KR0169804B1 - 비피도박테리움의 배양 방법 - Google Patents

Abstract

칼슘 카보네이트를 첨가한 새로운 버퍼 시스템으로 사용하여 유기산을 생성하는 혐기성 균주인 Bifidobacterium을 배양할 경우, 배지에 첨가하는 칼슘카보네이트의 양을 조절함으로써 배지내의 pH를 특정 pH로 지속적으로 유지시킬 수 있으며, 혐기 배양 장치 없이도 산과의 반응 중 발생하는 이산화탄소에 의해 혐기상태를 유지시킬 수 있어, Bifidobacterium을 고농도로 배양할 수 있다.

Description

비피도박테리움의 배양 방법

제1도는 칼슘 카보네이트의 비드를 제조하는 방법을 개략적으로 나타내는 설명도.

제2도(a), (b), (c)는 유기산과 칼슘 카보네이트 비드의 첨가량에 따른 pH의 변화를 나타내는 그래프.

제3도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드를 첨가한 일반 TPY 배지에서 Bifidobacterium longum의 생장특성을 나타내는 그래프.

제4도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드의 첨가량을 달리하여 첨가한 일반 TPY 배지에서의 B. longum의 생장시 pH의 변화를 나타내는 그래프.

제5도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드의 첨가량을 달리하여 첨가한 일반 TPY 배지에서의 B. longum의 생장시 OD의 변화를 나타내는 그래프.

제6도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드를 30% 첨가해준 TPY 배지에서 당농도를 1.0%로 하였을 경우 B. longum의 생장 특성을 나타내는 그래프.

제7도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드를 30% 첨가해 준 TPY 배지에서 당농도를 1.5%로 하였을 경우 B. longum의 생장 특성을 나타내는 그래프.

제8도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드를 30% 첨가해준 TPY 배지에서 당농도를 2.0%로 하였을 경우 B. longum의 생장 특성을 나타내는 그래프.

제9도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드를 30% 첨가해준 TPY 배지에서 당농도를 2.5%로 하였을 경우 B. longum의 생장 특성을 나타내는 그래프.

제10도는 본 발명의 일 실시예에 따라 칼슘 카보네이트 비드를 30% 첨가해준 TPY 배지에서 당농도를 5.0%로 하였을 경우 B. longum의 생장 특성을 나타내는 그래프.

[기술 분야]

본 발명은 비피도박테리움(이하 Bifidobacterium이라함)의 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유기산을 생성하는 혐기성 박테리아인 Bifidobacterium을 pH 조절장치 및 혐기 배양 장치 없이 배양할 수 있는 Bifidobacterium의 배양방법에 관한 기술이다.

[종래 기술]

Bifidobacterium은 편성 및 통성 혐기성인 Gram 양성의 간균으로, 무아포성이며 인체의 장내에 서식하면서 장내의 pH를 떨어뜨려 부패균의 생장을 저해하는 정장작용을 하는 균이다. Bifidobacterium은 1899년에 Tisser에 의해 모유 영양아의 분변에서 최초로 분리되었고, Bifidobacterium의 주요한 서식처는 인체내의 장관이며, 모유 영양아의 장내에서 최우세균종으로 검출되며, 건강한 성인에 있어서도 우세균종으로 장내균총을 형성한다. 그 밖에 여러 항온 동물의 장관등에서 발견되었으며, 현재 인체 유래의 Bifidobacterium 5 종을 포함하여 24 개의 종으로 분류되어 있다. Bifidobacterium의 현미경적 모양은 V자 혹은 Y자의 분지형이며, 직간균, 또는 만곡상 간균의 형상을 하고 있으며, 운동성이 없다.

한편 유산균은 식품의 영양가치의 향상, 장내 균총의 균형 유지, 유당 소화의 개선 등의 여러가지 생리학적 효과가 보고되고 있으며, 그 중에서도 상기한 Bifidobacterium이 크게 주목 받고 있다. 모유 영양아와 인공 영양아의 질병 발생율과 사망율의 차이를 나타내게 하는 주요한 요인으로서 모유 영양아가 인공 영양아에 비해 장내 감염에 대한 감수성이 훨씬 적으며, Bifidobacterium이 이러한 면역 저항성을 증가시키는데 중요한 역할을 담당한다는 임상적인 결과가 밝혀지면서 Bifidobacterium에 대한 관심이 증가되었다. 그리고 Bifidobacterium은 유아 뿐만 아니라 성인에 있어서도 Bifidobacterium의 장내 균수 변동이 스트레스나, 질병, 암, 노화 등에 밀접하게 관련되어 있는 것으로 밝혀짐에 따라 Bifidobacterium의 건강 기여효과가 각광을 받게 되었다. 또한 Bifidobacterium은 단백질 등의 소화 과정이나 부패균에 의하여 생성되는 여러가지 독성물질, 특히 nitrosoamine등의 발암물질을 분해하는 능력이 있기 때문에 대장암 등에 대한 항암 및 제암 효과가 있다고 보고되고 있으며, 숙주의 면역능력을 증진시키는 등의 여러가지 유익한 작용을 하며, 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시키는 등의 인체에 유익한 여러가지 작용을 하는 균으로 알려져 있다.

