RU2224018C2

RU2224018C2 - Способ получения биологического стимулятора

Info

Publication number: RU2224018C2
Application number: RU2001131538/13A
Authority: RU
Inventors: ев В.А. Несчисл; В.А. Несчисляев; Л.П. Чистохина
Priority date: 2001-11-21
Filing date: 2001-11-21
Publication date: 2004-02-20

Abstract

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов. Способ получения биологического стимулятора с пробиотическим иммуномодулирующим действием предусматривает непосредственное концентрирование бактериальной взвеси культуры микроорганизма ультрафильтрацией и стабилизацию ультрафильтрата путем термической обработки при 80-110^oС в течение 15-30 мин. Предложенный способ позволяет одновременно получать концентрат бактериальной взвеси для производства лекарственных форм пробиотика на основе живых микрорганизмов и бесклеточный биологический стимулятор с широким спектром действия in vivo (профилактика и лечение дисбактериозов и иммунодефицитных состояний) и in vitro (стимулирующая добавка к питательным средам). 2 табл.

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве пробиотических препаратов.

Микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности продуцируют целый ряд биологически активных соединений. Экзометаболиты лакто- и бифидобактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры человека, оказывают положительное влияние на бактериальный биоценоз, работу желудочно-кишечного тракта, обмен веществ и иммунную систему макроорганизма [1]. Эти свойства биологически активных соединений бактериального происхождения используют путем изготовления продуктов и препаратов, содержащих жизнеспособные клетки и их экзометаболиты или на основе последних.

Известен способ получения пептидной фракции кумыса, обладающей иммуностимулирующим действием, путем центрифугирования исходного продукта с последующим хроматографированием на геле надосадочной жидкости с элюцией 0,9% раствором натрия хлорида и вакуумным упариванием конечного продукта [2]. Известен также способ получения аутоактиватора роста для культивирования кишечных палочек, включающий инкубирование бактерий в дистиллированной воде в течение 5-9 сут, отделение клеточной биомассы центрифугированием, фильтрацию надосадочной жидкости и лиофильную сушку фильтрата [3]. Указанные способы характеризуются высокой трудоемкостью, многостадийностью и большой продолжительностью процесса получения конечного продукта, а также нерациональным использованием исходного сырья (продуктов), которое после извлечения метаболитов бактерий фактически является отходом производства.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения стимулятора роста бактериальной культуры, представляющего собой комплекс низкомолекулярных экзометаболитов бактерий [4]. Процесс приготовления препарата включает культивирование бактерий в благоприятных или неблагоприятных условиях с последующим отделением биомассы и ультрафильтрацией культуральной жидкости. Стабилизируют препарат лиофильным высушиванием. Недостатком прототипа является многостадийность получения конечного продукта, включающая дополнительную операцию центрифугирования для отделения биомассы от культуральной жидкости, а также дорогостоящий и длительный способ стабилизации препарата.

С целью устранения указанных недостатков предлагается способ получения стимулятора, обладающего широким спектром биологической активности, включая иммуномодулирующее и пробиотическое (бактериостимулирующее) действие.

Сущность изобретения заключается в следующем. Бактериальную взвесь культуры микроорганизма, полученную путем глубинного культивирования, сразу, исключая предварительное отделение клеточной биомассы, подвергают ультрафильтрации на разделительных аппаратах для выделения экзометаболитов. Экзометаболиты получают из сгущаемой бактериальной взвеси, которую используют для изготовления лекарственных форм пробиотиков. Указанный процесс является безотходным и позволяет получать два самостоятельных продукта: жидкий бесклеточный ультрафильтрат и жидкий концентрат бактериальной взвеси. Ультрафильтрат, содержащий экзометаболиты бактерий, стабилизируют термической обработкой при температуре 80-110^oС в течение 15-30 мин. Данная термическая обработка в указанных условиях способствует сохранению и повышению биологической активности получаемого препарата, обладающего пробиотическим и иммуномодулирующим действием (табл.1). Для получения биологического стимулятора можно использовать различные микроорганизмы, например штаммы лакто- и бифидобактерий, используемые в производстве пробиотиков (Lactobacillus plantarum 8Р-А3, L.fermentum 90T-C4, L.acidophilus K₃Ш₂₄, L.acidophilus NK₁, L.acidophilus 100 АШ, Bifidobacterium bifidum 1, B. bifidum 791, B. adolescentis MC-42). Биологические стимуляторы, полученные из различных штаммов бактерий, соответственно различаются по биологической активности. Проведенные исследования свидетельствуют, что биологический стимулятор, полученный на основе штамма L. plantarum 8Р-А3, используемого в производстве лактобактерина, превосходит по пробиотическому действию аналогичные препараты, изготовленные с применением других штаммов лакто- и бифидобактерий (табл.2).

