회복에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 7은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액의 대장세포 DNA 손상 회복에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
본 발명은 항산화 활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물에 관한 것이다.
최근에는 건강에 대한 관심이 많아지고, 한국인의 사망원인 중 제 1위를 차지하는 암의 예방과 치료를 위해 부작용의 우려가 없는 식이를 이용하고자 하는 노력이 집중되면서 프로바이오틱 생균제가 갖는 항발암 및 면역조절 효과에 대한 연구들이 보고되고 있다. 그러나 지금까지 프로바이오틱 생균제가 갖는 항발암 효과에 관한 연구는 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 이나 엔테로코코스 속(Enterococcus sp.)을 대상으로 한 것이 대부분이었으며 인체에 많은 이로운 작용을 한다고 알려진 비스판균에 대해서는 항돌연변이 및 항암효과가 거의 보고되어 있지 않는 실정이다.
암은 유전적인 요인과 환경적인 요인이 복합적으로 작용하여 진행되는 다단계과정이다. 정상세포에서 암조직으로 발달되는데는 크게 개시(initiation), 촉진(promotion), 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생하는 것으로 알려져 있으며, 발암의 개시는 전자 친화성 발암 인자(initiator)가 생체내에서 대사적으로 활성화되어 유전자의 핵산에 비가역적으로 결합함으로써 정상세포의 DNA를 손상시켜 신생물 전구세포(preneoplastic cell)를 형성하는 돌연변이 현상으로 설명된다. 촉진인자(promoter)는 발암인자와 독립적으로 세포막의 수용체(receptor)를 매개로 유전정보의 발현 및 분화에 가역적으로 관여하는 신생물세포(neoplastic cell)로 전화시키며 그 세포가 증식하는 과정에서 양성과 악성이 결정되고, 종양이 암으로 변화된다. 암의 개시단계에서 발생되는 DNA 손상은 암 발생과 83% 이상의 높은 상관성을 나타내므로 개시단계에서 손상된 DNA의 회복과정에 관여하는 물질의 발견은 항암 기작을 유추할 수 있는 근거가 된다고 볼 수 있을 것이다.
DNA 손상을 측정하기 위해 많은 연구방법들이 개발되어 왔는데 단세포전기영동법(Comet assay. single cell gel electrophoresis)는 처음 오틀링과 존슨(Ostling and Johanson)에 의해 각각의 세포수준에서의 DNA의 외가닥 절단 (single-strand breaks) 및 알칼리에 민감한 AP 사이트를 직접 확인하기 위하여 도입된 마이크로 겔 전기영동(micro gel electrophoresis) 방법으로 Singh 등에 의해 보다 민감하게 DNA 손상을 감지해 낼 수 있는 방법으로 발전되었다. 이 방법은 핵을 가진 어떤 조직에서도 DNA 손상정도를 측정할 수 있으며 분석시 소량의 시료만을 필요로 하고 실험과정이 간단하고 시료 채취 후 몇 시간 내에 결과를 얻을 수 있다는 등 많은 장점을 가지고 있다. 단세포 전기영동법을 이용하여 여러 종류의 발암물질에 의한 DNA 손상과 항발암물질과의 관계 등이 쉽게 관찰될 수 있었으며 우리 주변에서 가장 흔하게 발암물질에 노출되어 있는 흡연자의 경우 비흡연자보다 DNA 손상 정도가 유의하게 증가되어 있음이 보고되었다. Rao 등은 구강암환자의 구강 편평세포(oral squamous cell)에서 유의적으로 높은 DNA 손상을 보고하였으며 그 밖에 백혈병, 유방암 등 여러 종류의 암환자에서 단세포 전기영동법을 이용해 건강한 대조군에 비해 DNA가 유의적으로 높게 손상되어 있음을 관찰하였다.
과량의 철은 과산화수소(OH·) 생산을 증가시키는 산화적 스트레스 상태를 유발시킴으로 생체내에서 단백질, 지질, DNA를 공격하는 것으로 알려져 있다(도 1 참고).
그러나 상기 문헌 어디에도 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액의 항산화 활성에 대한 개시 또는 교시가 없다.
