BR112012020975B1 - bactéria pertencente ao gênero bifidobacterium, alimento ou bebida, usos de um fragmento de dna e de um conjunto de iniciadores e métodos para a detecção e quantificação da dita bactéria - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA A CONSTRUÇÃO DE BACTÉRIA PERTENCENTE AO GÊNERO BIFIDOBACTERIUM. Um método para a produção de bactérias pertencentes ao gênero bifidobacterium possuindo excelente viabilidade, mesmo sob diversas condições diferentes, com diferentes fatores ambientais, as bactérias pertencendo ao gênero bifidobacterium obtidas pelo método e um método para a detecção das bactérias são fornecidos. Mediante repicagem a armazenamento das bactérias pertencentes ao gênero bifidobacterium alternadamente em sistemas sob condições com diferentes fatores ambientais, as bactérias pertencentes ao gênero bifidobacterium exibem excelente viabilidade sob a totalidade das condições utilizadas para a alternada repicagem e armazenando podem ser produzidas.

Description

Campo Técnico
[001]A presente invenção refere-se a um método para a produção de novas bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium, as novas bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método e um método para a detecção das bactérias.
Fundamentos da Invenção
[002]As bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium são bactérias importantes na flora bacteriana humana e são conhecidas por terem efeitos benéficos sobre a saúde humana, tais como a regulação da função intestinal, por exemplo, melhoria da constipação e diarreia, a supressão de um aumento do colesterol sérico, e imunoestimulação. Para isso, um certo número de produtos comerciais contendo as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium estão disponíveis nas formas de vários alimentos e bebidas fermentadas, preparações probióticas, e semelhantes. Particularmente, os alimentos e bebidas lácteas fermentadas têm excelente palatabi- lidade e, portanto, eles são adequados para a ingestão contínua das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium.
[003]As bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium são obrigatoriamente anaeróbicas e sensíveis ao oxigênio, possuem pH baixo, e acidez elevada. Assim, existem muitas dificuldades no manuseamento das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium em alimentos e bebidas lácteas fermentadas, em termos de viabilidade proliferação durante a produção, durante o armazenamento, e semelhantes. A fim de obter o efeito fisiológico das bactérias pertencentes ao gênero Bifido-bacterium, considera-se necessário para entregar as bactérias vivas para o intestino tanto quanto possível. Particularmente, o aumento da viabilidade das bactérias em alimentos e bebidas, ou seja, a taxa de chegada de bactérias ingeridas no intestino é considerada como um fator importante.
[004]A fim de resolver os problemas acima, uma tentativa foi feita para melhorar a viabilidade em alimentos e bebidas lácteas fermentadas, mediante melhorar o método de produção e adicionando diversos agentes de melhoria de viabilidade, tais como N-acetil glucosamina, ácido pantatênico, peptídeos e lactulose. No entanto, um tal agente de melhoria de viabilidade para as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium não pode ser facilmente adicionado porque não só aumenta o custo de produção, mas também provoca problemas, tais como a palatabilidade reduzida. Além disso, um método que bloquear completamente as bactérias perten-centes ao gênero Bifidobacterium do contato com o oxigênio mediante encher um produto fermentado contendo as bactérias em um recipiente constituído por um material de embalagem impermeável ao oxigênio imediatamente depois de o produto ser produzido também está em estudo. No entanto, nenhum reservatório perfeito, impermeável ao oxigênio foi ainda disponível. Além disso, não há uma grande flexibilidade na formulação de um tal recipiente, e a eliminação de resíduos é complicada uma vez que o recipiente é feito pelo uso de materiais compósitos. Além disso, o recipiente propriamente é caro, etc. Como mencionado acima, existem muitas limitações na utilização do recipiente.
[005]Por conseguinte, uma solução fundamental para melhorar a viabilidade das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium em alimentos e bebidas fermentadas é produzir bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo alta viabilidade, mesmo sob condições aeróbicas e em condições de pH baixo e elevada acidez. Exemplos de tal cepa bacteriana incluem Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205) (Patente documento 1), Bifidobacterium breve SBR 3212 (FERM P-11915) (documento de patente 2), e Bifidobacterium bifidum YIT 4002 (FERM BP-1038) (Patente Documento 3).
[006]No entanto, tem havido um problema tal que estas cepas com viabilidade melhorada são esperadas exibir seus efeitos de aprimorada viabilidade somente sob condições nas quais elas são produzidas. Isto é, na produção de uma cepa mutante da bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium, um método de repicagem e de armazenamento de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium num ambiente que é difícil para a sobrevivência das bactérias e de obtenção de uma cepa sobrevivente é normalmente praticada. Embora um certo nível de efeito viabilidade- melhoria possa ser esperado em um ambiente sob o qual a cepa mutante tenha sido produzida, nenhum efeito de viabilidade-melhoria pode ser esperado em outros ambientes. Por conseguinte, bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas por um método convencional não podem ser aplicadas a alimentos e bebidas que sejam distribuídos sob uma condição diferente daquela sob a qual a cepa mutante é produzida. Por conseguinte, a utilidade do método convencional tem sido extremamente limitada.
[007]Além disso, embora a causa seja desconhecida, sabe-se que mesmo uma cepa bacteriana com viabilidade melhorada obtida por repicagem e armazenar sob condições com fatores ambientais deteriorados (por exemplo, um pH na região ácida) não exibe o seu efeito viabilidade-aperfeiçoamento quando utilizado sob condições suaves a um pH na região neutra. Esta tem sido também uma das razões para não se obter uma cepa bacteriana altamente versátil que seja aplicável aos vários alimentos e bebidas. Técnica Relacionada Documento de Patente Documento de Patente 1: Publicação Internacional N° WO03/040350 Documento de patente 2: JP-2.922.013 Documento de patente 3: JP-B-61-19.220 Divulgação da Invenção
Problema a ser resolvido pela invenção
[008]Por conseguinte, um objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo excelente viabilidade, mesmo sob diversas condições, com diferentes fatores ambientais, novas bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método e um método para detectar as bactérias.
Meios para resolver o problema
[009]Os presentes inventores realizaram uma investigação intensiva, a fim de resolver os problemas acima mencionados. Como resultado, eles descobriram que, por repicagem e bactérias pertencentes ao armazenamento de gênero Bifidobacterium alternadamente em pelo menos dois tipos de sistemas de que as condições são diferentes em fatores ambientais, pelo menos, duas vezes, bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo excelente viabilidade sob todas as condições alternadas de repicagem e armazenando podem ser obtidas.
[010]Além disso, como um resultado de uma investigação sobre um método para detectar especificamente as novas bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium assim obtidas, eles descobriram um iniciador capaz de amplificar especifica-mente um fragmento de DNA da bactéria, e descobriu que as bactérias podem ser detectadas especificamente e quantificadas usando o iniciador. Os presentes inventores também descobriram que a contagem bacteriana viável das bactérias acima mencionadas pode ser quantificada com uma combinação do iniciador e um corante permeável a membrana.