이에 따라 근래에 들어 건강에 대한 사회적 관심이 증가하면서 치료 및 예방학적 측면에서 장내 균총과 건강과의 관련성이 폭넓게 연구, 검토되고 있으며 전세계적으로 Bifidobacterium을 함유한 유제품 및 생균제제등이 계속적으로 개발되고 있으며, 그 사용 분야가 점차 늘어나고 있다.

Bifidobacterium은 요구르트를 비롯한 여러가지 낙농 유제품에 종균으로 사용되고 있으며, 인공 영양아를 위한 조제분유의 제조와 생균제제, 그리고 Bifidobacterium 함유 아이스크림이나, 샐러드 드레싱(salad dressing) 등의 식품에 첨가되고 있다. 또한 사람 및 가축에 대한 치료제 및 예방제로써도 사용되고 있고, 보습제 등의 제조에 이용되기도 한다. 세계적으로는 이미 60년대 이후부터 일본이나 유럽등지에서 요구르트를 비롯한 낙농유제품에 사용되기 시작하였으며, 80년대 들어 급격히 그 생산과 소비가 증대되었다.

우리나라에서도 Bifidobacterium은 80년대 후반에 처음으로 소개되기 시작하여 주로 요구르트와 우유, 생균제제등에 사용되고 있으며, 그 소비량이 매년 크게 증가하고 있으나, 아직 우리나라는 Bifidobacterium의 배양에 대한 연구의 부족으로 종균을 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다.

지금까지 주로 이용되어온 유산균들이 D(-)-form과 L(+)-form의 lactic acid를 생성하거나 D(-)-form만의 lactic acid를 생성하는데 반해, Bifidobacterium은 L(+)-form의 lactic acid만을 생성하는 유산균이다.

Bifidobacterium은 혐기성 미생물이기 때문에 배양시 배지내의 산소 분압을 떨어뜨리기 위한 혐기 배양 장치가 필요하다. Bifidobacterium은 배지내에 산소가 있을 때, 세포 내에 생성되는 과산화수소를 분해하는 효소인 카탈라제(catalase)가 없어서, 생성되는 과산화수소에 의해 생장이 저해를 받게 된다. 지금까지는 혐기성균의 배양을 위해 이산화탄소나 질소 가스를 배지에 공급(sparging)해 주거나, 가스 팩(gas pack)등을 이용하는 방법 등으로 해결해 왔으나, 산업적으로 대량 생산할 경우에는 그 장치 또한 대형화 되어야 한다는 문제점이 있다.

또 Bifidobacterium의 생육 적온은 37 ∼ 43℃이며, 생육 최적 pH는 6.5 ∼ 7.0이고 pH 5.0 이하와 pH 8.0 이상에서는 거의 생장하지 못한다. 그런데 다른 유산균들과는 달리 Bifidobacterium은 자신이 생성한 산에 의해 조성되는 낮은 pH 환경에 생장이 크게 저해받기 때문에 배양시 문제점이 되고 있다. 균종마다 차이가 있으나 대개 pH 5.0 ∼ 4.5 이하에서 생장이 거의 멈추며, 급속히 사멸하게 된다. 그러므로 Bifidobacterium을 배양하기 위해서는 배지내의 pH를 일정수준 이하로 떨어지지 않게 하기 위한 여러가지 방법 예를 들면, 알칼리를 첨가하여 일정 pH를 유지시켜 주는 방법, 신선한 배지로 계속 치환해 주는 방법 등이 사용되고 있으나, 이 문제 또한 대량생산 체제에서는 여러가지 문제점이 있게 된다.

Bifidobacterium이 생균제제 및 낙농유제품의 종균 등에 사용되기 위해서는 무엇보다 고농도 배양의 확립이 대단히 중요한데 Bifidobacterium은 혐기성균인데다가 낮은 pH에서 쉽게 사멸하기 때문에 고농도 배양에 있어 여러가지의 문제점이 지적되어 왔다.

