KR100218233B1

KR100218233B1 - 비피더스균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물

Info

Publication number: KR100218233B1
Application number: KR1019970027145A
Authority: KR
Inventors: 박종진; 변정수; 홍승서; 이현수
Original assignee: 박종헌; 주식회사삼양제넥스
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1997-06-25
Publication date: 1999-10-01
Also published as: KR19990003300A

Abstract

본 발명은 비피더스균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 편성 혐기성인 비피더스균을 고농도로 배양하기 위한 신규의 배지 조성물 및 그를 이용한 비피더스균의 생산방법에 관한 것이다. 탈지분유 4∼20중량부, 효모추출물 0.1∼2.0중량부, 계면활성제 0.05∼1.0중량부, 인산염 0.05∼1.2중량부, 항산화제 0.01∼0.3중량부 및 초산염 0.05∼1.0중량부를 포함하는 본 발명의 배지는 간단하고 경제적인 조성으로 이루어져 있을 뿐만 아니라, 비피더스균의 고농도 배양에 적합하다. 이와 같은 배지에서 고농도로 생산된 비피더스균 또는 그의 분말 비피더스균은 유산균 제제, 유가공품 및 생균제 등에 광범위하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

비피더스균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물

본 발명은 비피더스균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 편성 혐기성인 비피더스균을 고농도로 배양하기 위한 신규의 배지 조성물 및 그를 이용한 비피더스균의 생산방법에 관한 것이다.

비피더스균은 유산균의 일종으로, 일반적으로 비피더스균, 비피도박테리움 또는 비피더스 유산균 등으로 불리어지며, 균종과 배양조건에 따라 막대형, 분지형, Y자형 또는 곤봉형 등 다양한 형태를 나타낸다. 비피더스균은 1899년 프랑스 과학자인 티지어(Tissier)에 의해 모유 영양아의 분변에서 최초로 발견되었으며, 분유로 키운 인공영양아보다는 모유로 키운 모유영양아에서 더 많이 발견되는 것으로 알려져 있다.

일반 유산균은 산소가 존재하는 곳에서도 성장하는 통성 혐기성 세균인 반면, 비피더스균은 산소가 존재하는 곳에서는 성장하지 못하는 편성 혐기성 세균이다. 또한, 일반 유산균은 동질발효(homofermentative) 경로를 통하여 탄수화물로부터 유산만을 생성하거나, 이질발효(heterofermentative) 경로를 통하여 유산과 에탄올 및 이산화탄소를 생성하는 반면, 비피더스균은 비피더스 전환(shunt)이라는 경로로 탄수화물을 분해하여 유산과 초산을 2:3의 몰농도비로 생성하는 특징을 지니고 있다.

이러한 비피더스균은 우유에서는 거의 나타나지 않으나 사람의 장내균 총(intestinal microflora)을 구성하는 주요군으로서, 장내 유해세균이 생산하는 암모니아, 아민류, 페놀류, 인돌 및 황화수소와 같은 발암관련 부패산물의 생성을 억제하는 기능을 지니고 있으며, 설사 및 변비개선, 면역기능 강화 및 비타민 합성과 콜레스테롤 감소기능을 통하여 사람의 건강유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 비피더스균은 어린이나 성인의 장내에는 많이 존재하여 장을 건강하게 유지시키는 장내 유익균이나, 노인이 되면 그 수가 현저히 감소되는 반면에 어린이나 성인의 장에서는 거의 발견되지 않은 장의 대표적인 유해세균인 웰슈균이 현저히 증가하여, 장의 기능이 감소하여 장의 노화가 촉진되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 장을 건강하게 유지시키는 방법으로 장내 비피더스균의 수를 일정하게 유지시키는 것이 건강유지에 필수적이라고 할 수 있다.

장내 비피더스균을 증식시키는 방법으로는 비피더스균만 특이하게 증식시키는 물질을 섭취하는 방법, 예를 들면 올리고당이나 식이섬유를 섭취하는 방법과 비피더스균 자체를 섭취하는 방법, 예를 들면 비피더스균을 이용한 유제품을 섭취하거나 비피더스균을 건조하여 분말화한 분말 비피더스균을 섭취하는 방법이 있다. 비피더스균이 혐기성 균주인 관계로 비피더스균이 함유된 유제품을 제조하기 위해서는 산 생성율을 촉진시키고, 단기배양을 위하여 많은 양을 접종하거나 높은 농도의 비피더스균을 제품에 혼합시킨다.

