WO2005097972A1

WO2005097972A1 - 乳酸菌培地

Info

Publication number: WO2005097972A1
Application number: PCT/JP2005/004812
Authority: WO
Inventors: Takatoshi Itoh; Tetsuya Masuda
Original assignee: Nihon University; Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2005-10-20
Also published as: JP4780565B2; TW200533743A; JPWO2005097972A1

Abstract

　本発明は、MRS培地に変わり得る安価かつ安全な乳酸菌培地の提供を課題とする。　ホエーを原料とした乳酸菌を効率よく培養できる培地は、ホエーを用い、さらに培地の窒素源を強化することを特徴とする。さらに詳しくは窒素源として、酵母エキス及び/又はホエーやカゼインの酵素分解物を用いることにより、窒素源としての酵母エキス及び/又は蛋白質分解物の含量を強化することを特徴とする。また、添加成分を認可されている食品添加物のみとすることで、安価かつ安全な培地を得ることを特徴とする。

Description

明細書

乳酸菌培地

技術分野

[0001] 本発明はチーズ製造やカゼイン製造の副産物として産出されるホエーを含有する乳酸菌培地に関する。さらに詳しくは窒素源を強化したホエーを含有することを特徴とする乳酸菌培地に関する。

背景技術

[0002] チーズ製造やカゼイン製造の副産物として産出されるホエーは、乳糖、水溶性蛋白質、無機質、有機酸、水溶性ビタミン等を含む栄養価の高い物質である。ホェ一は、濃縮ホエーゃホエーパウダーとして製菓材料や乳糖の原料に利用されるほ力健康食品、美容品等へも利用されている。しかし、これらは多量に産出されるホエーの一部でしかなぐ多くは使途に困っている状況にある。

[0003] 一方、近年、食品は栄養的な価値だけでなぐ健康効果も求められるようになってきている。そのような中で、生きたまま腸管に到達し、有益な作用をもたらすプロバイオテイク乳酸菌が注目されて、る。

プロバイオテイク乳酸菌の一つとして知られるし acidophilusグループ (L.acidophilus, L.gassen, L.amyiovorus, L.cnspatus, L.gallinarum,そし飞 L.johnsoniiの 6菌種)のつちヒト腸管由来の菌株はその成育に強い嫌気条件を必要とせず、生菌の生存性も高いこと力ら、利用価値が高い。しかしながらし acidophilusグループは一般に乳中での増殖が緩慢なため、例えばヨーグルト等の製品に用いる場合、ヨーグルト等の製品とは別の培地で増殖させて、その菌を製品に添加する方法がとられることが多い。

[0004] これらの乳酸菌の培養には、市販の MRS培地が用いられる力この培地は非常に高価（lkgあたり 30,000円以上)なため、工業的に利用することは難しい。そこで、 MRS 培地に変わる安価で優れた培地が望まれて、る。

ホェ一は栄養価が高ぐ安価である。また乳力得られる成分であるため安全な食品原料として利用できる。従って、廃棄されているホエーを有効に利用して、 MRS培地に変わり得る乳酸菌培地を得ることができれば、安価で工業的に利用可能な培地を得ることができる。

[0005] 乳酸菌等の微生物の培地としてホエーを用いた例としては、ホエーに酵母エキスを加えた培地を用いた乳酸菌の培養装置 (特許文献 1)や、スイートホエーと酵母抽出物、カゼイン加水分解物等を混合した培地を用い、ゥレアーゼ陰性菌を増殖させることで動物排泄物からの臭気発生を抑制するペットリタ一 (特許文献 2)等があげられる力これらはいずれも乳酸菌の培養率等についての記載はしておらず、 MRS培地に変わりうるホエーを原料とした乳酸菌培地を得るには至っていない。

特許文献 1：特開平 6— 253816

特許文献 2：特表平 10 - 507358

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明が解決しょうとする課題は、安価かつ安全な乳酸菌培地の提供に関する。さらに詳しくは、ホエーを原料として、 MRS培地に変わり得る乳酸菌培地を提供することに関する。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、ホエーを乳酸菌培地の原料として有効に利用するために、ホエーが元力も有する栄養源にカ卩え、培地の窒素源を強化することで、乳酸菌を効率よく培養できる培地を得ることができることを見出した。また、さらに添加成分を認可されている食品添加物に代替することにより、人体に安全な成分のみ力もなる培地を得ることができることを見出した。

ここで得られた安価かつ安全な培地により、乳酸菌を大量に培養することが可能となるだけでなぐこの培地によって培養される乳酸菌を用い、食品、医薬等の開発や製造が可能となることから、工業的に価値の高い培地が得られる。