Bifidobacterium의 고농도 배양은 세라믹 필터 등을 이용한 막분리를 이용하여, 배양에 사용된 산이 많이 함유된 배지를 제거하면서 새로운 무산(acid-free) 배지를 첨가해주는 확산 배양(diffusion culture) 등이 실험실 단위에서 시도되고 있다. M. Taniguchi 등에 의한 실험에서는 Bifidobacterium을 연속 필터 시스템(filtration system)을 이용하여 Bifidobacterium longum을 연속배양 하였는데, 이 때 회분식 배양에서 보다 약 7 배의 총균수를 얻을 수 있었다고 보고하였다. 그러나 이 경우에는 pH를 6.0으로 일정하게 유지시키기 위해 NaOH를 계속적으로 첨가시켜 주었으며, 이 경우 배지내에 이온 강도(ionic strength)가 증가하게 되었다. 이러한 연속배양의 경우 배양액의 약 20배에 달하는 배지가 소모되었으며, 배양에 사용되지 않고 필터를 빠져나가는 당의 양도 대단히 많아 비효율적이었다(Insisar Husain, James A. Poupard, and Robert F. Norris. 1972,Influence of nutrition on the morphology of a strain of Bifidobacterium bifidum. Journal of Bacteriology. 111(3):841-844.

그 밖의 C. Corre 등에 의한 고농도 배양에서도 비슷한 결과가 보고되었으며, 결국 많은 양의 고가의 배지 낭비 문제, 배지내의 이온 강도의 증가에 의한 활력의 감소, 혐기 배양 및 연속 배양을 위한 고가의 장치의 필요 등이 개선해야할 점으로 보고 되고 있다(Geun- Eog Ji, Se-Kyoung Lee, and In-Hee Kim. 1994. Improved selective medium for isolation and enumeration of Bifidobacterium spp. Korean J. Food Sci. Technol. 26(50):526-531).

한편 혐기적 배양조건을 맞춰주기 위하여 지금까지는 N₂혹은 CO₂가스로 치환해 주거나 가스 팩 등을 이용하여 배양해 왔으나, 혐기 배양장치를 필요로 하는 등 산업적으로 이용되는데 매우 불리한 면이 있다. 그리고 배양액 내의 pH 변화에 따른 균의 생장 저해는, pH가 내려감에 따라 소디움 하이드록사이드(sodium hydroxide) 혹은 암모니움 하이드록사이드(ammonium hydroxide) 등을 계속적으로 첨가해 주는 pH-조절 배양(pH-controlled culture:chemostat)를 함으로써 해결하고는 있으나, 이 방법 역시 배지 내의 ionic strength를 계속적으로 증가시키기 때문에 균의 활력을 떨어뜨리는 등의 한계가 있어 왔다. 또한 Bifidobacterium의 배양 중에 발생하는 많은 양의 산을 제거해 주기 위하여 배양액의 일부를 계속적으로 무산 브로스(acid-free broth)로 치환해 주는 방법이나 반투과성막을 이용한 확산 배양(diffusion culture) 방법 등의 고농도 배양 방법이 있으나, 이러한 방법에는 원하는 정도의 총균수 농축효과를 얻기 위하여 배양액의 수십배에 달하는 배지가 필요하며, 공급해 주는 대부분의 당이 반투과성 막을 통해 빠져 나오게 되기 때문에 경제적인 면에 있어서도 많은 단점이 있다. 또한 한외여과장치 등의 막분리 장치가 부수적으로 필요하기 때문에 일반적인 Bifidobacterium을 배양하는 일반적인 방법이 되지 않고 있다.

[본 발명이 해결하려 하는 과제]

본 발명은 상기와 같은 종래의 Bifidobacterium의 고농도 배양에 있어서의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 자신이 생성되는 산에 의해 형성되는 낮은 pH 환경에서 생장하지 못하는 Bifidobacterium의 배양을 위한 새로운 버퍼 시스템을 제공하며, 아울러 혐기성 장치 없이 Bifidobacterium을 배양할 수 있는 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, Bifidobacterium이 생장할 수 있는 영양소와 칼슘 카보네이트를 포함하는 배지에 Bifidobacterium를 접종하여 배양하는 공정을 포함하는 Bifidobacterium 배양방법을 제공한다. 아울러 본 발명은 Bifidobacterium이 생장할 수 있는 영양소와 칼슘 카보네이트를 포함하는 Bifidobacterium 배양용 배지를 제공한다.

