KR101342791B1 - 1,4-디히드록시-2-나프토산 생산능을 가지는 락토바실러스 카제이 lp1 균주 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1,4-디히드록시-2-나프토산 생산능을 가지는 신규 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 균주를 이용한 DHNA 생산 방법 및 상기 균주를 포함하는 식품에 관한 것이다.

Description

1,4-디히드록시-2-나프토산 생산능을 가지는 락토바실러스 카제이 LP1 균주 및 이의 이용{LACTOBACILLUS CASEI LP1 STRAIN PRODUCING 1,4-DIHYDROXY-2-NAPHTHOIC ACID AND ITS USE}
본 발명은 1,4-디히드록시-2-나프토산 생산능을 가지는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1 균주(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 및 이의 이용에 관한 것이다.
1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA)은 비피더스균 증식 촉진 작용을 가지며, 염증성 장질환에 있어서의 점막의 염증 상태를 개선하고 활성화 면역 세포의 침윤을 억제하는 것으로 알려져 있다.
또한 DHNA는 락토오즈 불내증(不耐症, intolerance)의 복부 불쾌 증상을 저감하고, 대사성 골질환의 예방 및 치료에 유용하다고 알려져 있다.
이러한 DHNA는 박테리아의 호흡 사슬에서 전자전달자(electron transfer agent)로 중요한 역할을 수행하는 메나퀴논(menaquinone; 비타민 K2)의 전구체로서 인체에 유익한 물질이다.
상기 메나퀴논은 전자전달자의 역할 뿐만 아니라 동물의 혈액과 뼈에 존재하는 특이 단백질을 구성하는 감마-카르복실글루타믹산(γ-carboxyglutamic acid)을 합성하기 위한 보조인자(cofactor)로 작용한다.
따라서 메나퀴논의 전구체인 DHNA의 중요성은 매우 크다. 그리고 DHNA의 골량 감소를 억제하여 골다공증을 개선하는 효과 역시 익히 알려져 있다.그러나 향후 억제 기전을 해명하는 것이 현재 남은 과제이다.
종래의 DHNA는 프로피온산균에 의해 균체 내외에서 대량으로 생산하는 방법과 프로피온산균을 이용한 발효법을 통해 제조되는 방법 등 다양한 방법을 통해 제조하려는 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
한편 DHNA는 유기 화학 합성법을 통해 생산되어 왔으며, 이런 유기 화학 합성법은 유기용매 중 고온 고압 하에서의 반응 또는 촉매 등으로 인해 음식용으로 적합하지 않아 식품이나 의약품에 적용하는데 한계가 있어 왔다.
이에 본 발명자는 DHNA를 생산하는 방법에 대해 연구하던 중, DHNA를 생산하는 것으로 확인된 신규 균주를 분리하게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
대한민국 등록특허 제10-0899615호
본 발명의 목적은 1,4-디히드록시-2-나프토산(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid, DHNA)를 생산하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주를 이용한 DHNA 생산 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP)균주를 포함하는 식품을 제공하기 위한 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DHNA을 생산하는 신규 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 신규 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주는 치즈로 부터 분리될 수 있다. 본 발명에서는 가공 치즈나 자연 치즈를 모두 이용할 수 있는데, 자연 치즈를 이용하는 것이 더 바람직하다. 자연 치즈란, 100% 우유만을 발효 · 숙성시켜 만든 치즈이다. 가공 치즈는 보존제 등의 첨가물이 들어간 치즈이다.
상기 치즈로부터 균주는 동정을 통해 유산균의 일종인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)에 속함을 확인할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주를 배지에서 배양하여, 그 배양물로부터 1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA)를 얻는 것을 특징으로 하는 DHNA 생산 방법을 제공한다.
아울러 상기 배지는 유청 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 유청(whey)은 우유를 이용한 치즈 제조시 발생하는 부산물로서 다양한 영양성분(유당, 단백질, 무기질, 비타민 등)이 포함되어 있기 때문이다.
또한 유청 배지를 이용하게 되면 배양배지의 가격이 낮아 산업적인 생산에서 생산비를 낮춰 제품의 가격 경쟁력을 확보할 수 있다. 특히 유청 속에 함유된 다양한 기능성 단백질들(β-락토글로불린, α-락트알부민, 면역글로불린, 락토페린, 락토퍼록시다제 등)은 상기 배양액의 고부가 가치화에 기여할 수 있다.
아울러 본 발명은 1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA) 생산능을 가지는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 한 가지를 유효성분으로 포함하는 식품을 제공한다.
그리고 상기 균주를 발효 종균으로 이용하여 발효 식품을 제조할 수도 있다.
상기 식품은 발효 식품 또는 발효 음료의 형태로 다양하게 응용 가능하다. 또한 발효 식품 또는 발효 음료는 상기 유효성분 이외에 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가적으로 함유할 수 있다.