[0008] 本発明の培地はホエーが元力有する栄養源に加え、培地の窒素源を強化することを特徴とする。本発明で窒素源を強化したホエーとは、ホエー自体を酵素分解することによりホエーの窒素源を強化することと、窒素源となる物質を添加することとの両方を意味する。

さらに詳しくは窒素源として、酵母エキス及び/又はホエーやカゼインの酵素分解物を含有せしめることにより、培地の窒素源を強化することを特徴とする。また、添加成分を認可されてヽる食品添加物のみとすることで、安価かつ安全な培地を得ることを特徴とする。

すなわち、本発明は次の（1)一 (13)のいずれかの培地およびそれを用いた培養方法に関する。

(1) 窒素源を強化したホエーを含有することを特徴とする培地。

(2) 窒素源の強化が酵母エキス及び/又は蛋白質酵素分解物の含有によるものである (1)に記載の培地。

(3) 窒素源の強化が酵素分解ホエーの含有によるものである (2)に記載の培地。

(4) 窒素源の強化がカゼイン酵素分解物の含有によるものである (2)に記載の培地

(5) 酵素分解ホエー又はカゼイン酵素分解物がプロテアーゼで分解されたものである（3) 又は (4)のいずれかに記載の培地。

(6) プロテアーゼがプロテアーゼ Pである（5)に記載の培地。

(7) さらにグルコース及びォレイン酸化合物を含有する（1)一 (6)のいずれかに記載の培地。

(8) ォレイン酸化合物力 Tween80、ォレイン酸ナトリウム、ショ糖ォレイン酸エステル、グリセリンォレエートである（1)一 (7)の、ずれかに記載の培地。

(9) 成分が全て認可された食品添加物からなる（1)一 (8)のいずれかに記載の培地。

(10) (1)一（9)のいずれかに記載の培地を用いて乳酸菌を培養する方法。

1) 孚し酸！ ¾力し. acidophilus、 L.gassen、 L.amylovorus、 L.cnspatus、 L.helveticus、 L.rhamnosus、 L.casei、 L.bulgaricus等の乳酸桿菌である（10)に記載の培養方法。

(12) (9)一（11)のいずれかの方法で培養された乳酸菌を用いる食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬の製造方法。

(13) 製造する食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬がョーグルト、チーズ、乳酸菌を含有する錠剤である（12)に記載の方法。

発明の効果 [0010] 本発明の培地は、ホエー及び認可されている食品添加物を原料として用いることにより、安価かつ安全に乳酸菌を大量に培養することを可能とするだけでなぐこの培地によって培養される乳酸菌を用い、食品、医薬等の開発や製造を可能とし、工業的かつ経済的に効果が高い。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 1)

[図 2]酵素反応時間の違いによる酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 1)

[図 3]カゼイン酵素分解物の添加量の違いによるカゼイン酵素分解物添加培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 2)

[図 4]種々の供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 2)

[図 5]種々のォレイン酸ィ匕合物を添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 3)

[図 6]種々のォレイン酸ィ匕合物を添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 3)

[図 7]培地用又は食品用の酵母エキスを添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 3)

[図 8]培地用又は食品用の酵母エキスを添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 3)

[図 9]培地用又は食品用の酵母エキスを添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 3)

[図 10]酵母エキスの違い及び添加量の違いによるホエー培地の種々の供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 3)

[図 11]各種培地における供試菌の生育性を乾燥菌体重量で示した図である。（試験例 4)

[図 12]ジャーフアーメンター及びインキュベーターで培養した時の供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例 4) 発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明の培地の調製にあたり、ホエーが元力も有する栄養源に加え、酵母エキス及び/又は蛋白質酵素分解物により、培地中の窒素源を高めることを特徴とする。蛋白質酵素分解物としては、ホエーを酵素分解して、ホエー由来の蛋白質分解物の含有率を高めた酵素分解ホエーや、カゼインを酵素分解して得られたカゼイン酵素分解物等が挙げられる。

窒素源の強化にあたり、培地に含まれる酵母エキスの濃度は、培養する乳酸菌に有効な量であれば特に限定されないが、 0.3%以上であることが好ましぐ高い生育促進効果を得るためには、 0.6%以上、さらに 0.9%以上であることが好ましい。

[0013] また、本発明の培地を調製するために、ホエー及びカゼインを酵素分解するとき〖こは、食品添加物として認可されて、るプロテアーゼであれば、ずれも用いることができる力例えばプロテアーゼ Pを用、ることができる。