따라서, 비피더스균을 이용한 유제품을 제조하거나 분말 비피더스균을 제조하기 위해서는 비피더스균의 배양공정이 필수적인데, 경제성에 적합하고 산업화를 위해서는 비피더스균의 활력이 높게 유지되면서 경제적으로 잇점이 있는 고농도 배양방법이 필요하였다. 그런데, 상기에서 기술한 바와 같이 비피더스균은 생육조건이 까다롭고 독특한 생리적 특징때문에, 고농도로 배양하는데에는 많은 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하고자, 비피더스균의 배양배지가 새롭게 개발되었는데, 그 예로는 무기염, 비타민, 질소원 및 탄소원을 함유하는 합성배지(참조: J. Dairy Sci., 71:3214-3221(1988)), BL 배지(참조: Cultured Dairy Products Journal, 1991, May, pp32-33) 및 TYG 배지(참조: 대한민국 특허출원 제93-14452호)가 있다. 그러나, 이들 배지는 그의 조성이 까다롭고 가격이 비싸며, 더우기 고농도로 비피더스균을 배양하지 못하여 특수 연구목적외의 기타 산업적 용도로 이용되지 못한다는 문제점을 가지고 있었다.

이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하고자 예의 연구노력한 결과, 탈지분유 4∼20중량부, 효모추출물 0.1∼2.0중량부, 계면활성제 0.05∼1.0중량부, 인산염 0.05∼1.2중량부, 항산화제 0.01∼0.3중량부, 초산염 0.05∼1.0중량부 및 탄산염 0.01∼0.3중량부를 포함하는, 경제적이면서도 그의 조성이 간단한 배지 조성물을 개발한 다음, 그 배양배지에서 비피더스균을 배양하면 지금까지 보고된 여타의 배양배지에서보다 비피더스균을 고농도로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 편성 혐기성인 비피더스균의 고농도 배양을 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 배지 조성물의 배지에서 비피더스균을 고농도로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 발명자들은 탈지분유, 바람직하게는 단백질 분해효소로 처리된 탈지분유 4∼20중량부; 효모추출물 0.1∼2.0중량부, 바람직하게는 0.1∼0.5중량부; 계면활성제 0.05∼1.0중량부, 바람직하게는 0.05∼0.5중량부; 인산염 0.05∼1.2중량부, 바람직하게는 0.1∼0.4중량부; 항산화제 0.01∼0.3중량부, 바람직하게는 0.01∼0.05중량부; 및, 초산염 0.05∼1.0중량부, 바람직하게는 0.1∼0.4중량부를 포함하는 비피더스균의 배양배지 조성물을 개발하였다. 이때, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄 계를 사용할 수 있고, 항산화제는 아스코르브산, 시스테인, 글루탐산 등을 사용할 수 있다. 또한, 비피더스균은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium animalis) 등을 사용할 수 있다.

상술한 본 발명의 배지에 비피더스균을 접종하고 배양하여, 시판되고 있는 공지배지에서의 생균수와 비교한 결과, 공지배지에서보다 무려 4∼9배 이상으로 비피더스균을 증식시킴을 확인하였다.

아울러, 상기 배지 조성물은 편성 혐기성의 비피더스균을 배양하기 위한 것이므로, 균의 배양시 배양용기에 존재하는 산소를 이산화탄소 가스 또는 질소가스로 치환하여야 한다. 이러한 치환과정을 생략하는 대신에, 상기 배지 조성물에 탄산염을 0.01∼0.3중량부 첨가함으로써 CO₂가스 주입과 같은 효과를 얻을 수 있으므로, 본 발명의 배지는 더욱 경제적이다.

상술한 본 발명의 배지에 비피더스균을 접종하고, pH를 5.0∼7.0으로 조절하면서 배양하면, 비피더스균의 증식을 더욱 향상시킬 수 있다.

이렇게 배양된 배양액은 원심분리기를 이용하여 균체만 회수한 후, 안정제와 혼합하여 동결건조시킨 다음, 미분쇄기로 분쇄하여 분말 비피더스균을 얻을 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[단백질 분해효소를 처리된 생유에서의 배양효과]

시판되고 있는 생유 100ml을 200ml의 삼각플라스크에 담아 110

에서 20분간 멸균하고, 한천이 제거된 BL배지(주식회사영연화학, 일본)에서 37

로 14시간 배양된 비피도박테리움 롱검 KCTC8649P(Bifidobacterium longum KCTC8649P) 종균을 3%(v/v) 접종한 다음, O₂가 제거된 CO₂로 삼각플라스크의 공간을 치환하고, 37에서 혐기적으로 16시간 배양하였다. 배양액 100㎕를 취하여 장내세균의 세계(광강지족, 동지서방신간사, 일본국)에 수록된 희석액으로 10∼100단계법을 이용하여 희석한 다음, BL 한천배지에 하나의 플레이트당 30∼300개의 집락을 이루도록 도말하였다. 그런 다음, 37

의 혐기 배양기(FA시리즈, 히라야마, 일본국)에서 48시간 배양하여 나타난 집락수를 헤아리고 희석배수를 곱하여 생균수를 계산하였다.