이에 따라, 본 발명자들은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물을 실험동물에 과량을 철을 투여하여 산화적 스트레스를 유발시킨 후 in vitro 예비실험 결과 항산화 활성이 있음을 확인하고, DNA 손상 억제활성을 in vivo 수준에서 평가한 결과 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상이 억제되며 회복됨을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항산화 활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액을 제공하며, 상기 배양 상등액은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주를 전배양한 후 발효조에 1-3%의 접종비(v/v)로 접종하고 TSB(tryptic soy broth)배지에서 30-40℃, 400-700 rpm, 0.1-2 vvm 통기량의 조건에서 3-10시간 동안 배양한 후의 배양액을 10000-15000 rpm에서 10-20분 동안 원심분리하여 수득한 것임을 특징으로 하는 배양 상등액을 의미한다.
또한, 본 발명은 항산화 활성을 갖는 상기 배양 상등액의 물 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알콜에 가용한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액의 극성용매 가용 추출물을 제공하며, 더욱 바람직하게는 상기 극성용매는 메탄올 또는 에탄올을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주를 전배양한 후 발효조에 1-5%, 바람직하게는 1-3%, 더욱 바람직하게는 2%의 접종비(v/v)로 접종하고 TSB(tryptic soy broth)배지에서 배양한다. 기본적인 발효조에서의 배양조건은 30-50℃, 바람직하게는 30-40℃, 더욱 바람직하게는 37℃에서, 400-700 rpm, 바람직하게는 500 rpm, 0.1-2 vvm, 바람직하게는 1 vvm의 통기량의 조건에서 배양할 수 있다. 상기 배양조에서 3-10시간동안, 바람직하게는 5시간동안 배양한 후의 배양액을 시료로 사용할 수 있다. 상기 배양액을 10000-15000 rpm, 바람직하게는 12000 rpm에서 10-20분 동안, 바람직하게는 15분 동안 원심분리하여 배양 상등액을 획득할 수 있다.
또한 상기에서 수득한 배양 상등액은 이것의 약 1 내지 15배의 부피, 바람직하게는 1-5배분량의 물, 메탄올, 에탄올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 30℃의 추출온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등이 추출방법으로, 1회 내지 12회, 바람직하게는 1회 추출한 후 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액의 메탄올, 에탄올 추출물을 각각 수득할 수 있다.
본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물은 혈장의 총항산화능을 증대시키고, 과산화지질의 농도는 현저히 감소시키며 산화적 스트레스에 의해 손상된 백혈구 및 대장세포의 DNA 손상을 억제하여 회복시키는 활성을 가지고 있다.
이하, 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일뿐, 본 발명이 이에 의하여 한정되지는 않는다.
실시예
1.
바실러스
폴리퍼멘티쿠스
SCD
균주의 배양액 준비
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주(KCCM 10104)를 전배양한 후 발효조에 2%의 접종비(v/v)로 접종하고 TSB(tryptic soy broth)배지에서 배양하였다. 기본적인 발효조에서의 배양조건은 37℃, 500 rpm, 1 vvm의 통기량이었다. 상기 배양조에서 5시간동안 배양한 후의 배양액을 시료로 사용하였으며, 12000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 배양 상등액을 획득하였다.
또한 상기에서 수득한 배양 상등액 1000㎖를 메탄올 1ℓ 또는 에탄올 1ℓ를 첨가하여 25℃ 에서 2시간 동안 1회 추출한 후 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액의 메탄올, 에탄올 추출물을 각각 수득하였다.
참조예
1. 실험동물의 준비
1-1. 실험동물의 준비
평균 체중이 250g인 6주령의 스프라우그-도우리(Sprague-Dawley) 종 수컷 흰쥐를 코아텍(Koatech)으로부터 입수하여 1주 동안 펠릿(pellet)으로 적응시킨 후, 쥐의 무게를 달아 난괴법으로 5군으로 나누었다. 실험동물은 5종류의 실험식이로 6주간 케이스에 한 마리씩 분리 사육하였고 실험식이와 물은 자유섭취법으로 공급하였다. 사육실의 실내온도는 22±2℃, 습도는 50±5%를 유지하고, 전등을 조절하여 낮 12시간, 밤 12시간으로 조절하였다.
1-2. 통계처리
모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 패키지를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준오차(SE)를 구하고, 두 군 이상의 군별 유의성 검증을 위해서는 원-웨이 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F 값을 구한 뒤, Durcan's multiple range test를 이용하여 각 군간의 유의성 차이를 검증하였다.
실험예
1. 체중증가량,
식이섭취량
및
식이효율에
미치는 영향
실험수행을 위해, 상기 참조예 1에서 준비한 실험동물에 대하여 상기 실시예 1에서 준비한 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액, 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물을 식이와 함께 섭취시켰을 경우, 체중증가량, 식이섭취량, 식이효율 및 장기체중에 미치는 영향을 실험하였다.