아울러 본 발명에서 '배양배지'란, 동물세포나 식물세포 또는 미생물 등을 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체를 의미한다. 상기 '배양액'이란, 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미하며 액체상의 배양액으로부터 균주를 제거한 상등액을 일컫는 '배양여액'을 포함하는 개념이다. 상기 배양액의 농축액이란, 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액에서 물기를 제거한 것을 말한다.
본 발명은 DHNA를 생산하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주, 상기 균주를 배양하여 DHNA를 생산하는 방법 및 상기 균주를 포함하는 식품을 제공하는 효과를 가진다. 따라서 상기 균주는 각종 기능성 식품 및 의약품에 널리 이용될 수 있다.
도 1은 LP1 균주의 유청발효물로부터 DHNA 유무를 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 통해 확인한 크로마토그램이다. A 크로마토그램은 표준 DHNA 분석결과이고 B 크로마토그램은 유청발효물 시료의 분석결과이다.
도 2는 LP1 균주의 유청발효물을 이용하여 비피도박테리아 균주들에 대한 증식능을 확인한 그래프이다. A, B, C 그래프는 각각 Bifidobacterium bifidum KCTC 3202, Bifidobacterium breve KCTC 3220, Bifidobacterium longum subsp. infantis KCTC 3127를 대상으로 수행한 실험의 결과이다. No addition은 비피도박테리아 균주만 첨가한 경우, Whey는 비피도박테리아 균주와 유청 배지를 첨가한 경우, 그리고 Fermented whey는 비피도박테리아 균주와 LP1 균주를 이용한 유청발효물을 첨가한 경우이다.
이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: DHNA 생산 균주의 선발
DHNA 생산 균주를 선발하기 위해 자연 치즈로부터 유산균을 분리하였다. 먼저 국내 유업체로부터 확보한 자연 치즈 10 g을 샘플로 채취하여 필터백에 무균적으로 넣고 90 mL의 펩톤수(0.1%, w/v)와 섞은 다음 균질화하고, 10진 희석법으로 희석하여 DifcoTM Lactobacilli MRS 고체배지(Proteose Peptone No. 3 10.0 g/L, Beef Extract 10.0 g/L, Yeast Extract 5.0 g/L, Dextrose 20.0 g/L, Polysorbate 80 1.0 g/L, Ammonium Citrate 2.0 g/L, Sodium Acetate 5.0 g/L, Magnesium Sulfate 0.1 g/L, Manganese Sulfate 0.05 g/L, Dipotassium Phosphate 2.0 g/L, Agar 15 g/L)에 상기 유산균을 도말하였다.
반응 온도 37℃에서 24 시간 동안 상기 도말한 유산균을 배양한 후, 형성된 콜로니(colony)를 무작위 채취하여 5 mL DifcoTM Lactobacilli MRS 액체 배지(상기 고체배지 구성성분에서 한천(agar)이 제외됨)에서 배양하였다.
상기 배양 균주는 3 분획법을 2번 반복 수행하여 순수 분리하고, -76℃ 극저온 냉동고에서 글리세롤 스톡(glycerol stock)으로 보관하였다.
이렇게 치즈에서 분리한 균주를 DifcoTM Lactobacilli MRS 액체배지에서 활성화시킨 다음, 이를 5 mL의 유청 배지(10% 유청 분말, w/v)에 1% 접종하였다.
접종물은 37℃에서 72 시간 동안 가스팩(GasPak)법으로 혐기 배양한 후 배양액에 아스코르브산나트륨을 최종 농도 0.08% (w/v)되게 첨가하여 원심분리(6,000 rpm, 10분, 4℃)한 후 상등액을 동결 건조하였다.
동결 건조 샘플을 먼저 물(200 μL)에 녹인 후 메탄올(400 μL)을 첨가하여 원심분리(4,000 rpm, 1분, 실온)한 후 여과(0.45 ㎛ syringe filter)된 20 μL의 여과액을 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석에 사용하였다.
상기 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석 조건은 컬럼: C18, 충전제 입경: 3 ㎛, 내경: 4.6 mm, 길이: 150 mm(컬럼: ACE 5 C18), 이동상: 아세토니트릴: 메탄올: 물: 아세트산= 15: 25: 225: 0.1(5% 암모니아수로 pH 5.5 조정), 컬럼온도: 45℃, 유속: 1 mL/min, 검출파장: UV 254 nm 이다.
1차 스크린을 통해 얻은 DHNA 피크를 갖는 균주를 "LP1"이라 명명하였다.