상기한 본 발명에 있어서, 칼슘 카보네이트는 고정화된 칼슘 카보네이트인 것이 바람직하며, 상기한 고정화는 반투막(Semi-permeable membrane) 고정방법, 켑슐화(capsulation) 고정방법, 코팅(coating) 고정방법, 패키지(package) 고정방법, 케이크(cake) 고정방법으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

그리고 상기한 고정화된 칼슘 카보네이트는 칼슘 카보네이트를 비드에 고정한 것이 더욱 바람직하며, 상기한 비드는 알긴산, 아가로스, 젤라틴, 콜라젠, 폴리우레탄, 폴리아크릴아미드, k-카라게난, 천연고무, 셀룰로오즈, 하이드로겔, 실리콘 고무, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 테플론, 다크론, 나일론, 덱스트론, 키토산, 에폭시 수지, 메타를리레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 제조한 것이 바람직하며, 상기한 비드의 첨가량은 10 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 상기한 영양소중 당 농도가 0.5 중량%일 때 20 중량%인 것이 바람직하다.

또 상기한 본 발명에 있어서, 상기한 영양소중 당 농도는 0.5 내지 2.5 중량%인 것이 바람직하다.

상기한 본 발명에 있어서, Bifidobacterium은 B. longum, B. breve, B. animalis, B. bifidum, B. infantis, B. adolescentis, B. angulatum, B. catenulatum. B. pseudocatenulatum, B. dentium, B. globosum, B. pseudolongum, B. cuniculi, B. choerinum, B. animalis, B. thermophilum, B. boum, B. magnum, B. pullorum, B. gallinarum, B. suis, B. subtile, B. minimum, B. coryneforme, B. asteroides, B. indicum, 또는 이들의 변종으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 Bifidobacterium 이외에도 Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactcs, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus faecalis, Lactobacillus sporogenes, Sterptococcus faecium에도 적용 가능하다.

[작 용]

칼슘 카보네이트는 수용액에 일반적으로 불용성인 중성의 완충물질로써 완충작용을 기작은 다음과 같다.

(1) 일반 기작

(2) 유기산의 수용액에서 분해

(3) 칼슘 염, CO₂, H₂O 생성에 의한 수소 이온의 제거

상기한 식에서 알 수 있는 바와 같이, 칼슘카보네이트는 Bifidobacterium의 배양중 생성되는 아세트산 및 락틱산(lactic acid)와 반응하여 칼슘염들과 이산화탄소 및 물을 생성한다. 반응 중에 생성되는 칼슘염들은 칼슘 락테이트(calcium lactate), 칼슘 아세테이트(calcium acetate), 및 칼슘 락테이트-아세테이트(calcium lactate-acetate)로서, 동결건조시의 냉해보호제 등으로 사용되는 인체에 무해한 물질이며, 수용성이므로 배양액의 탁도를 유발하지 않는다. 그리고 부반응으로 생성되는 이산화탄소는 배양액 주의 산소 분압을 떨어뜨려 배양액을 혐기환경으로 만들어줌으로써, 혐기성 미생물인 Bifidobacterium이 생장하기에 적당한 환경을 제공한다. 또한 Bifidobacterium은 이산화탄소를 탄소원으로 이용할 수 있으며, 과량으로 생성된 이산화탄소는 일정 분압이상이 되면 가스의 형태로 배출되며 이러한 반응은 비가역적으로 일어난다.

이에 따라 배양액 내의 수소이온이 계속적으로 감소하여 배양액의 pH가 떨어지는 것을 억제하게 되며, 이온 강도의 증가 또한 억제된다. 그리고 이때 부반응으로 발생되는 이산화탄소는 배양액 내에 녹아들어가게 되어, 배양액 내의 산소분압을 떨어뜨리게 된다. 이는 혐기성 미생물인 Bifidobacterium의 생장에 유리한 환경을 제공하여 특별한 혐기 배양장치를 필요로 하지 않는다. 그리고 칼슘 카보네이트는 일반적으로 수용액에서 불용성이므로 배양액에 첨가될 때, 균생장의 척도인 탁도 즉, 흡광도의 변화를 유발시키게 되며, 분말 형태로 칼슘 카보네이트가 배양액에 첨가되면 배양액의 pH를 급격히 증가시킬 수 있다. 본 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위하여 칼슘 카보네이트를 알긴산 등으로 고정화시킨 칼슘 카보네이트 비드를 제조하여 사용할 수 있으며, 알기네이트 비드(alginate bead)를 이용하여 칼슘 카보네이트를 공급할 경우 OD에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라, 비드 형태이므로 이후에 균을 분리하는 과정에서 버퍼 물질과 쉽게 분리가 가능하며, 회수하여 재사용될 수도 있다.