また、酵母エキスは食品用に巿販されて、るものであれば、ずれも用いることができるが、例えば酵母エキス協和 C、酵母エキス協和 H、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 W、酵母エキス武田 HR、酵母エキス武田 Sl^-W、酵母エキス JT-21A等の酵母ェキスを用いることができる。

ォレイン酸化合物として Tween80は食品添加物として認可されて!、な!/、ので、認可されてヽる食品添加物である例えばォレイン酸ナトリウム、ショ糖ォレイン酸エステル、デカグリセリンモノォレエート及びその他のォレイン酸のグリセリンエステル（グリセリンォレート）等を Tween80の代替物として用いることがより好まし!/、。これらの成分を用いることにより、安価かつ安全な培地を提供することができる。

本発明の培地には、さらに、必要に応じて MgSO 、 MnSO 、 K ΗΡΟ 、（ΝΗ ) C Η Ο

4 4 2 4 4 3 6 5 7

、 NaC Η Ο等もカロ免ることができる。

2 3 2

[0014] 本発明の培地の調製にあたり、原料となるホェ一力除蛋白質を行う方法としては、加熱によって蛋白質を凝固除去する以外に、限外濾過法によって除去する方法を用いることもできる。これにより清澄な培地を調製することができる。

[0015] [参考例 1]

本発明の乳酸菌培地にぉ、て比較に用いた MRS培地の組成及び調製方法を参考例として次に示す。

[0016] MRS培地の調製

26gの MRS粉末 (M.R.S.BROTH;ォキソイド社製）に蒸留水 500mlをカ卩ぇ 60°Cで加温溶解後、 IN- NaOHを用いて pHを 6.5に調整して滅菌（121°C、 15min)した。 MRS培地の組成を表 1に示した。

[0017] [表 1]

MRS培地（0X0 I D) 組成

成分

ペプトン 1 . 0

肉エキス粉末 0. B

酵母エキス 0. 4

グルコースく GeH Os) 2. 0

Tween80 0. 1

リン酸カリウム <K2HP04> 0. 2

酢酸ナトリゥム三水和物 (NaGHsCOO■ 3Η2θ) 0. 5

クェン酸三アンモニゥ厶く（NhU HCeH O⁷) 0. 2

硫酸マグネシウム七水和物く MgS04■ 7Hz0> 0. 02

硫酸マンガン四水和物く MnS04 ' 4H20〉 0. 05

[0018] 本発明の乳酸菌培地及びこの培地を用いた乳酸菌を培養する方法を以下の実施例で示す。

実施例 1

[0019] 酵素分解ホエー培地の製

1)酵素分解ホエー溶液

125gのチーズホエーパウダーに 375mlの蒸留水を加え溶解し、 0.6gのプロテアーゼ P「ァマノ 3G」（天野ェンザィム株式会社)を加え（蛋白質:プロテアーゼ P=25 : l)、攪拌しながら 37°Cで反応させた。酵素反応の時間は、 2時間と 6時間の 2つの条件で行つた。反応後、オートクレープで加熱（110°C、 15min)し、酵素の失活及び蛋白質を凝固させた。冷却後、溶液を遠心分離 (8000rpm、 5°C、 15min)し、上清を濾紙 (No.131 、 90mm)を二枚重ねにして吸引濾過をした。

2)酵素分解ホエー培地酵素分解ホエー溶液に蒸留水を加えて、 3.5倍（固形分約 7%)に希釈し、 lN-NaOHを用いて pHを 6.5に調整した。その後培地成分をそれぞれ添カ卩し、オートクレーブで加熱滅菌（115°C、 15min)を行った。調製した培地の組成を表 2に示した。

[表 2] 酵素分解ホエー培地の組成 (％)

カゼイン酵素分解物グルコ一 Tween 80 培地用丫 east

ス extract

2時間酵素分解ホエー培地 0.0 1.0 0.1 0.3

カゼイン酵素分解物無添加

2時間酵素分解ホエー培地 0.3 1.0 0.1 0.3

カゼイン酵素分解物添加

6時間酵素分解ホエー培地 0.0 1.0 0.1 0.3

カゼイン酵素分解物無添加

6時間酵素分解ホエー培地 0.3 1 .0 0.1 0.3

カゼイン酵素分解物添加

実施例 2

[0021] 1)除蛋白質ホエー溶液の調製

125gのチーズホエーパウダーを 375mlの蒸留水に溶解し 25%のホエー溶液を調製した。これをオートクレープで加熱滅菌（110°C、 15min)し、冷却'攪拌後、冷却高速遠心機を用いて遠心分離 (8000rpm、 5°C、 15min)を行い、上清を、濾紙を二枚重ねにして吸引濾過し、加熱変性した蛋白質を取り除いた。