[011]Isto é, a presente invenção proporciona um método para a produção de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium incluindo repicagem e armazenamento das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium alternadamente em pelo menos dois tipos de sistemas em condições com diferentes fatores ambientais, pelo menos, duas vezes.
[012]Além disso, a presente invenção proporciona as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método acima mencionado.
[013]Além disso, a presente invenção proporciona um alimento ou bebida, particularmente um alimento ou bebida láctea fermentada contendo as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium.
[014]Além disso, a presente invenção proporciona um fragmento de DNA possuindo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de nucleotídeos complementar para a sequência acima.
[015]Além disso, a presente invenção proporciona um iniciador para Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11.320), com uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de nucleotí- deos complementar à sequência.
[016]Além disso, a presente invenção proporciona um método para a detecção de Bifidobacterium breve YIT 12272 incluindo utilizando o iniciador.
[017]Além disso, a presente invenção proporciona um método para quantificar uma contagem de bactérias Bifidobacterium breve YIT 12272 incluindo utilizando o iniciador.
[018]Além disso, a presente invenção proporciona um método para quantificar uma contagem bacteriana viável de Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP- 11.320), incluindo realizar uma reação de PCR em uma amostra tratada com um corante permeável a membrana usando o iniciador.
Efeito da Invenção
[019]De acordo com o método para a produção de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium da presente invenção, as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo excelente viabilidade mesmo em produtos acabados ou sob diferentes condições ambientais em fatores, tais como condições de distribuição podem ser obtidas. Uma vez que uma tal cepa bacteriana é aplicável a vários alimentos e bebidas e tem alta viabilidade em alimentos e bebidas, pode efetivamente exibir o efeito fisiológico das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium. Além disso, uma cepa bacteriana utilizável em vários alimentos e bebidas pode ser produzida através do aprimoramento das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacte-rium possuindo um efeito fisiológico específico, tal como uma ação antibacteriana a Helicobacter pylori por meio do método de produção da presente invenção. Por estas razões, a presente invenção tem aplicabilidade industrial extremamente alta.
[020]Bifidobacterium breve YIT 12272 possuindo excelente viabilidade pode ser especificamente detectada e quantificada em alimentos, bebidas, fezes, e intestinos, mediante utilizar o fragmento de DNA da presente invenção.
Breve Descrição dos Desenhos
[021]A Figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos da banda RAPD específica para Bifidobacterium breve YIT 12272. A sequência de um iniciador YIT 12272- específico é circundado por uma caixa;
[022]A Figura 2 mostra a mudança no valor quantitativo de YIT 12272 por PCR quantitativo com tratamento por membrana permeável a corante;
[023]A Figura 3 mostra as condições ideais para o tratamento de PMA;
[024]A Figura 4 mostra a mudança no valor quantitativo de YIT 12272 tratado termicamente nas fezes, por tratamento PMA; e
[025]A Figura 5 mostra uma relação entre a contagem bacteriana viável de YIT 12272 vivo adicionado às fezes e do valor quantitativo de YIT 12272 obtido por PCR quantitativo (com tratamento PMA).
Modos para Realizar a Invenção
[026]Na presente invenção, um fator ambiental refere-se a qualquer fator que influencia a proliferação e viabilidade das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium. Exemplos destes incluem pH, pressão osmótica, a acidez, temperatura de cultura/armazenamento, a quantidade de oxigênio dissolvido, luz, pressão, a atividade da água, microrganismos coexistentes, um fator nutricional (por exemplo, açúcares, proteínas, peptídeo, gorduras, tais como uma gordura de leite, vitaminas, minerais, leite integral não desnatado, e um fator de crescimento das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium tal como um extrato de levedura), um antibiótico, um método de cultura (tal como a cultura estática, cultura agitada, cultura por batedura, e cultura por aeração), um método de esterilização, um método de mistura, um método de embalagem, e um material de um recipiente de armazenamento de uma calda de cultura ou um alimento ou bebida. Particularmente, pH, pressão osmótica, acidez, temperatura da cultura, e um fator nutricional, que são importantes fatores ambientais que influenciam a proliferação e viabilidade das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium, são de preferência utilizados. Nisto, a luz inclui tanto a luz visível e a luz não-visível, e a acidez indica a quantidade de uma solução aquosa 1/10 N de hidróxido de sódio (mL) necessária para neutralizar 9 g de uma amostra.
[027]Além disso, "pelo menos dois tipos de sistemas sob condições com diferentes fatores ambientais" referem-se, a pelo menos, dois tipos de sistemas em que a qualidade e/ou a quantidade de certos fatores ambientais são variadas, por exemplo, pelo menos, dois tipos de sistemas resultantes a partir da variação de pH, da pressão osmótica, da acidez, da temperatura da cultura, de um fator nutricional, e de formas semelhantes de uma calda de cultura ou um alimento ou bebida. Exemplos mais específicos incluem sistemas resultantes da variação de uma calda de cultura ou um alimento ou bebida, por meio de alteração do pH, por exemplo, de 5 a 3, da alteração da pressão osmótica, por exemplo, de 600 mOsm (milliosmol) a 950 mOsm, alteração da acidez, por exemplo, de 6 a 20, alteração da temperatura da cultura da calda de cultura, por exemplo, de 37 °C a 30 °C, alteração dos açúcares na calda de cultura ou de alimentos ou bebidas, por exemplo, do açúcar digerível para açúcar não digerível, e, por exemplo, aumentando a concentração de oxigênio dissolvido por agitação.
[028]Nenhuma limitação particular é imposta em um ou outro fator ambiental alvo ou alterações na sua qualidade e/ou quantidade. Todavia, é preferível levar em conta uma ou mais condições e fatores ambientais das caldas de cultura ou dos alimentos e bebidas aos quais as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium a serem produzidas através do método de produção da presente invenção são aplicadas, selecionar a condição e o fator ambiental que influenciam a proliferação e a viabilidade da bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium, e conduzir alternadamente a repicagem e armazenamento da bactéria sob essa condição selecionada e do armazenamento das bactérias sob tais condições selecionadas e fator ambiental. Embora as condições de cultura das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium variem, dependendo das espécies bacterianas, em geral, a cultura é efetuada aproximadamente sob as seguintes condições; um teor de sólidos de leite desnatado de 5 a 30%, um teor de gordura do leite de 0 a 10 %, uma pressão osmótica de 1501000 mOsm, um pH de 4,0 a 7,0, uma concentração de oxigênio dissolvido de 0 a 2 ppm, e uma temperatura de cultura de 30-39 °C. As condições podem ser variadas dentro da faixa acima, ou as condições podem ser definidas fora da faixa acima. Além disso, as condições de armazenagem variam dependendo do tipo e da forma de uma calda de cultura ou um alimento ou bebida, por exemplo, a temperatura de armazenamento para alimentos e bebidas pode ser uma temperatura normal, uma temperatura de refrigeração, ou uma temperatura de congelamento. Assim, o fator ambiental e a condição de uma calda de cultura ou um alimento ou bebida para que as bactérias sejam aplicadas podem ser adequadamente selecionados e utilizados.