실시예 2 : LP1 균주의 유청 발효를 통한 DHNA 생산 확인
멸균한 유청배지(10%, w/v) 50 mL에 실시예 1에서 얻은 LP1 균주를 1% 접종한 후 37℃에서 혐기적인 조건으로 48 시간 배양하였다. 배양액 4 mL에 두 배의 메탄올을 혼합한 후 소듐-아스코르베이트(sodium-ascorbate, Sigma Co.)를 최종농도 0.2%가 되게 첨가하였다. 10분 정도 추출 후 원심분리하여(3,600 rpm; 10분; 4℃) 그 상등액을 취한 후 진공회전증발농축기(rotary evaporator; 40℃)로 농축(200 μL) 하였다. 농축액에 두 배(400 μL)의 메탄올을 혼합한 후 주사필터(0.45㎛; Sartorius Co.)로 여과하여 그 여액을 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. 표준 DHNA 시료 조제는 시약급의 DHNA(Sigma-Aldrich Co.) 적정량을 메탄올에 녹인 후 주사필터(0.45㎛; Sartorius Co.)로 여과하여 그 여액을 시료로 사용하였다. HPLC용 컬럼은 Agilent HC-C18(4.6ㅧ150mm, 5㎛)을 사용하였고 이동상은 아세토니트릴 : 메탄올 : 물 : 아세트산 = 15 : 25 : 225 : 0.1로 하였으며 암모니아수(ammonium hydroxide)를 이용하여 pH 5.5로 조정하였다. 컬럼의 온도는 45℃로 유지시켰으며 유속은 1 mL/min으로 하였고 시료 주입량과 검출파장은 각각 20 μL와 254 nm로 하였다. 이상의 방법으로 분석한 결과 LP1 균주를 이용한 유청발효물에서 표준 DHNA와 동일한 머무름 시간(retention time)을 나타내는 피크를 확인할 수 있었으며 이는 LP1 균주로부터 DHNA가 생산되고 있음을 의미한다(도 1).
실시예 3 : LP1 균주를 이용한 유청발효물의 비피도박테리아 증식능
실시예 2에서 설명한 방법으로 조제된 유청발효물을 원심분리(3,600 rpm; 10분; 4℃) 한 후 상등액을 주사필터(0.22 ㎛)로 여과하여 그 여액을 비피도박테리아 증식능 시험을 위한 시료로 사용하였다. 동시에 젖산(lactic acid)을 이용하여 유청배지의 pH를 유청발효물과 같게 조정한 후 동일한 방법으로 시료를 조제하여 대조군으로 사용하였다. 비피도박테리아 증식능 시험은 1/10 RCM(reinforced clostridial medium) 브로쓰(정상적인 RCM broth 성분의 1/10만 첨가됨; 인위적으로 영양성분의 결핍 환경을 조성함)에 비피도박테리아 균주를 0.2% 접종한 후 시료 100 μL(2%)를 첨가하여 경시적으로(0, 4, 8, 12시간) 흡광도(OD600)를 측정하여 균의 증식 유무를 판단하였다. 그 결과 비피도박테리아와 유청 배지만을 첨가한 경우 비피도박테리아 균주만 첨가한 경우에 비해 그 증식속도가 떨어지는 것에 반해 LP1을 이용한 유청발효물의 경우 지속적인 증식이 관찰되었다(도 2). 이는 발효 과정 중에 생성된 LP1 균주의 대사산물들이 비피도박테리아 균주의 증식에 영향을 미쳤을 것으로 판단되며 특히 유청발효물 중에 존재하는 DHNA가 중요한 인자로 작용했을 가능성이 높다.
실시예 4 : LP1 균주의 동정
LP1 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 분석법을 사용하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 분석은 국내 생명공학회사(마크로젠)에 의뢰하여 수행하였다. LP1 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다. GenBank 염기서열 데이터베이스를 이용하여 LP1의 16S rRNA 염기서열의 상동성(homology)을 분석한 결과 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei; accession no. CP002618.1; CP002616.1; CP001084.1; FM177140.1; CP000423.1)와 가장 높은 일치율(상동성 99%)을 보여 본 발명자는 LP1 균주를 "락토바실러스 카제이 LP1(Lactobacillus casei LP1)"으로 명명하였고, 2012년 08월 09일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 12258BP로 기탁하였다.
실시예 5: 락토바실러스 카제이( Lactobacillus casei ) LP1 균주를 이용한 요구르트의 제조
지방질 3.2%의 원유(탈지고형분 함량 8.5%)에 탈지분유를 첨가하여 탈지고형분 함량이 12%가 되도록 조정한 후, 가온하여 균질 및 살균하여 배지를 제조하였다. 그 후, 유청 배지(10% 유청 분말, w/v)에서 배양하여 얻은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1 배양액을 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양은 pH 4.5가 될 때까지 수행하였다. 그 후 감미제로 과실 쨈을 첨가하여 요구르트를 제조하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12258BP 20120809
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Claims (7)

1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA) 생산능을 가지는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 치즈에서 분리되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주.
락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주를 배지에서 배양하여, 그 배양물로부터 1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA)를 얻는 것을 특징으로 하는 1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA) 생산 방법.
제3항에 있어서, 상기 배지는 유청 배지인 것을 특징으로 하는 1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA) 생산 방법.
1,4-디히드록시-2-나프토산(DHNA) 생산능을 가지는 바락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주를 유효성분으로 포함하는 식품.
제5항에 있어서,
상기 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) LP1(미생물 기탁번호 KCTC 12258BP) 균주는 치즈에서 분리되는 것을 특징으로 하는 식품.
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 식품은 발효 식품 또는 발효 음료인 식품.
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