2)基礎ホエー培地の調製

除蛋白質ホエー溶液に蒸留水を加えて 3.5倍（固形分約 7%)に希釈し、 lN-NaOH 試薬を用いて pHを 6.5に調整し、基礎ホエー培地として用いた。

[0022] 3)培地添加成分

a,カゼイン酵素分解物

3gのカゼイン (Casein From Bovine Milk Purified

Powder：シグマ社）に 100mlの蒸留水をカ卩え分散させ、 IN- NaOHを用いて pHを 7.0に調整しながら溶解させた。その後、冷却遠心機を用いて遠心分離 (8000rpm、 5°C、 15min)を行い、上清に 0.12gのプロテアーゼ Pをカ卩え、攪拌しながら 37°Cで 2時間反応させた。反応後、カゼイン溶液を加熱して酵素を失活させた（内温 90°C、 15min保持）冷却後、その溶液をナス型フラスコに分注し、 38°Cで予備凍結した後、凍結乾燥した。

b,グノレコース

グルコースは D(+)- Glucose (Dextrose, Anhydrous：和光純薬株式会社）を使用した c,酵母エキス

酵母エキスは、培地用 Yeast Extract (バタト社)と、食品用に市販されている酵母ェキス協和 C、酵母エキス協和 H、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 W (いずれも協和発酵工業株式会社)、酵母エキス武田 HR、酵母エキス武田 Sl^-W (いずれも武田キリン食品株式会社)又は酵母エキス JT-21A JTフーズ株式会社)を使用した。

d,ォレイン酸化合物

ォレイン酸ィ匕合物は、 Tween80(ディフコ社)と、認可されている食品添加物であるォレイン酸ナトリウム（関東ィ匕学株式会社)、リヨートシュガーエステル 0- 1570 (食品添加物 ·ショ糖ォレイン酸エステル三菱ィ匕学フース、株式会社)又はデカグリセリンモノォレート (理研ビタミン株式会社)を使用した。

実施例 3

[0023] カゼイン酵素分解物添加培地の調製

参考例 2で調製した基礎ホエー培地に培地成分をそれぞれ添加し、オートクレープで加熱滅菌（115°C、 15min)を行った。調製した培地の組成を表 3に示した。

[0024] [表 3] カゼイン酵素分解物添加培地の組成 (％)

カゼイン酵素分解物グルコース Tween 80 培地用 Yeast extract

0.0O/6添加培地 0.0 1.0 0.1 0.3

0.3%添加培地 0.3 1 .0 0.1 0.3

0.50b添加培地 0.5 1.0 0.1 0.3

0.8%添加培地 0.8 1 .0 0.1 0.3

1.0%添加培地 1 .0 1 .0 0.1 0.3

実施例 4

[0025] Tween80代巷物添加培地の調製

Tween80代替物添加培地として、参考例 2で調製した基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、酵母エキスを添加し、ォレイン酸ィ匕合物としてォレイン酸ナトリウム、リヨートシュガーエステル 0- 1570又はデカグリセリンモノォレエートのいずれかをそれぞれ添加して培地を調製した。比較としてォレイン酸化合物無添加培地及び Tween80添加培地を調製した。培地の組成は表 4に示した。

表 4のアルファベットは、次の成分の略を示す。 G=グルコース、 C=カゼイン酵素分解物、 YEB=培地用 Yeast Extract (バタト社）、 YE=食品添加用酵母エキス、 0=ォレイン酸化合物。

T80=Tween80、 SO=ショ糖ォレイン酸エステル、（^=ォレイン酸ナトリウム、 0\1=デ力グリセリンモノォレエート、（W) =酵母エキス協和 W。

[0026] [表 4]

基礎ホエー培地に異なるォレイン酸化合物を添加した培地の組成 (％)

※培地番号 2、 6、 7の培地には、さらに、 MgS0₄ 0.05%, MnS0₄ 0.025%、 Κ,Ι ΙΡΟ, 0.2% (Nl I₄)₃C₆I I₅0.