실험식이는 정상식이군(Normal Fe group, NFe)과 산화적 스트레스를 유발하기 위한 과량의 철투여군(High Fe supplemented group, HFe), 과량의 철과 동시에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주(B. polyfermenticus) 배양 상등액(CS), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액의 메탄올 추출물(MeCS), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액의 에탄올 추출물(EtCS)을 각각 음료에 1%의 농도로 섞어 투여한 군으로 총 6군으로 나누어 각 군당 10마리씩 배정하였으며 실험식이는 6주간 급여하였다(표 1, 도 2 참조). 하기 표 1의 비타민 혼합물1 )(AIN 76 비타민 혼합물; in g/kg of mixture)에는 티아민 HCl 0.6, 리보플라빈 0.6; 피리독신 HCl 0.7, 니아신 3, d-칼슘 팬토써네이트(d-calcium pantothenate) 1.6, 엽산(folic acid) 0.2, d-비오틴 0.02, 비타민 B12 0.001, 건조 비타민 A 팔미테이트(500,000 U/d) 0.8, 건조 비타민 E 아세테이트(500U/d) 10, 비타민 D3 트리튜에이션(400,000U/g) 0.25, menadione sodium bisulfite complex 0.15, 정제분말 수크로스 981.08가 함유되어 있으며, 하기 표 1의 미네랄 복합체2 )(AIN 76 미네랄 복합체; in g/kg of mixture): 인산칼슘, 2염기(dibasic) 500, 염화나트륨 74; 포타슘 시트레이트, 단일수화물 220, 황산 칼륨 52, 산화마그네슘 24, 산화된 탄산염(manganous carbonate, 43-48% Mn) 3.5, 철분을 함유한 구연산염(ferric citrate, 16-17% Fe) 6, 아연이 함유된 탄산염(zinc carbonate, 70% ZnO) 1.6, 구리함유 탄산염(cupric carbonate, 53-55% Cu) 0.3, 칼륨 요오드염(potassium iodate) 0.01, 나트륨 석고 (sodium selenite) 0.01, 크롬 칼륨 황산염(chromium potassium sulfate) 0.55, 분말정제된 수크로스 118.03가 함유되어 있다.
| 성분 | NFe | HFe |
| 카세인 | 20 | 20 |
| 옥수수전분 | 55.924 | 54.959 |
| 수크로스 | 10 | 10 |
| 옥수수유 | 5 | 5 |
| 셀룰로오즈 | 4 | 4 |
| 비타민 혼합물1 ) | 1 | 1 |
| 미네랄 혼합물2 ) | 3.5 | 3.5 |
| 콜린(Choline bitartarate) | 0.25 | 0.25 |
| DL-메티오닌 | 0.3 | 0.3 |
| BHT(Butylated hydroxy toluene) | 0.001 | 0.001 |
| 철분 (FeSO4·7H2O) | 0.025 | 0.99 |
| 총 | 100 | 100 |
1-1. 체중증가량,
식이섭취량
및
식이효율에
미치는 영향
식이섭취량은 하루에 한 번씩, 체중은 일주일에 한 번 일정한 시간에 측정하였다. 실험 기간 동안의 체중증가량을 같은 기간 동안의 총 식이섭취량으로 나누어 식이효율을 구하였다.
식이효율(FER)=6주간 체중증가량(g)/6주간 식이섭취량(g)
상기 실험 수행의 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 실험기간 중 평균 식이섭취량은 HFe와 EtCS 군에서 NFe군에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났으나 체중증가량과 식이효율 (FER) 각 군당 유의적인 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 도 3에서 보는 바와 같이, 실험기간의 체중의 증가 패턴 또한 각 군 사이에 유사한 결과가 나타남을 확인할 수 있었다.
| 체중증가량(g/d) | 식이섭취량(g/d) | 식이효율 | |
| NFe | 2.4±0.21) | 17.9±0.2a2 ) | 13.3±0.9 |
| HFe | 2.7±0.1 | 18.8±0.2b | 14.3±0.7 |
| CS | 2.6±0.1 | 18.5±0.2ab | 14.3±0.6 |
| MeCS | 2.3±0.2 | 18.6±0.3ab | 12.2±0.9 |
| EtCS | 2.4±0.1 | 18.9±0.2b | 12.8±0.6 |
1) Mean±SD
2) Values with different superscript within a column are significantly different at p<0.05.