[029]Além disso, quando um xarope (edulcorante) é adicionado a uma calda de cultura para proporcionar um alimento ou bebida, vários tipos de açúcares serão utilizados. Nesse caso, a pressão osmótica pode ser aumentada ou diminuída de- pendendo do tipo de açúcar utilizado e, portanto, uma tal mudança na pressão os- mótica pode ser utilizada como a condição a ser variada.
[030]Além disso, quando um alimento ou bebida é armazenado num tanque de mistura durante um determinado período de tempo antes de ser depositado em um recipiente, a bebida ou alimento deve ser homogeneizada por agitação antes de ser introduzida em um recipiente. Nesse momento, o oxigênio no espaço de cabeça do tanque de mistura pode ser ocupado e a concentração do oxigênio dissolvido ser aumentada até a concentração de saturação em alguns casos. Assim, uma talmudança na concentração de oxigênio dissolvido pode ser utilizada como a condição a ser variada.
[031]Embora nenhuma limitação particular seja imposta com respeito ao tipo da bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium que pode ser usado no método de produção da presente invenção, os seus exemplos incluem Bifidobacterium breve, B. longum, B. bifidum, B. animalis, B. suis, B. infantis, B. adolescentis, B. catenu- latum, B. pseudocatenulatum, B. lactis, e B, globosum. Entre eles, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, e Bifidobacterium bifidum são preferíveis uma vez que têm sido usados em inúmeros produtos lácteos durante algum tempo e os dados relativos à segurança e semelhantes têm se acumulado e, além disso, essas bactérias exibem também um elevado efeito viabilidade-melhoria. Entre eles, Bifidobacte-rium breve é particularmente preferível.
[032]O uso das já mencionadas bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium como uma cepa-mãe, por repicagem alternadamente e armazenamento das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium pelo menos duas vezes em pelo menos dois tipos de sistemas em condições com diferentes fatores ambientais, as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo excelente viabilidade sob todas as condições utilizadas para a repicagem alternativa e de armazenamento podem ser obtidas. Especificamente, (1) as bactérias da cepa mãe pertencentes ao gênero Bifidobacterium são cultivadas sob fator ambiental A para desse modo obter uma calda de cultura ou um alimento ou bebida. A calda de cultura ou o alimento ou bebida assim obtido é armazenado tal que uma cepa apresentando aprimorada viabilidade sob as condições com o fator ambiental A é concentrada ou selecionada. (2) Depois disso, a cepa exibindo viabilidade melhorada é cultivada sob o fator ambiental B para obter deste modo uma calda de cultura ou um alimento ou bebida. A calda de cultura ou o alimento ou bebida assim obtido é armazenado de forma que uma cepa exibindo viabilidade melhorada sob as condições com o fator ambiental B é concentrada ou selecionada. (3) Os passos acima são repetidos pelo menos duas vezes, através do que as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium exibindo excelente viabilidade sob os fatores ambientais A e B podem ser obtidas.
[033]Um método de repicagem alternadamente e armazenagem, quando as condições são variadas com base nos fatores ambientais A e B, inclui a realização da repicagem alternativa e armazenar em qualquer combinação e da ordem tais como A ^ B ^ A ^ B ^ A e A ^ A ^ B ^ B ^ A ^ A ^ B ^ B ^ A ^ A ^ B ^ B, no entanto, a repicagem alternativa e armazenamento são preferivelmente realizados pelo menos duas vezes. É de preferência, realizada de 2 a 100 vezes, mais preferivelmente de 4 a 100 vezes, especialmente de preferência de 4 a 50 vezes.
[034]Pelo menos dois tipos de variações nas condições do fator ambiental podem ser definidos. Um método de repicagem alternativa e armazenamento em que três variações de condições, A, B, e C, que são definidas podem ser efetuadas de qualquer forma, por exemplo, A ^ B ^ C ^ A ^ B ^ C ^ A ^ B ^ C e A ^ A ^ A ^ B ^ B ^ C ^ A ^ B ^ B ^ B ^ C ^ C ^ A.
[035]O fator ambiental é preferivelmente alterado em pelo menos um tipo, adicionalmente pelo menos dois tipos, e particularmente pelo menos três tipos selecionados a partir de pH, pressão osmótica, a acidez, a temperatura da cultura, e um fator nutricional em termos de A e B. Aqui e estes fatores são de preferência modifi- cados na seguinte faixa; pH alterado de 0,1 para 3 entre 4,0 e 7,0, a pressão osmó- tica alterada por 10-700 mOsm entre 150 e 1000 mOsm, a acidez alterado por 1 a 20 entre 5 e 30, e a temperatura da cultura modificado por 1-6 °C entre 30 e 39 °C. Como o fator nutricional, é preferível alterar o tipo de açúcar a partir de xarope de maltose para palatinose reduzida. Além disso, o teor de gordura de leite é, preferivelmente, variado de 0,1 a 6% entre 0 e 10%. Além disso, um teor de sólidos de leite desnatado é preferivelmente variado de 0,1 a 20% entre 5 e 30%.
[036]Além disso, é também possível tratar a cepa de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium com um agente indutor de mutação e semelhantes, tais como raios ultravioleta, nitrosoguanidina (NTG), e acetato de metanossulfonato de etila (EMS), e submeter a cepa mãe tratada pelo agente indutor de mutação à repicagem e armazenamento alternativo já mencionados de modo a selecionar uma cepa bacteriana possuindo as qualidades desejadas.
[037]Nesse ponto, a viabilidade indica aproximadamente quantas bactérias vivas estão presentes em uma calda de cultura ou em um alimento ou bebida após armazenamento, e a contagem bacteriana viável pode ser obtida através de um mé-todo usual. Por exemplo, uma calda de cultura, ou de uma bebida ou alimento utilizado para o armazenamento é apropriadamente diluída e aplicada a um meio de ágar TOS propionato, seguido por cultura anaeróbica a 37 °C durante 72 horas. Em seguida, a contagem bacteriana viável pode ser obtida através da determinação das colônias formadas no meio. A viabilidade pode ser indicada com base na proporção da contagem bacteriana viável em uma calda de cultura, ou de uma bebida ou alimento utilizado para o armazenamento após armazenamento comparado com aquela antes do armazenamento.