0.2%、 NaC₂H₃0₂0.5%を添加 _c 実施例 5

[0027] 培地用 Yeast Extract代巷物添加培地の調製

培地用 Yeast Extract代替物添加培地は基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、 Tween80を添カ卩し、酵母エキスとして、酵母エキス協和 C、酵母エキス協和 H、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 W、酵母エキス武田 HR、酵母エキス武田 SL-W又は酵母エキス JT-21Aの、ずれかをそれぞれ添加して培地を調製した。比較として培地用 Yeast Extract添加培地を調製した。調製した培地の組成は表 5に示し、培地番号 1、 3、 5、 7、 9、 11一 13の培地には、さらに MgSO 0.05%、 MnSO 0.025%、

4 4

K ΗΡΟ 0.2%、 (ΝΗ ) C Η Ο 0.2%、 NaC Η Ο 0.5%を添カ卩した。

2 4 4 3 6 5 7 2 3 2

表 5のアルファベットは、次の成分の略を示す。 G=グルコース、 C=カゼイン酵素分解物、 YEB=培地用 Yeast Extract (バタト社）、 YE=食品添加物用酵母エキス、 0=ォレイン酸化合物。

(YEB)=培地用 Yeast Extract (バタト社）、（C)=酵母エキス協和 C、（H)=酵母エキス協和 H、（L)=酵母エキス協和 L、（W)=酵母エキス協和 W、（HR)=酵母エキス武田 HR、 (SL-W)=酵母エキス武田 SL-W、（21A)=酵母エキス JT-21A、 T80=Tween80_o

[0028] [表 5] 基礎ホエー培地に培地用 Yeast Extract又は食品添加物用酵母エキスを添力卩した培地の組成 (％)

※培地番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1〜13の培地には、さらに MgSO, 0.05%、 nS0₄ 0.025%、 K₂HP0₄ 0,2%、 (M I₄)_SC₆H₅〇₇ 0,2%、 NaC₂H_:iO₂0.5%を添加 _c 実施例 6

[0029] 某碟ホヱ一培地に食品添加物用酵ヱキス添加した谘地の讕

酵母エキス添加培地は基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、 Tween80と、酵母エキスとして、酵母エキス協和 W又は酵母エキス武田 HRをそれぞれ 0.3%添加した培地と、カゼイン酵素分解物を添加せず、酵母エキス協和 W又は酵母エキス武田 HRをそれぞれ 0.3%、 0.6%又は 0.9%添カ卩した培地を調製した。調製した培地の組成は表 6に示した。

表 6のアルファベットは、次の成分の略を示す。 G=グルコース、 C=カゼイン酵素分解物、 YE=食品添加物用酵母エキス、 0=ォレイン酸ィ匕合物。（W)=酵母エキス協和 W 、（HR)=酵母エキス武田 HR、 T80=Tween80。

[0030] [表 6] 基礎ホ培地に食品添加物用酵母エキスを添加した培地の組成

※全ての培地に、さらに N'lgS0₄ 0.05%, nS0₄ 0.025% ₂HPC) 0.2%. ( H₄)₃C₆H₅0₇ 0.2% NaC₂I I₃0₂

0.5%を添カロ。実施例 7

[0031] 供試菌の前焙着

供試菌には L. acidophilus JCM11047又は L. gasseri JCM1131を用いた。凍結保存してお!ヽた供試菌液を 5mlの MRS培地に 3%量接種した。インキュベーターで培養（37°C、 24hr)した。その後その培養液をさらに 5mlの MRS培地に 3%量接種し、培養を行った。

[0032] インキュベーターによる培着

実施例 1一 6記載の培地に供試菌の前培養後菌液を 3%接種し、攪拌後、ねじ口試験管に分注した。 37°Cのインキュベーターで培養し、培地を培養 0、 4、 8、 16、 24時間後と経時的にサンプリングし、培地の濁度及び pHを測定することで、培地における供試菌の生育性を検討した。

実施例 8

[0033] ジャーフアーメンターによる培着

基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、酵母エキス協和 C、 Tween80 を添加した培地と、さらに MgSO 、 MnSOの無機塩を添カ卩した培地とを調製し、 MRS

4 4

培地で前培養した供試菌液を 3%量接種し、ミニジャーフアーメンター (株式会社高杉製作所）を用いて 37°C、 80rpmで培養した。また、 3N_NaOH溶液を滴下することにより、 pH5.5に保持するようにした。培地を経時的にサンプリングし、濁度を測定することで、培地における供試菌の生育性を検討した。 [0034] 本発明の乳酸菌培地を用いた試験の例を試験例として次に示す。

[0035] [試験例 1]

酵素分解ホエー培地における供試菌の牛.音件の檢討

(1)培地

実施例 1で調製した表 2の酵素分解ホエー培地を用いた。比較として MRS培地を用いた。

(2)培養

50mlの培地に実施例 7に記載の方法で前培養した L. acidophilus JCM11047の菌液を 3%量接種し、攪拌後、 7mlずつねじ口試験管 7本に分注した。 3本は 37°Cのィンキュベータ一で培養し、 0、 4、 8、 16、 24時間後に濁度及び pHを測定し、酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性を検討した。