1-2. 장기무게에 미치는 영향
상기 실험예 1-1과 동일한 방법으로 실험하여 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주의 배양 상등액, 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물을 첨가한 실험식이가 쥐의 100g 당 장기무게에 미치는 영향을 실험하였다.
상기 실험 수행의 결과 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 심장의 무게는 MeCS군이 NFe군에 비해 유의적으로 증가한 것으로 나타났으며 이외의 모든 장기의 중량변화에는 별다른 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
| 간 | 심장 | 신장 | 비장 | |
| NFe | 2.55±0.041) | 0.32±0.02a2 ) | 0.60±0.01 | 0.19±0.01 |
| HFe | 2.67±0.04 | 0.35±0.01ab | 0.58±0.01 | 0.20±0.01 |
| CS | 2.63±0.05 | 0.35±0.01ab | 0.61±0.01 | 0.18±0.01 |
| MeCS | 2.64±0.11 | 0.38±0.02b | 0.62±0.02 | 0.21±0.01 |
| EtCS | 2.58±0.05 | 0.36±0.01ab | 0.62±0.02 | 0.20±0.01 |
1) Mean±SD
2) Values with different superscript within a column are significantly different at p<0.05.
실험예
2. 혈장 TRAP 측정
2-1. 혈액 및 각종 장기의 채취
상기 참고예 1에서 준비한 실험동물을 희생시키기 전 12시간 동안 금식을 시킨 후 , 에틸에테르로 마취하여 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하고 헤파린으로 응고를 방지하였다. 상기 채취한 혈액을 3000rpm에서 30분간 원심분리하여 혈장과 적혈구를 분리하여 분석할 때까지 -70℃에 냉동 보관하였다.
실험동물의 장기는 적출하여 생리식염수에 세척한 후, 흡수지로 물기를 제거하고 무게를 측정한 후 액체질소로 급속냉동시킨 후 분석시까지 -70℃에 냉동 보관하였다.
2-2. 혈장 TRAP 측정
혈장 중 총항산화능을 측정하는 TRAP 분석은 ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazo- line 6-sulfonate), 150μM)와 메트마이오글로빈(metmyoglobin, 2.5μM)을 H2O2(75μM)로 활성화시킴으로써 생성된 페릴 마이오글로빈 라디컬종(ferryl myoglobin radical species)과의 상호 작용에 의해 형성된 ABTS 라디컬 양이온의 흡광도를 측정하는데 기초를 두고 있으며 그 흡광도의 억제 정도는 샘플(0.84% 플라스마)에 들어 있는 항산화능에 비례하게 된다. 샘플을 6분 동안 30 ℃에서 배양한 후 UV/VIS 분광계로 740nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 혈장의 TRAP 농도는 trolox의 calibration curve를 이용하여 계산하며 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity, mM)로 나타내었다.
상기 실험 수행의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 혈장의 총항산화력을 나타내는 TRAP 분석 결과 정상대조군(NFe)에 비해 과량의 철 투여군(HFe)의 총항산화력은 유의적으로 감소한 것으로 나타나 과량의 철 투여시 혈장 항산화 상태가 매우 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 반면 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액 투여군(CS)과 배양 상등액의 메탄올 추출물 투여군(MeCS)에서 과량의 철 투여군(HFe)에 비해 유의적으로 총항산화력이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 배양 상등액의 에탄올 추출물 투여군(EtCS)의 과량의 철 투여군(HFe)에 비해 증가한 경향은 있었으나 통계적인 유의성은 없었다.
실험예
3. 과산화지질 (Baseline
Diene
Corrjugation
in LDL lipids) 측정
상기 실험예 2-1에서 분리해낸 혈장 100㎕에 1.1mg EDTA와 1100㎕ trisodium cirtrate Buffer(0.064M)를 진탕혼합 후 600㎕ trisodium cirtrate Buffer(0.064M)를 다시 혼합하여 2500rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 LDL를 획득하였다. 분리한 LDL에 0.1M Na-phosphate Buffer 100㎕, 클로로포름:메탄올을 2:1 비율의 혼합한 것 3㎖와 3차 증류수 1㎖을 혼합하여 2500rpm에서 10분 동안 원심 분리하였고 다시 분리한 클로로포름을 질소(N2)가스로 치환한 후 시클로헥산 1㎖을 첨가하고 Spectrophotometer(234nm)에서 측정하였다.