이에 따라 본 발명의 칼슘 카보네이트 버퍼 시스템을 이용하여 혐기성 미생물이며 스스로 생성한 산에 의하여 생장이 저해되는 Bifidobacterium을 배양할 경우 혐기성 조건을 생성하기 위하여 별도의 장치가 필요 없으며 스스로 생성한 산에 의한 생장 억제 없이 고농도로 Bifidobacterium을 배양할 수 있으며, 고정화된 칼슘 카보네이트를 사용할 경우 OD 측정에도 유리할 뿐만 아니라 균의 회수에도 유리하다.

[바람직한 실시예]

Ⅰ 실험 재료 및 방법

1. 사용 균주

본 실험에는 인체의 장내에서 서식하는 Bifidobacterium longum(ATCC 15707)와 Bifidobacterium breve(ATCC 15700) 동물의 장내에 서식하는 Bifidobacterium animalis(ATCC 25527)을 사용하였으며, ATCC로부터 분양받아 사용하였다.

2. 배지 조성

배양에 사용된 배지의 조성은 하기와 같은 TPY 배지를 사용하였으며, 생장 특성의 변화를 조사하기 위한 조정된 TPY 배지(m TPY)는 농도와 칼슘 카보네이트 비드의 양을 변화시켰다. 당농도는 최초 TPY의 당농도인 0.5%의 2×(1.0%), 3×(1.5%), 4×(2.0%), 5×(2.5%), 10×(5%)를 첨가하여 실험하였고, 칼슘 카보네이트 비드의 양은 wet weight/volume으로 측정하여 첨가하였다.

3. 배양 조건

Bifidobacterium은 각각 TPY 배지에 2%(v/v)씩 접종한 후에 37℃ 인큐베이터에서 18시간 정치 배양하였으며 2회 계대 배양후 2%(v/v)씩 접종하였다. 계대배양과 생균수 측정시의 배지는 일반 TPY 배지와 TPY 아가배지를 사용하였다.

Bifidobacterium의 생장 특성 변화 실험은 한국발효기에서 구입한 자퍼멘터(jar fermenter)를 이용하여 실시하였다. 초기 작업 부피(working volume)는 1ℓ이고, 접종(inoculum) 양은 2%(v/v)이었으며, 배양온도는 37℃를 유지시켜 주었고, 임펠러(impeller)의 rpm은 200±10 을 유지시켜 주었다. 배양 배지로는 상기한 TPY 배지를 조정하여 사용하였고 칼슘 카보네이트 비드는 함수 중량(wet weight)으로 초기 작업 부피(working volume)의 30%를 첨가하였으며, 브로스(broth)에 N혹은 CO첨가없이(sparging) 없이 배양을 실시하였다.

4. 칼슘 카보네이트 비드의 제조

칼슘 카보네이트는 SPC사의 특급(special grade)을 사용하였고, 알긴산(alginic acid)은 Sigma사의 3,500 cp의 중간 점도(medi-viscosity)를 사용하였다. 먼저 알긴산 1.5%(w/v)를 증류수에 넣은 후, 직접 구동 교반봉(direct drive stirrer)을 이용하여 완전히 섞은 후, 여기에 칼슘 카보네이트 20%(w/v)를 첨가한 후 완전히 섞일 때까지 교반해 주었다. 완전히 섞인 콜로이드액을 마이크로 튜브 펌프(micro tube pump)를 사용하여 게이지-20-주사기(gage-20-syringe)를 통하여 200 mM 염화칼슘 용액으로 떨어뜨려 비드를 만든 후, 2시간 정도 스터링한 후에 증류수로 3회 세척해 주었다. 대략적인 비드 제조의 방법은 제1도에 도시하였다. 비드의 평균 지름은 2.5㎜였으며, 수화된 형태로 공급하였다.

5. 분석

접종 직후부터 2시간 간격으로 3㎖씩 샘플링하였으며, pH 측정은 Schott Gerate사의 pH 미터(model # CG 809)를 사용하였고, 흡광도는 PERKIN-ELMER사의 UV/VIS 스펙트로포토미터(model # Lambda 3B)를 사용하여 흡광도는 600㎚에서 OD가 0.5이하가 되도록 희석하여 측정하였다.

Bifidobacterium의 생균수는 측정된 흡광도에 의한 생장곡선이 정지기(stationary phase) 최후반부가 되었을 때 샘플링하여 연속 희석(serial dilution)을 한 후, TPY 아가 플레이트에 4개 이상 스프레딩한 후, 스프레딩된 플레이트를 건조기(descicator)에 넣고 진공펌프로 공기를 빼준 후 CO로 치환하여 대기압보다 약간 낮은 압력(ca 650 torr)을 유지시키면서 37℃ 인규베터에서 48시간 배양하여 콜로니가 생성된 후 생성된 콜로니의 수에 희석배수를 곱해서 나온 값의 평균을 내서 측정하였다.