[0036] (3)測定

供試菌を接種した 3本の試験管の濁度をデジタル比色計 (mini photo 10 :三紳工業株式会社)を用いて経時的に測定 (測定波長： 620nm)し、 3本の測定値の平均力培養開始前の濁度 (ブランク）を差し引いた値で比較を行った。また、 pHは pHメーター（ F— 21型:株式会社堀場製作所)を用 Vヽて経時的に測定した。

[0037] (4)結果

結果を図 1及び図 2に示した。図 1において、酵素分解を 2時間行った酵素分解ホェ一培地にさらにカゼイン酵素分解物を添加した培地と添加しなカゝつた培地では、培養後 24時間の濁度には差がみられず、酵素分解を行ったホエーのみでも低分子化した窒素化合物が充分存在することが示された。また、図 2において、酵素分解を 2時間行った酵素分解ホエー培地と 6時間行った酵素分解ホエー培地の比較では、培養後 24時間の濁度には差がみられな力つた。

[0038] [試験例 2]

カゼイン酵素分解物添加焙地における供試菌の牛.音件の枪討

(1)カゼイン酵素分解物を添加した基礎ホエー培地

実施例 3で調製した表 3のカゼイン酵素分解物添加培地を用いた。

[0039] (2)培養及び濁度、 pHの測定前培養したし acidophilus JCM11047の菌液を 3%量接種して、試験例 1と同様の方法で培養した。濁度、 pHの測定は試験例 1と同様の方法で行った。

[0040] (3)結果

結果を図 3に示した。図 3において、カゼイン酵素分解物を基礎ホエー培地中に添加し培養を行ったものは添加しなカゝつたものに比べ高い濁度を示し、カゼイン酵素分解物を添加することで、供試菌の生育が促進されることが確認された。

[0041] 種々の供試菌の生育性の検討

供試菌として、 L.acidophilus JCM11047, L.acidophilus JCM1132T, L.gasseri JCM1131Tゝ L.gasseri JCM11657, L.amylovorus JCM5811、 L.crispatus JCM8779 、 L.helveticus JCM1120T, L.rhamnosus JCM1136、 L.casei JCM1134T又は L.bulgaricus B5bを用い、カゼイン酵素分解物及び酵母エキスを添カ卩した基礎ホェ一培地における生育性を調べた。菌はそれぞれ MRS培地（M.R.S.BROTH;ォキソイド社製)で実施例 7と同様の方法で前培養を行った。

[0042] (1)培地の調製

培地は基礎ホエー培地に、グルコース 1.0%、カゼイン酵素分解物 0.3%、 Tween80 0.1%、培地用 Yeast Extractの代替物として酵母エキス協和 W 0.3%を添カ卩したものであり、さらに MgSO 0.05%、 MnSO 0.025%、 K HPO 0.2%、（NH ) C H O 0.2%、

4 4 2 4 4 3 6 5 7

NaC H O 0.5%を添カ卩して調製した。比較として参考例 1の MRS培地を用いた。

2 3 2

(2)培養及び濁度の測定

菌ごとに前培養した菌液を 3%量接種して、試験例 1と同様の方法で 37°C、 16時間培養を行い、培養終了後に濁度を測定し、培地における各供試菌の生育性を検討した

[0043] (3)結果

結果を図 4に示した。図 4において、いずれの菌も、 MRS培地で培養した場合と同等又はそれ以上の濁度を示した。特に、 L.bulgaricus B5bは MRS培地ではほとんど濁度が変化しないが、本発明の培地では高い濁度を示した。従って、培地は、種々の乳酸菌の培養において充分な生育促進効果を有することが示された。

[0044] [試験例 3] 食品添加物を添加した培地における供試菌の生育性の検討

(l) Tween80の代替による供試菌の生育性の検討

1)培地

実施例 4で調製した表 4の Tween80代替物添加培地を用いた。比較として参考例 1 の MRS培地を用いた。

[0045] 2)培養及び濁度、 pHの測定

MRS培地及び表 4の培地番号 1及び 3— 5の培地に前培養した L. acidophilus JCM11047の菌液を 3%量接種して、試験例 1と同様の方法で培養した。濁度、 pHの測定を試験例 1と同様の方法で測定した。 Tween80の代替物としてォレイン酸ナトリウムを添加した培地は濁度が高いため、蒸留水で 3倍に希釈してカゝら測定し、その濁度を 3倍した値を結果として用いた。