[038]Qualquer meio em que as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium podem crescer, tal como um meio GAM, um meio MILS (Iwata e Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol. 9, 165-168, 1989), um meio TOS propionato, leite de soja, suco vegetal, suco de frutas, e mosto podem ser usados como uma calda de cultura no método de produção da presente invenção. No entanto, um meio contendo leite como um componente principal é preferível, e exemplos do leite incluem leite de vaca (leite integral) e um produto processado do mesmo tal como leite desnatado e um peptídeo derivado de leite. Um teor de sólidos e um teor de gordura do leite desnatado podem ser ajustados em quaisquer quantidades dependendo do material lácteo a ser usado e da sua quantidade de mistura, e um fator de crescimento da bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium tal como um extrato de levedura pode ser adicionada. Qualquer um destes teores de sólidos, teor de gordura do leite desnatado e o fator de crescimento da bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium podem ser um fator ambiental.
[039]Além disso, o fator ambiental dos alimentos e bebidas de leite fermentado obtidos pela adição de um opcional ingrediente tal como um xarope a uma calda de cultura contendo um meio lácteo é próximo daquele de um produto acabado; por isso, bactérias que exibem alta viabilidade num produto acabado podem ser mais eficientemente concentradas. Assim, os alimentos e bebidas lácteas fermenta-das são de preferência utilizados para a reprodução acima mencionada e melhoria da cepa bacteriana. Um ingrediente opcional, por exemplo, um xarope (edulcorante), tais como açúcares, um agente emulsionante, um agente espessante (um estabilizador), vitaminas e minerais podem ser adicionados aos alimentos e bebidas lácteas fermentadas, qualquer dos quais pode ser um fator ambiental. Exemplos do xarope incluem açúcares tais como sacarose, glicose, frutose, xarope de milho, xarope de glicose, frutose palatinose, trealose, lactose, xilose, açúcar de malte, mel, e melaço, álcool de açúcar tais como sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, palatinita, xarope de reduzido teor de açúcar, xarope de reduzido teor de açúcar de malte, um edulcorante altamente doce, tal como aspartame, taumatina, a sucralose, acesulfame-K, e stevia. Além disso, um agente emulsionante tal como um éster de ácido graxo de sacarose, um éster de glicerina de ácidos graxos, um éster de poliglicerina com o ácido graxo, um éster de ácido graxo de sorbitano e lecitina, um espessante (um estabilizador), tais como ágar, gelatina, carragenana, goma de guar, goma xantana, pectina, goma de alfarroba, goma de gelano, carboximetil celulose, polissacarídeo de soja, e algi- nato de propileno glicol podem ser adicionados aos alimentos e bebidas lácteas fer-mentadas. Além destes, vitaminas tais como vitamina A, vitamina Bs, vitamina C, vitamina D, e vitamina Es, minerais, tais como cálcio, magnésio, zinco, ferro e manganês, um acidificante, tal como ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, málico , ácido tartárico e ácido glucônico, um teor de gordura do leite, tais como creme, manteiga e creme de leite, sabores, por exemplo, iogurte, fruta, laranja, marmelo chinês, perilla, citros, maçã, menta, uva, damasco, pera, creme de leite, pêssego, melão, banana, os trópicos, erva, chá e café, um extrato da erva, e um extrato de açúcar mascavo, e semelhantes podem ser adicionados.
[040]Para a calda de cultura e os alimentos ou bebidas à base de leite fermentado, microrganismos outros que as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium também podem ser usados em combinação. Exemplos do microrganismo incluem bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus, tais como Lactobacillus casei, L. acidophilus, L. plantarum, L. buchneri, L. gallinarum, L. amylovorus, L. brevis, L. rhamnosus, L. kefiri, L. paracasei, L. curvatus, L. zeae, L. helveticus, L. salivarius, L. gasseri, L. fermentum, L. reuteri, L. crispatus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, e L. johnsonii, as bactérias pertencentes ao gênero Streptococcus, tais como Streptococcus thermophilus, bactérias pertencentes ao gênero, tais como Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cre- moris, as bactérias pertencentes ao gênero, tais como Enterococcus faecalis e E. faecium, bactérias pertencentes ao gênero Bacillus tais como Bacillus subtilis, leveduras pertencentes às gênero Saccharomyses, Torulaspora, e Cândida tais como Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, e Cândida kefyr.
[041]Os alimentos e bebidas fermentadas podem ser produzidos de acordo com um método comum. Por exemplo, quando da produção de alimentos e bebidas lácteas fermentadas, a cepa-mãe de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium é inoculada em um meio lácteo esterilizado, sozinha ou em combinação com outros microrganismos, e cultivada, sendo o produto resultante submetido a tratamento de homogeneização para produzir o leite fermentado.Subsequentemente, uma solução de xarope separadamente preparada é adicionada e misturada, e o produto resultante é homogeneizado utilizando um homogeneizador e semelhantes, e um sabor é posteriormente adicionado para se preparar o produto final.
[042]Pelo método acima mencionado, usando Bifidobacterium breve YIT 4125 (FERM BP-7813) como a cepa-mãe, uma cepa de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium exibindo viabilidade particularmente excelente sob as condições de diferentes fatores ambientais foi produzida. A cepa bacteriana assim obtida foi depositada como Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) na International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki) em fevereiro, 16, 2010. Bifidobacterium breve YIT 12272 tem as seguintes características bacteriológicas, em comparação com a sua cepa-mãe, Bifidobacterium breve YIT 4125. Tabela 1: Morfologia e características da célula bacteriana da colônia
Figure img0001
[043]As células bacterianas de cada cepa foram cultivadas em meio de MILS acrescido de ágar (Iwata e Morishita, Carta em Applied Microbiology, vol. 9, 165-168, 1989) a 37 °C sob condições anaeróbicas (Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.)) e uma única colônia foi pega no meio de gelose (isolamento colônia única). Este processo de isolamento de colônia única foi repetido para purificar uma cepa bacteriana. Em seguida, a morfologia bacteriana (cultura no meio MILS durante a noite, seguido por coloração de Gram) e as características da colônia (cultura em meio de ágar) da cepa bacteriana purificada foram analisadas. Tabela 2: Resultados do teste de características de fermentação por API 50
Figure img0002
Figure img0003
+: Fortemente positivo (+): Fracamente positivo -: Negativo ±: fracamente positivo negativo ou retardado
[044]De acordo com o manual de API 50CH (o produto da bioMerieux Japão), cada suspensão bacteriana após cultura durante a noite foi inoculada em meio contendo cada substrato e, em seguida, anaerobicamente cultivada a 37 °C durante sete dias. Depois disso, a característica de fermentação para cada substrato foi determinada.
[045]Nenhuma limitação particular é imposta sobre a forma de utilização das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção, e as bactérias liofilizadas podem ser utilizadas ou um produto de cultura da bactéria pode ser também utilizado.Todavia, em qualquer das formas, as bactérias estão preferivelmente vivas.