Ⅱ. 실험 결과

1. 유기산과 칼슘 카보네이트 비드의 반응

TPY 배지에서 완충물질인 KHPO를 첨가하지 않은 m TPY 배지에 유기산을 이용하여 pH를 4.0으로 맞춰주고 칼슘 카보네이트 비드를 첨가하여 pH 증가 패턴을 확인하였다. 그 결과는 제2도의 (a), (b), (c)에 도시하였다. 제2도(a), (b), (c)는 각각 유기산으로 아세트산, 락틱 에시드, 그리고 아세트산과 락틱 에시드를 몰농도로 3:2의 비율 혼합한 혼합액을 사용하여 pH를 4.0으로 조정해 준 후 칼슘 카보네이트 비드의 첨가량을 변화시키면서 시간에 따른 pH의 변화를 측정한 결과이다.

아세트산을 1.6㎖/100㎖ 첨가하여 배지의 pH를 4.0으로 맞춰준 후 칼슘 카보네이트 비드를 함수 중량으로 10%, 20%, 30%, 40%, 50%를 첨가할 때 pH의 변화를 나타내는 제2도(a)는 많은 양의 거품, 즉 이산화탄소가 발생하면서 pH의 상승 효과가 나타났다. 30 중량% 이상의 칼슘 카보네이트 비드를 첨가해 준 경우 5분만에 pH가 5.0이상으로 상승하였다. 락틱 에시드를 8.0㎖/100㎖ 첨가하여 배지의 pH를 4.0으로 맞춰준 후 칼슘 카보네이트 비드를 함수 중량으로 10%, 20%, 30%, 40%, 50%를 첨가할 때 pH의 변화를 나타내는 제2도(b)는 10분후 40%이상의 비드를 첨가해 준 경우에 pH가 5.0이상이 되었다.

Bifidobacterium의 배양중 발생하는 유기산의 조합인 몰농도 3:2의 아세트산과 락틱 에시드의 혼합액을 2.4㎖/100㎖ 첨가하여 pH를 4.0으로 맞춰준 후 칼슘 카보네이트 비드를 함수 중량으로 10%, 20%, 30%, 40%, 50%를 첨가할 때 pH의 변화를 나타내는 제2도(c)는 약 5분 후에 20% 이상의 비드 첨가시 pH 5.0 이상으로 상승하는 결과가 나왔다. 이와 같은 결과로써 유기산이 함유된 용액에서 칼슘카보네이트가 pH를 상승시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 아울러 많은 양의 이산화탄소도 발생함을 확인할 수 있었다.

2. 일반 TPY 배지에서의 칼슘 카보네이트 비드의 첨가에 의한 Bifidobacte rium longum의 생장특성

약 20%의 비드를 함수 중량로 첨가한 TPY 배지에서의 B. longum의 생장곡선을 pH, OD, %TA등을 측정하여 대조구와 비교하였다. 대조구의 경우 배양액의 pH가 약 4.7까지 떨어지며 OD은 최고 2.0까지 도달하며, 적정산도는 약 0.8%까지 증가하는데 비해, 칼슘 카보네이트 비드를 첨가해 준 경우에는 생장속도가 최고일 때는 pH가 5.2까지 떨어졌다가 이후에 pH가 5.8정도를 유지함을 알 수 있었고, 이 때 OD의 값은 약 4.3까지 도달하였으며, 적정산도는 0.2% 정도를 넘지 않았다. 이 실험을 통하여 칼슘카보네이트 버퍼 시스템을 사용한 일반 TPY에서의 B. longum의 배양에서 OD, 즉 총균수에서 두배 이상의 효과가 생김을 알 수 있었다(제3도 참조)

3. 일반 TPY 배지에서의 칼슘카보네이트 비드의 첨가량에 따른 B. longum의 생장특성

칼슘 카보네이트 비드를 함수 중량으로 10%, 20%, 30%, 40%, 50%로 달리하여 첨가해 주고 버퍼 물질인 KHPO를 빼준 m TPY에서의 B. longum의 생장특성을 조사하였으며, 일반 TPY에서의 대조구와 비교하였다.