また、表 4の培地番号 2、 6、 7の培地を用いて、培養後 16、 24時間後に濁度及び pH を測定し、培地における供試菌の生育性を確認した。

[0046] 3)結果

結果を図 5及び図 6に示した。図 5において、 Tween80の代替物としてォレイン酸ナトリウムを添加した培地は Tween80を添加した培地よりも高い濁度を示した。また、培養後 16時間、 24時間目では MRS培地よりも高い濁度を示した。一方、ショ糖ォレイン酸エステルを添カ卩した培地は、他のォレイン酸ィ匕合物を添カ卩した培地に比べ、低い濁度を示した。

また図 6において、 0.1%又は 0.2%のデカグリセリンモノォレートを添カ卩した培地は Tween80を添カ卩した培地と同等程度の濁度を示した。従って、 Tween80の代替物として、ォレイン酸ナトリウム及びデカグリセリンモノォレートを用いた培地は、供試菌に対して充分な生育促進効果を有することが示された。

[0047] (2)食品添加物用酵母エキスを培地用酵母エキスの代替とする培地における供試菌の生育性の検討

1)培地

実施例 5で調製した表 5の培地用 Yeast Extract代替物添加培地を用いた。コント口ールとして、 MRS培地を用いた。 [0048] 2)培養及び濁度、 pHの測定

MRS培地及び表 5の培地番号 2、 4、 6、 8及び 10の調製した培地にし acidophilus JCM11047の前培養後菌液を 3%量接種して、試験例 1と同様の方法で培養した。濁度は試験例 1と同様の方法で測定した。

また、その他の酵母エキス添加培地は表 5の培地番号 1、 3、 5、 7、 9及び 11一 13の培地を用いた。この培地において、 L. acidophilus JCM11047又は L. gasseri JCM1131の前培養後菌液を 3%量接種して、試験例 1と同様の方法で培養した。濁度を試験例 1と同様の方法で測定した。これらの培地の濁度より、各培地における供試菌の生育性を確認した。

[0049] 3)結果

結果を図 7—図 9に示した。図 7において、表 5の培地番号 2、 4、 6、 8及び 10の培地として酵母エキス協和 C、酵母エキス協和 H、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 Wの V、ずれかをそれぞれ添カ卩した培地は培地用 Yeast Extractを添カ卩した培地よりも!/、ずれも高い濁度を示し、各培地における L. acidophilus JCM11047の生育が促進されることが確認された。

また、図 8において、表 5の培地番号 1、 3、 5、 7、 9及び 11一 13の培地として、酵母ェキス協和 C、酵母エキス協和 H、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 W、酵母エキス武田 HR、酵母エキス武田 SL-W又は酵母エキス JT-21 Aの!ヽずれかをそれぞれ添加した培地は、培地用 Yeast Extractを添カ卩した培地よりも高い濁度を示し、培地におけるし acidophilus JCM11047の良好な生育が確認された。

また、図 9において、図 8と同様に酵母エキス協和 C、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 W、酵母エキス武田 HR、酵母エキス武田 SL-W又は酵母エキス JT-21Aのいずれかをそれぞれ添カ卩した培地は、培地用 Yeast Extractを添カ卩した培地と比べて同等又はそれ以上の濁度を示し、培地における L. gasseri JCM1131の良好な生育が確 f*i¾ れ。

従って、培地用 Yeast Extractの代替物として、酵母エキス協和 C、酵母エキス協和 H、酵母エキス協和 L、酵母エキス協和 W、酵母エキス武田 HR、酵母エキス武田 SL-W及び酵母エキス JT-21Aを用いた培地は、供試菌に対する充分な生育促進効果を有することが示された。

[0050] (3)基礎ホエー培地に食品添加物用酵母エキスのみを添加した培地における供試菌の生育性の検討

1)基礎ホエー培地に食品添加物用酵母エキスのみを添加した培地

実施例 6で調製した表 6の食品添加物用酵母エキス添加培地を用いた。比較として参考例と同様の方法で調製した MRS培地を用いた。

[0051] 2)培養及び濁度の測定

酵母エキス添加培地として、表 6の培地番号 1一 8の培地を用いてし acidophilus JCM11047の前培養後の菌液を 3%量接種して、試験例 1と同様の方法で培養した。濁度の測定も試験例 1と同様の方法で行った。これらの培地の濁度より、各培地における供試菌の生育性を確認した。

[0052] 3)結果

結果を図 10に示した。図 10において、表 6の培地番号 1一 8の培地として、酵母ェキス協和 W、酵母エキス武田 HR又はのいずれかをそれぞれ添加した培地は、し acido philus JCM11047及び L. gasseri JCM1131のいずれにおいても、高い濁度が示された。