[046]As bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção podem ser misturadas com um veículo farmacêutico não tóxico sólido ou líquido e utilizadas sob a forma de uma preparação farmacêutica convencional. Exemplos da preparação incluem uma preparação sólida tal como um comprimido, um grânulo, pó, e uma cápsula, uma preparação líquida tal como uma solução, uma suspensão, e uma emulsão, e uma preparação liofilizada. Estas preparações podem ser preparadas por um método comum utilizado na tecnologia de preparação farmacêutica. Exemplos de veículos farmacêuticos não tóxicos incluem glicose, lactose, sacarose, amido, manitol, dextrina, glicerídeo de ácido graxo, polieti- leno glicol, hidroxietilamida, etileno glicol, polioxietileno-sorbitano ésteres de ácidos graxos, aminoácidos, gelatina, água, albumina, e solução salina fisiológica. Além disso, um aditivo convencional, tal como um estabilizador, um umectante, um agente emulsionante, um ligante, um agente de regulação de tonicidade, e um diluente po- dem ser adequadamente adicionados conforme necessário.
[047]As bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção podem ser não apenas preparadas como uma preparação farmacêutica como descrito acima, mas também usadas pela adição aos alimentos e bebidas. Quando adicionadas a alimentos e bebidas, as bactérias podem ser adicionadas sozinhas ou em conjunto com vários ingredientes nutricionais. Especificamente, quando da adição das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção a alimentos e bebidas, um aditivo que é utilizável em alimentos e bebidas pode ser adequadamente utilizado, e os alimentos e bebidas podem ser moldados numa forma adequada para consumo, especificamente um grânulo, um grão, um comprimido, uma cápsula, uma pasta, e semelhantes por meios convencionais. Além disso, as bactérias podem ser adicionadas a vários produtos alimentares, por exemplo, um produto de carne processada tal como presunto e embutidos, um produto pescal processado tal como polpa de peixe cozida (kamaboko) ou embutido de peixe (chikuwa), pão, manteiga, produtos de confeitaria, e leite em pó, ou as bactérias podem ser também adicionadas a bebidas, tais como água, suco de fruta, leite, um refrigerante e de uma bebida de chá. É de notar que os alimentos e bebidas também incluem a alimentação animal.
[048]As bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção podem ser aplicadas a diferentes tipos de alimentos e bebidas de diferentes ambientes, e devido à sua alta viabilidade em alimentos e be-bidas, as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium podem exibir de forma eficaz sua função fisiológica geral, como uma ação de regulação do intestino. Além disso, a melhoria das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium que possuem naturalmente um efeito fisiológico específico, tal como ação de erradicação da bactéria Helicobacter pylori através do método de produção da presente invenção, permite a utilização da cepa bacteriana em diversos alimentos e bebidas. Isto au- menta a palatabilidade dos alimentos e bebidas que contêm a cepa bacteriana, e ao mesmo tempo amplia a escolha do consumidor. Além disso, a melhoria da viabilidade da cepa bacteriana pode aumentar o efeito fisiológico da cepa bacteriana.
[049]Além disso, a alimentos e bebidas são de preferência utilizados como alimentos e bebidas fermentadas, tais como alimentos e bebidas lácteas fermentadas, fermentado de leite de soja, suco de fruta fermentado, e fermentado de suco vegetal contendo bactérias vivas pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção. Entre eles, os alimentos e bebidas lácteas fermentadas são preferivelmente empregues. Estes alimentos e bebidas lácteas fermentadas podem ser produzidos por um método comum, e podem ser produzidos pelo método acima mencionado. Os alimentos e bebidas lácteas fermentadas assim obtidas podem também ser fornecidos como um produto sob a forma de qualquer de um tipo simples sem xarope (um adoçante), um tipo macio, um tipo de fruto com sabor, sólido, líquido e semelhantes.
[050]Além disso, a presente invenção refere-se a alimentos e bebidas contendo as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção, particularmente os alimentos lácteos e bebidas fermentadas que contêm um edulcorante. O tipo, o método de produção, e a forma dos alimentos e bebidas lácteas fermentadas podem ser semelhantes aos descritos acima. É preferível produzir alimentos e bebidas lácteas fermentadas, utilizando uma combinação das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção e pelo menos um tipo de bactéria selecionada a partir de bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus, bactérias pertencentes ao gênero Streptococcus, e as bactérias pertencentes ao gênero Lactococcus porque alta palatabilidade é conseguida, e isso permite ingestão contínua.
[051]Além disso, os alimentos e bebidas preparadas usando as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium, um recipiente constituído por um material de embalagem impermeável ao oxigênio tal como o vidro, papel revestido de alumínio, tem sido usado principalmente para a finalidade de aumentar a viabilidade das bactérias durante armazenamento. No entanto, pelo fato das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium obtidas pelo método da presente invenção não exigirem uma estrita condição anaeróbica devido à sua alta viabilidade, resina altamente permeável a oxigênio (tal como poliestireno, polietileno, e polietileno tereftalato) pode também ser utilizada como um material para o recipiente. Um recipiente feito de uma tal resina tem méritos de baixo custo e elevada flexibilidade na formação, em comparação com um recipiente constituído por um material de embalagem imper-meável à oxigênio.
[052]Um fragmento de DNA e um iniciador da presente invenção têm uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência. O iniciador fragmento de DNA da presente invenção pode ser obtido através da realização de PCR em DNA derivado a partir de numerosas bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium e bactérias relacionadas e pesquisando através do método de RAPD. Isto é, PCR é realizado em DNA derivado a partir de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium utilizando numerosos iniciadores randômicos para amplificar um fragmento de DNA encaixado entre os iniciadores randômicos. Com base no padrão de bandas de RAPD assim obtido, a clonagem é realizada e a sequência de nucleotí- deos do Bifidobacterium breve YIT 12272 específica do produto de amplificação por PCR é determinada (SEQ ID NO: 3). O iniciador do fragmento de DNA da presente invenção é projetado com base na sequência de nucleotídeos assim determinada (SEQ ID NOS: 1 e 2). O iniciador de fragmento de DNA da presente invenção inclui um iniciador de fragmento de DNA possuindo uma sequência de nucleotídeos complementar da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1 ou 2.
[053]Para o iniciador da presente invenção, uma combinação de duas se- quências de nucleotídeos representada por SEQ ID NOs: 1 e 2, ou uma combinação de duas sequências de nucleotídeos complementares às sequências é mais preferencialmente utilizada. Além disso, é preferível utilizar um iniciador possuindo uma sequência de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar à sequência como um iniciador direto e um iniciador possuindo uma sequência de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência complementar à sequência como um iniciador reverso.
[054]O iniciador da presente invenção é específico para a Bifidobacterium breve YIT 12272, e útil para a detecção, quantificação da contagem de bactérias, e quantificação da contagem bacteriana viável para a Bifidobacterium breve YIT 12272. Exemplos de uma amostra para o método de detecção e quantificação da presente invenção incluem os alimentos e bebidas, produtos farmacêuticos, e fezes contendo YIT 12272.
[055]Exemplos do método de detectar e quantificar YIT 12272 incluem as etapas de (1) extração DNA de uma amostra, (2) realizar reação de PCR utilizando o iniciador do presente invento, e (3) detecção do fragmento de DNA amplificado pela etapa (2).