일반 TPY에서는 약 접종후 16시간 후에 pH가 4.7이하로 떨어졌으며 OD은 2.22까지 도달하였다. 그리고 적정산도는 0.8% 이상까지 산이 생성됨을 알수 있었다. 10%의 칼슘카보네이트 비드를 첨가하고 배양해 주었을 때 pH는 5.2 이상으로 유지되었으며, 흡광도는 3.64까지 도달하였다. 비드를 20% 첨가해주었을 때는 대수기(log phase)에서 pH 5.18까지 떨어진 후에 pH 5.7이상이 계속 유지되었으며, OD은 5.80까지 도달하였다. 30%의 칼슘카보네이트 비드를 첨가해 주었을 때는 pH가 5.38까지 떨어진 후에 5.9이상을 유지하였고 OD은 5.81까지 도달하였다. 그리고 50%의 칼슘카보네이트 비드를 첨가해 준 경우에는 pH가 5.67까지 떨어졌다가 이후 pH 6.0이상을 유지시켜 줌을 알 수 있었으며, OD는 5.02까지 증가한 후 완만히 감소함을 알 수 있었다.(제4도 및 제5도 참조).

상기한 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 당농도가 0.5%인 일반 TPY배지에서는 칼슘카보네이트 비드 첨가량이 20%정도가 적당함을 알 수 있었으며, 배양액의 pH를 5.7∼5.8정도로 유지시켜 줄 때 총균수가 최고가 됨을 알 수 있었다.

4. 칼슘 카보네이트를 30% 첨가해 준 TPY 배지에서 당농도에 따른 B. longum의 생장 특성의 변화

일반 TPY 배지에 기존의 완충 물질인 KHPO를 빼주고, 칼슘 카보네이트 비드를 함수 중량으로 30%를 첨가한 후 B. longum의 생장 특성을 조사하였으며, 대조구와 비교하였다. 당 농도는 일반 TPY 배지의 당 농도인 0.5%의 2배, 3배, 4배, 5배, 10배로 첨가하였다.

1.0%(2×) 포도당을 첨가한 TPY에서 B. longum을 배양한 결과, 대다수가 약 6시간동안 지속되어 OD은 6.14까지 도달하였고, pH는 5.55이상에서 완만히 올라가는 패턴이었으며, 적정 산도는 0.44%까지 증가한 후 완만히 감소하는 패턴이었다.(제6도 참조).

1.5%(3×) 포도당을 첨가한 경우는 OD이 10.44까지 증가하였으며, pH는 정지기에서 pH 5.4이상을 유지하며 서서히 증가하는 패턴이 생겼으며, 적정 산도는 0.36%까지 증가한 이후에 지속적으로 감소하였으며, 대수기 지속 시간은 약 6∼7시간이었다.(제7도 참조).

2.0%(4×)의 포도당을 첨가해 주었을때는 log phase가 8∼9시간 동안 지속되면서, pH는 5.25까지 떨어졌다가 점차 완만히 증가하는 패턴이 생겼으며, OD는 11.42까지 증가하였고, 적정 산도는 0.44%까지 증가하다가 서서히 감소하였다.(제8또 참조).

2.5%(5×)의 포도당을 첨가해 주었을 때는 대수기가 약 10시간 동안 지속이 되며, OD이 16.0 정도까지 증가함을 알수 있었고, pH는 5.00까지 떨어졌다가 이후 5.3이상을 유지하며 증가하였고, 적정 산도는 0.56%까지 증가한 후에 감소하였으며, 적정 산도는 0.55%까지 증가한후 감소하였다(제9도). 포도당을 5.0%(10×) 첨가해 준 경우는 생장속도는 느리지만 대수기 지속 시간이 약 12시간이었으며, OD는 16.5까지 도달하였고 pH의 급격한 강하없이 5.3이상으로 유지되었고, 적정 산도는 0.7%까지 서서히 증가하는 양상을 보였다.(제10도.) 5% 포도당을 첨가해 준 경우 급격한 pH의 강화양상이 보이지 않았던 이유는 생장속도가 느려서 산 생성속도가 느리기 때문에 칼슘카보네이트 비드와의 반응을 충분히 할 수 있었기 때문으로 사료된다. 당농도가 증가할수록 버퍼링 능력(buffering capacity)은 증가하였고, OD역시 증가하는 양상을 보였으나, 당농도가 2.5%이상에서는 그 증가정도가 둔화됨을 알 수 있었으며, 이는 당농도의 증가에 따른 배지의 이온 강도 증가와 다른 영양성분의 고갈 때문인 것으로 사료된다. 2.5% 글루코즈를 첨가한 TPY 배지에서 생장율(growth rate)이 최고에 도달했을때 연속 희석(serial dilution)을 이용하여 생균수를 측정한 결과는 평균 1.54×10 CFU/㎖였다.