Достигаемый технический результат заключается в разработке комплексной безотходной технологии препаратов на основе культур микроорганизмов, включающей экономичный и простой способ получения бесклеточного стабилизированного биологического стимулятора.

Способ осуществляют следующим образом.

Бактериальную взвесь получают путем глубинного культивирования производственного штамма бактерий на регламентированных питательных средах. Культивирование ведут до окончания фазы логарифмического роста культуры. Содержание колониеобразующих клеток в бактериальной взвеси должно составлять не менее 10⁹ в мл, чтобы обеспечить максимальное содержание биологически активных веществ (экзометаболитов). Бактериальную взвесь подвергают ультрафильтрации с использованием разделительных аппаратов (на полых волокнах ВПУ-15, на мембранах из триацетат целлюлозы 145 или полисульфона 146 и др.), получая ультрафильтрат в количестве 50-75% от первоначального объема взвеси. Концентрат живых бактерий используют для производства различных лекарственных форм пробиотиков (лактобактерина, бифидумбактерина и др.). Полученный ультрафильтрат стабилизируют путем термической обработки при 80-110^oС в течение 15-30 мин. Температура менее 80^oС и время обработки менее 15 мин не вызывает выраженного повышения биологической активности, а обработка при температуре более 110^oС и более 30 мин приводит к снижению биологической активности ультрафильтрата. Полученный по данной технологии препарат стабилен не менее двух лет.

Пример 1. Бактериальную взвесь штамма L. plantarum 8P-A3 получают путем культивирования в реакторе при температуре 37^oС с применением казеиново-дрожжевой среды и добавления растворов аммиака и глюкозы. Доза посевного материала составляет (10,0±2,5)% от объема питательной среды. В процессе выращивания поддерживают рН в пределах 5,5-6,0. Культивирование ведут в течение 7-8 ч до окончания фазы логарифмического роста культуры. Бактериальную взвесь, содержащую не менее 5•10⁹ КОЕ/мл, концентрируют в 3 раза методом ультрафильтрации с использованием разделительных аппаратов на полых волокнах ВПУ-15. Полученный ультрафильтрат разливают во флаконы по 10 мл и герметично укупоривают. Флаконы с препаратом выдерживают в сушильно-стерилизационном шкафу при 80^oС в течение 30 мин.

Пример 2. Бактериальную взвесь штамма L. fermentum 90T-C4, приготовленную как описано в примере 1, концентрируют в 2 раза методом ультрафильтрации с использованием разделительных аппаратов на мембранах из триацетат целлюлозы 145 (10 кДа). Полученный ультрафильтрат разливают во флаконы по 100 мл и герметично укупоривают. Флаконы с препаратом подвергают обработке текучим паром при 100^oС в течение 20 мин.

Пример 3. Бактериальную взвесь штамма В. bifidum 1 получают путем культивирования в реакторе при температуре 38^oС с применением казеиново-дрожжевой среды и добавления растворов аммиака и глюкозы. Доза посевного материала составляет (10,0+2,5)% от объема питательной среды. Культивирование ведут в течение 22-24 ч до окончания фазы логарифмического роста культуры. Бактериальную взвесь, содержащую не менее 10⁹ КОЕ/мл, концентрируют в 4 раза методом ультрафильтрации с использованием разделительных аппаратов на мембранах из полисульфона 146 (20 кДа). Емкость с ультрафильтратом подвергают автоклавированию при 110^oС в течение 15 мин. Полученный стерильный препарат разливают в ампулы по 3 мл и запаивают.

Предложенный способ позволяет одновременно получать концентрат бактериальной взвеси для производства лекарственных форм пробиотиков на основе живых микроорганизмов и бесклеточный биологический стимулятор с широким спектром действия in vivo (профилактика и лечение дисбактериозов и иммунодефицитных состояний) и in vitro (стимулирующая добавка к питательным средам).

Источники информации
1. Шендеров Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание. Том 1. Микрофлора человека и животных и ее функции. - Москва, 1998. - С. 110-142.

2. Авторское свидетельство СССР 1295557, опубл. 30.03.89 г., бюл. 12.

3. Авторское свидетельство СССР 1638156, опубл. 30.03.91 г., бюл. 12.

4. Патент RU 2090612, опубл. 20.09.97 г., бюл. 26.

Claims

Способ получения биологического стимулятора с пробиотическим и иммуномодулирующим действием, предусматривающий приготовление бактериальной взвеси культуры микроорганизма, ультрафильтрацию взвеси с последующей стабилизацией ультрафильтрата, отличающийся тем, что ультрафильтрации подвергают непосредственно бактериальную взвесь культуры микроорганизма с получением ультрафильтрата в количестве 50-75% от первоначального объема взвеси, стабилизируют полученный ультрафильтрат путем термической обработки при 80-110°С в течение 15-30 мин.