[056]Em mais detalhes, primeiramente, o DNA é extraído a partir de fezes, alimentos, bebidas, e semelhantes, tal como uma amostra para a PCR. Como um método de extração de DNA a partir de uma solução diluída de fezes e semelhantes, o método de Marmur, que é o método padrão, um método de enzimas que é o método de Marmur modificado, e um método de cloreto de benzila são os preferíveis. Além disso, uma amostra obtida por suspensão de algumas das células bacterianas em um tampão ou água esterilizada, seguido por aquecimento a 95 °C durante aproximadamente 15 minutos, pode ser fornecida como um molde para PCR.
[057]Um fragmento de DNA alvo (produto de PCR) pode ser obtido efetuando a reação de amplificação utilizando uma combinação de DNA assim extraído e do iniciador da presente invenção. Geralmente, quando se utiliza um iniciador em PCR e semelhantes, é preferível utilizar um par de tipos de iniciadores. Por exemplo, pelo uso de um conjunto iniciador constituído de iniciadores possuindo sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1 e 2, apenas uma região encaixada entre os iniciadores no DNA do Bifidobacterium breve YIT 12272 pode ser amplificada em meio aos demais outros numerosos tipos de bactérias que estejam presentes, por meio do que a bactéria pode ser identificada. Além disso, quando da realização de PCR, a quantificação das bactérias alvo também é possível mediante submeter o modelo DNA a uma diluição serial antecipadamente para descobrir o limite de detecção e em seguida a análise similar é conduzida.
[058]O DNA assim obtido pode ser submetido à eletroforese, e o Bifidobacterium breve YIT 12272 pode ser identificado com base na presença ou ausência de uma banda.
[059]Além disso, somente as bactérias vivas da Bifidobacterium breve YIT 12272 podem ser detectadas e quantificadas através da realização de reação de PCR em uma amostra pós tratados com um corante permeável a membrana. Exemplos de um corante permeável a membrana a ser utilizada incluem monoazida de monoazida de etídio (EMA), e monoazida de propídio (PMA), e a monoazida de pro- pídio (PMA) é particularmente preferível. O tratamento de uma amostra de membrana permeável a corante é efetuada através de, por exemplo, adicionando uma solução de corante permeável em membrana possuindo uma concentração final de 5250 μM, seguido por irradiação de luz. Reação de PCR pode ser realizada em um modo idêntico ao acima mencionado.
Exemplos
[060]A seguir, o conteúdo da presente invenção será descrito mais detalhadamente com os Exemplos; todavia, a presente invenção não se limita de forma alguma a estes Exemplos. Exemplo 1 - Reprodução e melhoria de Bifidobacterium breve YIT 10001 e 4125 YIT pelo método de repicagem alternada
[061]Utilizando cepa Bifidobacterium breve YIT 10.001 (FERM BP-8205) e cepa Bifidobacterium breve YIT 4125 cepa (FERM BP-7813) como a cepa-mãe, a alternada repicagem e concentração da bactéria é conduzida. (1)Após a esterilização de 20,7% de meio lácteo em pó integral a 135 °C durante 3,5 segundos, 0,5% de semeadura de partida 1 de cepa Bifidobacterium breve YIT 10.001 ou cepa YIT 4125 e 1% de uma semeadura de partida Bifidobacterium bifidum foram inoculadas e, em seguida, co-cultivadas a 33 °C até que o pH atingisse 5,3, pelo que uma suspensão bacteriana A1 (400 mL) foi preparada. (2)na suspensão bacteriana A1, solução de xarope A foi misturada a 10% da concentração final de palatinose, pelo que o produto lácteo A1 (630 mL) foi preparado. O produto lácteo A1 (200 mL) foi distribuído em frascos de 300 mL, seguido de armazenamento a 5 °C durante uma semana sob agitação (90 rpm), sob condições aeróbicas com um tampão de algodão (daqui em diante abreviado como armazenamento em agitação aeróbica). Em seguida, os tubos de ensaio foram preenchidos com o produto lácteo A1 resultante e fechados com tampão butílico, seguido por armazenamento estático a 10 °C durante uma semana sob condições anaeróbicas, daqui em diante abreviado como armazenamento estático anaeróbico). (3)O produto lácteo A1 (1 mL) armazenado sob as condições acima foi inoculado em 10 mL de um meio lácteo acrescido de cefalotina (12% de leite desnatado, extrato de levedura 0,1%, 0,03% de cloridrato de L-cisteína, 0,2% de carbonato de cálcio sedimentar, e 5 cefalotina μg/mL, daqui em diante abreviado como um meio lácteo acrescido de cefalotina), seguido por cultura anaeróbica a 37 °C durante 24 horas, em que matriz de partida 2 de Bifidobacterium breve foi obtida. A matriz de partida 2 (0,03 mL) foi inoculada em 30 mL de um meio lácteo (12% de leite desnatado, extrato de levedura 0,1%, 0,03% de cloridrato de L-cisteína, carbonato de cálcio 0,2% sedimentar, daqui em diante abreviado como um meio lácteo), seguido por cultura anaeróbica a 37 °C durante 24 horas, em que as semeaduras de partida 2 de Bifidobacterium breve foram preparadas. Operações semelhantes como acima foram repetidas utilizando a semeadura de partida 2. Isto é, A2 produto lácteo preparado usando a semeadura de partida 2 foi submetido à armazenagem aeróbica sob agitação, seguido de armazenagem anaeróbica estática, onde matriz de partida 3 de Bifidobacterium breve, e ainda mais, semeaduras de partida 3 de Bifidobacterium breve foram preparadas. (4)Em seguida, um meio lácteo 23,5% desnatado foi esterilizado a 120 °C durante 3,5 segundos, e 2% da semeadura de partida 3 de Bifidobacterium breve e 0,01% de semeadura de partida Lactococcus lactis foram inoculadas e, em seguida, misturados e em co-cultivadas a 37 °C até que o pH atingisse 4,4, pelo que a suspensão bacteriana B1 (100 mL) foi preparada. (5)Além disso, a um meio lácteo 19,7% desnatado que foi esterilizado a 120 °C durante 3,5 segundos, 0,08% de peptídeo de leite foi adicionado, e, em seguida, 0,5% de semeadura de partida Streptococcus thermophilus foi inoculado e cultivado a 37 °C até que o pH atingisse 4,3, pelo que a suspensão bacteriana C1 (700 mL) foi preparada. A suspensão bacteriana C1 foi adicionada à suspensão bacteriana B1’ (relação de mistura 1:2), e ainda, solução xarope B foi misturada a 5% da concentração final do xarope de reduzido teor de maltose, pelo que o produto lácteo B1 (870 mL) foi preparado. (6)De forma semelhante ao produto lácteo A1, o produto lácteo B1 (1 mL) foi submetido a armazenamento sob agitação aeróbica, seguido de armazenamento estático anaeróbico, e, em seguida, inoculado em 10 mL de meio lácteo acrescido de cefalotina, seguido por cultura anaeróbica a 37 °C durante 24 horas para fornecer a matriz de partida 4 de Bifidobacterium breve. A matriz de partida 4 (0,03 mL) foi inoculada em 30 mL do meio lácteo, seguido por cultura anaeróbica a 37 °C durante 24 horas, em que as semeaduras de partida 4 de Bifidobacterium breve foram prepa- radas. As operações semelhantes como acima foram repetidas utilizando a semeadura de partida 4. Isto é, o produto lácteo B2 preparado com a semeadura de partida 4 foi submetido a armazenamento sob agitação aeróbica, seguido de armazenamento estático anaeróbico, em que a matriz de partida 5, e ainda mais, semeaduras de partida 5 de Bifidobacterium breve foram preparadas.