상기 실험 수행의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 혈장 과산화지질정도를 반영하는 conjugated dienes의 측정 결과 과량의 철 투여군(HFe)은 정상대조군 (NFe)에 비해 유의적으로 혈장 CD의 농도가 증가하였으며 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액, 메탄올 및 에탄올 추출물 투여시 혈장 CD의 농도는 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
실험예
4. 백혈구 및 대장 조직 내 DNA 손상회복에 대한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스
SCD
균주
배양 상등액이
미치는 영향
상기 실험예 2-1에서 준비한 전혈 20㎕을 채취하여 75㎕의 0.7% LMA(low meltin g agarose gel)과 섞은 후, 0.5% NMA(normal melting agarose)가 코xp티co팅된 fully frosted slide위로 전혈과 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버 글라스로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. 겔이 굳으면 커버 글라스를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75㎕로 한 겹 더 덮었다. 세포 용해를 위해 미리 준비해 둔 차가운 알칼리 용해 버퍼(2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM tris)에 사용직전에 1% Triton X-100을 섞은 후 슬라이드를 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 DNA의 이중나선을 풀어주었다. 용해가 끝난 슬라이드를 전기영동 탱크(electrophoresis tank)에 배열하고 4℃의 차가운 버퍼(300mM NaOH, 10mM Na2EDTA)를 채워 언와인딩(unwinding) 시켰다. 그 후 20분이 지나면 25V/300±3mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4M Tris 완충용액(pH 7.4)으로 충분히 세척하고 20㎕/㎖ 농도의 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 핵을 염색하여 형광 현미경상에서 관찰하고 CCD 카메라를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 코멧 이미지 분석 시스템(comet image analyzing system)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 전혈 또는 임파구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액에 의한 손상억제정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리(tail length)를 정량하여 이동정도를 측정하였다. 대장조직은 콜라게나아제(collagenase)로 세포를 분리해 낸 뒤 혈액과 같은 방법으로 코멧 분석을 실시하였다.
앞서 살펴 본 항산화 관련 다양한 지표 중 혈장 총항산화력을 나타내는 혈장 TRAP은 HFe군에서 유의적으로 감소한 반면 과산화지질을 나타내는 혈장 CD는 HFe군에서 유의적으로 증가한 것으로 보아 6주간의 식이를 통한 과량의 철 투여는 SD 마우스의 산화적 스트레스 유발에 적합한 실험 구상이다. 과량의 철 투여로 유발된 산화적 스트레스에 의해 백혈구 및 대장 조직의 DNA 손상에 미치는 영향을 살펴보기 위해 백혈구와 대장세포를 이용해 코멧 분석(comet assay)를 실시하였다.
상기 실험 수행의 결과, 도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이 과량의 철 투여시 백혈구와 대장세포의 DNA 손상정도가 정상대조군에 비해 유의적으로 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 백혈구의 경우 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액(CS) 투여시 HFe군에 비해 유의적으로 DNA 손상정도가 감소하였으며, 메탄올 추출물 투여군(MeCS)의 경우 유의적이지는 않지만 감소한 경향을 보여주었다. 반면 에탄올 추출물 투여군(EtCS)의 경우에는 백혈구 DNA 손상을 억제하는 활성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
또한, 대장세포의 경우 CS와 MeCS 투여군에서 HFe군에 비해 DNA 손상이 유의적으로 감소하였으며 EtCS 투여군의 경우에도 유의적이지는 않지만 감소하는 경향을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
상술한 바와 같이, 본 발명은 항산화 활성을 갖는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(Bacillus polyfermenticus) 균주의 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물을 제공한다. 본 발명의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물을 실험동물에 과량을 철을 투여하여 산화적 스트레스를 유발시킨 후 in vitro 예비실험 결과 혈장의 총항산화능을 증대시키고, 과산화지질의 농도는 현저히 감소시키는 항산화 활성이 있으며, DNA 손상 억제활성을 in vivo 수준에서 평가한 결과 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상이 억제되며 회복시키는 활성을 가지고 있어 본 발명의 배양 상등액 및 이의 극성용매 추출물은 항산화제 또는 암 예방을 위한 의약 및 건강식품분야에 있어서 아주 유용한 발명이다.
Claims (4)
- 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 균주(기탁번호: KCCM 10104)를 전배양한 후 발효조에 1-3%의 접종비(v/v)로 접종하고 TSB(tryptic soy broth)배지에서 30-40℃, 400-700 rpm, 0.1-2 vvm 통기량의 조건에서 3-10시간 동안 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 획득한 배양상등액에 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 추출함으로써 얻은 항산화활성 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품조성물.
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