아울러, 시판되고 있는 생유 100ml을 단백질 분해효소로 42

에서 2시간 분해시킨다는 점을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 종균 접종, 배양 및 생균수를 계산하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보듯이, 시유 단독보다 시유와 단백질 분해효소를 혼용 첨가한 배지에서 비피더스균이 고농도로 생산됨을 알 수 있었다.

[실시예 2]

[효모추출물을 구성성분으로 포함하는 배지에서의 배양효과]

시유는 가격이 비싸기 때문에, 대신에 탈지분유를 기본으로 하여 비피더스균의 성장을 측정하였다. 탈지분유 6g에 증류수를 첨가하여 100ml가 되도록 하고, 단백질 분해효소를 실시예 1과 같이 처리한 다음, 그를 대조군으로 하였다. 아울러, 효모추출물의 효과를 알아보기 위해, 대조군에 효모추출물을 0.3g, 0.8g, 1.5g을 각각 넣고, 115

에서 15분간 멸균하였다. 여기에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양한 다음, 생균수를 측정하였는데, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보듯이, 효모추출물은 비피더스균의 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 3]

[면활성제를 구성성분으로 포함하는 배지에서의 배양효과]

계면활성제가 비피더스균의 영양소 흡수를 촉진하여 균의 증식을 촉진시키는지 알아보기 위하여, 실시예 2에서 입증된 효모추출물 0.3중량부가 함유된 배지를 대조군으로 하였으며, 여기에 계면활성제 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate)가 각각 0.07, 0.3, 0.8중량부 함유된 배지에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양하고 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 보듯이, 계면활성제는 비피더스균의 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 4]

[산염을 구성성분으로 포함하는 배지에서의 배양효과]

비피더스균은 산 생성 속도가 빨라 균에 손상을 입히기 때문에 완충성분이 필요하였다. 이에, 본 실시예에서는 인산염이 비피더스균의 증식에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 실시예 3에서 입증된 계면활성제 0.07중량부가 함유된 배지를 대조군으로 하였으며, 여기에 인산나트륨이 각각 0.07, 0.2, 0.6, 1.0중량부 함유된 배지에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양하고 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 보듯이, 인산염은 비피더스균의 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 5]

[산화제를 구성성분으로 포함하는 배지에서의 배양효과]

비피더스균은 혐기성 세균이므로 산소가 존재하는 곳에서는 성장하지 못하는 특징이 있어 보통 항산화제를 첨가하여 배양하는데, 본 실시예에서도 항산화제가 비피더스균의 증식에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 실시예 4에서 입증된 인산염 0.2중량부 함유된 배지를 대조군으로 하였으며, 여기에 아스코르브산이 0.03, 0.07중량부 함유된 배지에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양하고 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

아울러, 항산화제로서 아스코르브산 0.03중량부에 시스테인이 0.03, 0.07중량부 첨가된 배지에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양하고 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 5 및 6에서 보듯이, 아스코르브산이나 시스테인의 항산화제는 비피더스균의 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 6]

[탈지분유의 함량에 따른 배양효과]

탈지분유의 함량이 비피더스균의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 탈지분유 6중량부, 15중량부 및 25중량부 각각을 단백질 분해효소로 처리하고, 효모추출물 0.3중량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트 0.3중량부, 인산나트륨 0.2중량부, 아스코르브산 또는 시스테인 0.03중량부를 첨가한 다음, 실시예 2에서와 같이 115

에서 20분간 멸균하였다. 여기에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양하고 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에서 보듯이, 탈지분유의 함량은 약 15중량부가 비피더스균의 증식에 가장 바람직함을 알 수 있었다.

[실시예 7]

[초산염을 구성성분으로 포함하는 배지에서의 배양효과]

초산염이 비피더스균의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 실시예 6에서 확립한 배지를 대조군으로 하였으며, 여기에 아세트산나트륨이 0.2, 0.6 중량부 함유된 배지에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양하고 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

상기 표 8에서 보듯이, 초산염은 비피더스균의 증식을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 8]

[본 발명 및 공지의 배지에서의 비피더스균 증식정도 비교]

실시예 7에서 최적화한 배지 조성물이 현재 시판되고 있는 배양배지보다 비피더스를 더욱 증식시키는지 알아보기 위하여, 한천이 제거된 시판의 BL 배지(주식회사영연화학, 일본국) 및 MRS배지(Difco, USA)에 실시예 1과 동일한 방법으로 종균을 접종하여 배양한 다음 생균수를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.