5. pH-조절 배양과의 비교 실험

종래의 방법에 따라, 2M NaOH를 이용하여 배양액의 pH를 6.0으로 맞춰주면서 Bifidobacterium의 배양을 실시하여 그 결과를 하기한 (표 1)에 나타내었다. 일반 TPY(0.5% glucose)에서 B. longum을 배양하면서 pH가 6.0이하로 떨어지지 않도록 pH 조절 배양(pH-controlled culture)을 한 결과 적정 산도는 0.28%로 유지되었으며, 600 ㎚에서의 OD값은 4.85까지 도달하였다.

일반 TPY 배지에서 20%의 칼슘 카보네이트를 첨가해 주었을때 OD의 값이 5.8정도에 도달한 것과 비교해서 NaOH의 첨가에 의한 이온 강도의 증가가 Bifidobacterium의 생장에 저해를 가져왔음을 알 수 있었다.

6. B. longum, B. breve, B. animalis의 배양

2.5% 글루코즈(5×)를 첨가한 m TPY에서 B. longum ATCC 15707, B. breve ATCC 15700, B. animalis ATCC 25527을 pH-조절 배양과 칼슘카보네이트 비드를 함수 중량으로 30%를 첨가했을 때의 배양을 실시하여 그 결과를 하기한 (표 2)에 나타내었다. B. longum ATCC 15707의 경우 pH 6.0으로 조절해준 배양 결과 600㎚의 흡광도에서 OD가 11.25에 도달하였으며 칼슘카보네이트를 첨가해 준 경우는 OD이 14.05까지 도달하였다. B. breve ATCC 15700의 경우는 pH 6.0으로 조절해 준 경우 OD이 10.86에 도달하였고, 칼슘카보네이트 버퍼 시스템의 경우는 OD이 13.64에 도달하였다. B. animalis ATCC 25527의 배양에서는 pH 6.0-조절 배양의 경우 OD이 11.30에 도달하였으며 칼슘 카보네이트 버퍼 시스템의 경우는 14. 61까지 OD이 증가함을 보여서, 혐기성이며 생장중에 많은 양의 산을 생성하고, 산에 생장이 크게 저해를 받는 Bifidobacterium의 배양에 칼슘 카보네이트 버퍼 시스템이 적당한 방법임을 알 수 있었다.

[효 과]

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 칼슘 카보네이트를 이용한 새로운 버퍼 시스템으로 채택하여 유기산을 생성하는 혐기성 균주인 Bifidobacterium을 배양할 경우, 배지에 첨가하는 칼슘카보네이트의 양을 조절함으로써 배지내의 pH를 특정 pH로 지속적으로 유지시킬 수 있으며, 혐기 배양 장치 없이도 산과의 반응 중 발생하는 이산화탄소에 의해 혐기상태를 유지시킬 수 있어, Bifidobacterium를 고농도로 배양할 수 있다.

그리고 칼슘 카보네이트는 비드의 형태로 첨가하는 것이 바람직하며, 비드를 첨가한 배지에서의 Bifidobacterium의 생장은 첨가해주는 당의 %가 증가할 수록 Bifidobacterium의 배양시 대수기의 지속시간이 길어지며, 2.5%의 포도당을 첨가한 TPY 배지에 칼슘카보네이트 비드를 30% 첨가했을 때, 흡광도가 파장 600㎚에서 약 16정도에 도달하고, 생균수는 1.54×10 CFU/㎖로 고농도 배양이 가능하다.

즉 pH를 6.0으로 조절하여 여러 종류의 Bifidobacterium을 배양한 결과, 칼슘카보네이트 버퍼 시스템이 종래의 버퍼 시스템보다 더 유용하였으며, 이는 배지의 이온 강도 증가에 따른 Bifidobacterium의 생장 저해 방지 때문인 것으로 사료된다.

Claims (3)

1. 비피도박테리움(Bifidobacterium)이 생장할 수 있는 영양소와 비드에 고정시킨 칼슘 카보네이트를 포함하는 배지에 비피도박테리움을 접종하여 배양하는 공정을 포함하는 비피도박테리움 배양 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 비드는 알긴산, 아가로스, 젤라틴, 콜라젠, 폴리우레탄, 폴리아크릴아미드, k-카라게난, 천연고무, 셀룰로오즈, 하이드로겔, 실리콘 고무, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 테플론, 다크론, 나일론, 덱스트론, 키토산, 에폭시 수지, 메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 제조된 비드인 비피도박테리움 배양 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 비드의 첨가량은 상기 배지의 10-50중량%인 비피도박테리움 배양 방법.