従って酵母エキスを 0.6%又は 0.9%添カ卩した培地は 0.3%のカゼイン酵素分解物を添加した培地より高い濁度を示し、供試菌に対する充分な生育促進効果を有することが示された。

[0053] [試験例 4]

乾'燥菌体重量の比較による供試菌の牛.音件の枪討

( 1)培地の調製

基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、酵母エキス協和 C、 Tween80 を添カ卩したホエー培地 Aと、さらに MgSO、 MnSOの無機塩を添カ卩したホエー培地 B

4 4

を調製した。調製した培地の組成は表 7に示した。比較として参考例と同様の方法で調製した MRS培地を用いた。

[0054] [表 7] ー

[0055] (2)培養及び濁度、 pHの測定

参考例に記載の方法で前培養した供試菌をさらに MRS培地で 16時間培養した菌液を用いた。 MRS培地及び調製した培地に L. acidophilus JCM11047の菌液を 3%量接種して、ミニジャーフアーメンターを用いて 37°C、 80rpmで培養した。また、

3N-NaOH溶液を滴下することにより、 pH5.5に保持するようにした。培地を経時的にサンプリングし、濁度を試験例 1と同様の方法で測定し、また培養終了後の菌体の重量を測定することで供試菌の生育性を検討した。

[0056] (3)菌体の回収及び乾燥

培養 24時間目で培養を終了し、培地を冷却高速遠心機を用いて遠心分離（ 3000rpm、 5°C、 15min)し、沈殿した菌体を回収し、滅菌蒸留水を加え、遠心分離（ 3000rpm、 5°C、 15min)で 2回洗浄を行った。洗浄後の菌体分散溶液をナス型フラスコに分注し、 -38°Cで予備凍結した後、凍結乾燥をして、菌体の重量を測定した。

[0057] (4)結果

培養後の菌体の重量を図 11に示した。図 11において、 MRS培地で培養した菌体の重量と比較して、ホエー培地 Aでは 2倍以上、ホエー培地 Bでは 3倍以上の乾燥菌体重量を示した。

また、培養後 0、 4、 8、 16、 24時間目の濁度と 16、 24時間目の pHを表 8に示した。培養後 24時間目の濁度は、図 12に示したように、試験管を用いてインキュベーターで培養した場合と比較して高い濁度を示し、ジャーフアーメンターによって、 pHを生育に適した状態に保つことで、ホエーを用いた培地における供試菌の生育の効果がさらに高められることが示された。

[0058] [表 8] MRS ェ一いたのび Hの化

産業上の利用可能性

本発明で得られた培地は、廃棄されていたホエーを有効に利用し、認可されている食品添加物を添加成分とすることで、安価かつ安全に乳酸菌を大量に培養することができる。また、この培地によって培養された乳酸菌を用い、食品、医薬等の開発や製造に用いることができる。

Claims

請求の範囲

[I] 窒素源を強化したホエーを含有することを特徴とする培地。

[2] 窒素源の強化が酵母エキス及び/又は蛋白質酵素分解物の含有によるものである請求項 1に記載の培地。

[3] 窒素源の強化が酵素分解ホエーの含有によるものである請求項 2に記載の培地。

[4] 窒素源の強化がカゼイン酵素分解物の含有によるものである請求項 2に記載の培地。

[5] 酵素分解ホエー又はカゼイン酵素分解物がプロテアーゼで分解されたものである請求項 3又は 4の、ずれかに記載の培地。

[6] プロテアーゼがプロテアーゼ Pである請求項 5に記載の培地。

[7] さらにグルコース及びォレイン酸ィ匕合物を含有する請求項 1一 6のいずれかに記載の培地。

[8] ォレイン酸化合物が、 Tween80、ォレイン酸ナトリウム、ショ糖ォレイン酸エステル、グリセリンォレエートである請求項 1一 7のいずれかに記載の培地。

[9] 成分が全て認可された食品添加物からなる請求項 1一 8の、ずれかに記載の培地。

[10] 請求項 1一 9のいずれかに記載の培地を用いて乳酸菌を培養する方法。

[I I] 孚 L酸菌; 0 L. acidophilus、 L.gassen、 L.amylovorus、 L.crispatus、 L.heiveticus、

し rhamnosus、し casei、 L.bulgaricus等の乳酸桿菌である請求項 10に記載の培養方法。

[12] 請求項 9一 11のいずれかの方法で培養された乳酸菌を用いる食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬の製造方法。

[13] 製造する食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬がヨーグルト、チーズ、乳酸菌を含有する錠剤である請求項 12記載の方法。