상기 표 9에서 보듯이, 본 발명의 배지는 시판되고 있는 배지들보다 무려 4∼9배 이상으로 비피더스균을 고농도로 증식시킴을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 배지가 비피더스균의 고농도 배양에 적합하고 경제적인 배지인 것으로 확인하였다.

[실시예 9]

[발효조에서의 배양]

본 발명의 배지가 산업적으로 유용한지를 알아보기 위하여, 발효조를 이용하여 비피더스균의 증식을 조사하였다. 그런데, 발효조 가동시 배지이외의 공간에 산소가 존재하기 때문에 CO₂가스와 같은 기체로 치환을 해야하는 번거로움이 있었다. 만약, 배지에 CO₂가스를 대체할 성분을 넣어 CO₂가스 주입과 같은 효과를 얻을 수 있다면 더욱 경제적이라 할 수 있을 것이다. 이에, 본 실시예에서는 탄산염을 이용하여 CO₂가스의 대체 여부에 대하여 조사하였다. 즉, 2L 발효조(비브라운 사, 독일)에 실시예 8에서 그 효과가 규명된 배지 조성물 1L를 넣고, 115

에서 20분간 멸균한 다음, 실시예 1에서와 같은 방법으로 비피더스 종균을 접종하고, 발효조내 상부 공간을 고순도 CO₂가스로 치환하여, 10∼200rpm으로 교반하면서 배양하였다.

또 다른 하나의 발효조에는 CO₂가스의 치환 대신에 탄산염을 0.05중량부 첨가한다는 점을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 종균 접종 및 배양을 수행하였다. 이때, 대조군으로는 CO₂가스의 치환이 없거나 탄산염이 함유되지 않은 배지에서 배양한 것으로 하였다. 배양후 실시예 1에서와 같은 방법으로 균수를 분석하였는데, 그 결과는 하기 표 10에 나타내었다.

상기 표 10에서 보듯이, 발효조에서도 본 발명의 배지는 고농도 비피더스균 배양에 적합하다는 것을 알 수 있었으며, 탄산염의 첨가로 CO₂가스의 치환과정을 생략할 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예 10]

[pH 6.0으로 조절된 배지에서의 배양효과]

실시예 9에서 확립된 배지로 배양할 때, pH 조절이 비피더스 생장에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 2L 발효조(비브라운사, 독일)에서 pH를 조절하지 않은 것을 대조군으로 하였으며, pH를 6.0으로 조절한 것을 실험군으로 하였다. 그런 다음, 그 이후의 과정은 실시예 9와 동일한 방법으로 진행하였다. 이와 같은 방법으로 측정된 생균수는 하기 표 11에 나타내었다.

[실시예 11]

[비피더스균의 분말화]

실시예 10에서와 같이 배양된 비피더스균을 원심분리기(콘트론사, 이태리)를 이용하여 회수하고 안정제로 안정화시켰다. 안정화된 균주 농축액을 동결시킨 후 동결건조기(랩콘코사, 미국)에서 건조시키고, 건조된 균주를 미분쇄기로 분쇄하여 분말 비피더스균을 제조하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 배지는 간단하고 경제적인 조성으로 이루어져 있을 뿐만 아니라, 비피더스균의 고농도 배양에 적합하다. 이와 같은 배지에서 고농도로 생산된 비피더스균 또는 그의 분말 비피더스균은 유산균 제제, 유가공품 및 생균제 등에 광범위하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims

탈지분유 4∼20중량부, 효모추출물 0.1∼2.0중량부, 계면활성제 0.05∼1.0중량부, 인산염 0.05∼1.2중량부, 항산화제 0.01∼0.3중량부 및 초산염 0.05∼1.0중량부를 포함하는 비피더스균의 배양배지 조성물.
제1항에 있어서, 탄산염 0.01∼0.3중량부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 탈지분유는 단백질 분해효소로 처리된 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄 계열에 속하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 항산화제는 아스코르브산, 시스테인 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 비피더스균은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium animalis)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항의 배지에 비피더스균을 접종하고, pH를 5.0∼7.0으로 조절하면서 배양한 다음, 균체를 회수하는 공정을 포함하는 비피더스균의 생산방법.