[062]Como mostrado acima, a preparação, armazenamento sob agitação ae- róbica, e armazenamento estático anaeróbico do produto lácteo A foram repetidos duas vezes. Posteriormente, utilizando sobrevivente Bifidobacterium breve, a preparação, armazenamento sob agitação aeróbica, e armazenamento estático anaeróbi- co do produto lácteo B foram repetidos duas vezes e o Bifidobacterium breve foi concentrado. Uma série dos passos acima foi definida como um ciclo, que foi repetido para um total de quatro ciclos. Finalmente, o produto lácteo A8 e produto lácteo B8 foram submetidos a armazenamento estático anaeróbico a 10 °C durante duas semanas e, em seguida, uma porção (1 mL) de cada produto foi aplicado a um meio de ágar TOS propionato (Yakult Indústria Pharmaceutical Co., Ltd. ) contendo 5 μg/mL de cefalotina e a cultura anaeróbica foi conduzida a 37 °C usando Anaero Pack (gás Mitsubishi Chemical Company, Inc.) para isolar colônia única. O isolamento da colônia única foi repetido para purificação, pelo que colônias únicas de um total de 42 cepas derivadas da cepa Bifidobacterium breve YIT 10.001 e cepa YIT 4125, especificamente um total de 21 amostras de produto lácteo A8 e um total de 21 amostras de produto lácteo B8, foram isolados.
Exemplo 2 - Ensaio de Confirmação de Viabilidade
[063]Usando a cepa-mãe e as cepas isoladas, os produtos lácteos A e B foram uns preparados e armazenados sob agitação a 5 °C durante uma semana sob condições aeróbicas, seguido de armazenagem estática a 10 °C durante duas semanas sob condições anaeróbicas em conformidade com o método do Exemplo 1. Em seguida, cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 (derivado de cepa YIT 4125, iso- lada a partir do produto lácteo A8), que exibiu excelente viabilidade em ambos os produtos lácteos A e B, foi selecionada.
[064]Os resultados da viabilidade da cepa YIT 12272 e cepa controle (cepa YIT 10001 e cepa YIT 4125) nos produtos lácteos A e B são apresentados na Tabela 3. Com respeito à cepa YIT 12272, 3 x 107 UFC/mL ou mais células vivas sobreviveram após armazenamento sob agitação a 5 °C durante uma semana sob condições aeróbicas, seguidos por armazenamento estático a 10 °C durante duas semanas sob condições anaeróbicas em ambos os produtos lácteos A e B. Em contraste, em produtos lácteos, A e B preparados usando cada bactéria de controle, 3 x 107 UFC/mL ou mais células vivas sobreviveram em um dos produtos lácteos, no entanto, as bactérias de controle não exibiram viabilidade excelente em ambos os produtos.
[065]Além disso, as propriedades físicas do produto lácteo A e B são apresentadas na Tabela 4. Xarope A foi misturado em suspensão bacteriana A para preparar produto lácteo A, do qual o pH e a acidez foram descobertos serem de 5,6 e 3,4, respectivamente. Embora a pressão osmótica da suspensão bacteriana A fosse 550 mOsm, ela foi aumentada para 950 mOsm no produto lácteo A. Enquanto isso, a suspensão bacteriana C e o xarope B foram misturados na suspensão bacteriana B de modo a preparar o produto lácteo B, do qual o pH e a acidez foram descobertos serem de 4,4 e 7,5, respectivamente. Embora a pressão osmótica da suspensão bacteriana B fosse de 900 mOsm, ela foi diminuída para 600 mOsm no produto lácteo B.
[066]Como mostrado acima, foi revelado que a viabilidade da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi melhorada, em comparação com a cepa de controle, em ambos os produtos lácteos A e B, os quais diferiam na temperatura da cultura, no pH, na acidez, uma mudança na pressão osmótica devido à mistura de xarope, um teor de sólidos do leite desnatado, e um teor de gordura do leite. Tabela 3: Contagem bacteriana viável de cepa Bifidobacterium breve YIT
Figure img0004
[067]A contagem bacteriana viável foi determinada com um meio de ágar contendo 5 μg/mL de cefalotina após armazenamento sob agitação a 5 °C por uma semana sob condições aeróbicas, seguido por armazenagem estática sob condições anaeróbicas a 10 °C durante duas semanas. Tabela 4: Propriedades físicas dos produtos lácteos A e B
Figure img0005
[068]A pressão osmótica foi medida com Osmotat OM-6040 fabricado por Kyoto Daiichi Kagaku.
Exemplo 3 - Ensaio de confirmação para a resistência contra suco gástrico artificial
[069]Cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 e cepa controle (cepa YIT 10001 e cepa YIT 4125) foram cultivadas cada uma anaerobicamente durante a noite a 37 °C no meio lácteo. Em seguida, 0,5 mL da cultura bacteriana assim obtida foi adicio-nado a 10 mL de suco gástrico artificial, que tinha sido aquecido a 37 °C durante 30 minutos, imediatamente misturado e, em seguida incubadas a 37 °C. A 0 minutos e 120 minutos após a incubação (tratamento por suco gástrico artificial), 1 mL da mistura foi recolhido e apropriadamente diluído, e depois disso a contagem bacteriana viável foi determinada utilizando um meio de ágar TOS propionato (cultura anaeróbi- ca Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd., a 37 °C).
[070]O suco gástrico artificial foi preparado como se segue. Isto é, as seguintes substâncias foram dissolvidas em água de troca iônica tal que a concentração final de cada uma das substâncias foi; peptona proteose (Becton, Dickinson e Co.): 5 g/L, mucina gástrica (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) : 1,5 g/L, cloreto de sódio: 5 g/L de bicarbonato de sódio: 3 g/L, e diidrogenofosfato de potássio: 1 g/L. O pH da solução resultante foi ajustado para 2,8 com ácido clorídrico 3,6 N, e a solução assim obtida foi esterilizada em autoclave a 115 °C durante 15 minutos, e, em seguida, armazenada a 4 °C. Subsequentemente, a pepsina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi dissolvida em água de troca iônica a 400 mg/L, e a solução resultante foi esterilizada por filtração através de um filtro de membrana (DISMIC-25CS, Advantec, 0,45 μm) para produzir uma solução de pepsina. O pH da solução foi reajustado a 2,8, e 20 mL da solução de pepsina foi adicionada à 180 mL da solução preparada como acima logo antes do uso, pelo que o suco gástrico artificial foi preparado.
[071]As contagens viáveis bacterianas em 0 minutos e 120 minutos após o tratamento com suco gástrico artificial são mostrados na Tabela 5. Embora a contagem bacteriana viável de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 quase não se alterou mesmo após 120 minutos após o tratamento com suco gástrico artificial, a contagem bacteriana viável da cepa controle (YIT cepa 10001 e YIT cepa 4125) foi diminuída pelo tratamento. Foi revelado que a resistência da cepa YIT 12272 contra suco gástrico artificial foi também melhorada, em comparação com a cepa de controle. Tabela 5: Resistência da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 contra o suco gástrico artificial
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Figure img0007
Exemplo 4 - Ensaio de confirmação para a resistência contra o tratamento sequencial com o suco gástrico artificial/bílis artificial e fluido intestinal
[072]Usando a cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 e a cepa controle (cepa YIT 10001 e cepa YIT 4125), o produto lácteo B foi preparado de forma semelhante ao Exemplo 1. O produto lácteo B (200 mL), preparado usando cada cepa bacteriana foi dispensado em frascos de 300 mL, seguido de armazenamento a 5 °C durante uma semana enquanto se agita (90 rpm), sob condições aeróbicas com um tampão de algodão. Subsequentemente, os tubos de ensaio foram preenchidos com o resultante produto lácteo B, seguido de armazenagem estática a 10 °C sob condições anaeróbicas com um tampão de borracha butílica. É de notar que apenas a fase gasosa de um balão de 300 mL contendo o produto lácteo B preparado usando a cepa YIT 4125 foi substituído por nitrogênio gasoso, e, em seguida, o produto resultante foi armazenado a 5 °C durante uma semana enquanto se agita (90 rpm), sob condições anaeróbicas com uma tampa de borracha butílica, seguido de armazenamento estático a 10 °C em condições anaeróbicas.
[073]De forma semelhante ao método do Exemplo 3, o tratamento do suco gástrico artificial foi realizado por adição de 0,5 mL do produto B do leite, que tinha sido submetido a armazenagem estática em 10 °C durante quatro dias a 10 mL de suco gástrico artificial ajustada para pH de 3,3, seguido de incubação a 37 °C durante 60 minutos. A 2 mL da solução de ensaio assim obtida, 1 mL de bílis artificial, que tinha sido aquecida a 37 °C antecipadamente foi adicionada, seguido imediatamente por agitação. Subsequentemente, à mistura assim obtida, uma mistura de 5 mL de 4 mL de fluido intestinal artificial e 1 mL de fluido pancreático artificial, que tinha sido aquecidos a 37 °C durante 30 minutos, foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada e incubada a 37 °C. Em seguida, a 0 minutos e 60 minutos após o tratamento suco gástrico artificial e 60 minutos após a bílis artificial e de tratamento de fluido intestinal, 1 mL da mistura resultante foi recolhida de cada vez, e apropriadamente diluída, e a contagem bacteriana viável foi determinada usando um meio ácido agar TOS propionato (cultura anaeróbica Yakult Indústria Pharmaceutical Co., Ltd., a 37 °C).
[074]A bílis artificial foi preparada por dissolução de pó de bílis (Oxgall, Disco) em água de troca iônica, a 40 g/L e ajustando o pH da solução resultante a 8,0 com carbonato de sódio 3 M, e em seguida diluindo a solução resultante com água de troca iônica de modo que a concentração do pó de bílis foi de 1% (p/v), seguido por esterilização por autoclave a 121 °C durante 15 minutos. A bílis artificial assim preparada foi usado. Além disso, o fluido intestino artificial foi preparado por dissolução dos seguintes substâncias em água de permuta de íons de modo que a concentração final de cada substância foi, cloreto de sódio: 5 g/L, cloreto de potássio: 1 g/L, e bicarbonato de sódio: 3 g/L, e ajustando o pH da solução resultante a 8,0 com carbonato de sódio 3 M, seguido por esterilização por autoclave a 121 °C durante 15 minutos. O fluido pancreático artificial foi preparado por dissolução da lipase pan- creática (Biomedicals MP) no fluido intestinal artificial a 20 g/L, imediatamente antes do teste, e a solução resultante foi esterilizada por filtração através de um filtro de membrana (DISMIC-25CS, Advantec 0,45 μm), seguido por armazenagem em gelo. O fluido pancreático artificial assim preparado foi usado.
[075]A contagem bacteriana viável em 0 minutos e 60 minutos após o tratamento de suco gástrico artificial, e 60 minutos após o tratamento com bílis artificial e fluido intestinal é mostrada na Tabela 6. A contagem bacteriana viável de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 no produto lácteo B armazenado foi maior que aquela da cepa controle (cepa Bifidobacterium breve YIT 10.001 e cepa YIT 4125), não so- mente após o tratamento de suco gástrico artificial, mas também após o tratamento sequencial com o suco gástrico artificial e fluido intestinal contendo bílis artificial. Foi revelado que a cepa YIT 12272 foi mais reforçada para ambas a resistência do suco gástrico artificial e a resistência ao fluido bílis/intestinal artificial que o apresentado pela bactéria controle. Tabela 6: Resistência da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 no produto lácteo B contra o tratamento sequencial com suco gástrico artificial/bile artificial e fluido intestinal após armazenamento
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[076]O produto lácteo foi armazenado sob agitação a 5 °C durante uma se- mana sob condições aeróbicas (apenas a cepa YIT 4125 foi armazenada sob condições anaeróbicas), seguido por armazenamento durante quatro dias a 10 °C sob condições anaeróbicas, e depois tratado com suco gástrico artificial (pH 3,3), e sequencialmente com bílis artificial (1% pó de bílis). A contagem bacteriana viável foi avaliada no produto lácteo B assim obtido. Exemplo 5 - Produção de alimentos e bebidas lácteas fermentadas
[077]Em 506 g de água, 124 g de leite em pó integral foi dissolvido, seguido por esterilização a 135 °C durante 3 segundos. Subsequentemente, 0,5% de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272, 1% de Bifidobacterium bifidum, e 0,001% de Lactobacillus acidophilus foram inoculados e cultivados a 33 °C até que o pH atingisse 5,3. A mistura resultante foi homogeneizada a 15 MPa para produzir 630 g de uma suspensão bacteriana. Enquanto isso, 98 g de palatinose, 8 g de suco de cenoura, 2,5 g de óleo contendo DHA, 7 g de cálcio emulsionado, 0,1 g de lactoferrina, 0,02 g de vitamina D, e 1 g de sabor foram dissolvidos em água, e água lhe foi adicionada a um volume total de 370 g. A mistura resultante foi esterilizada a 120 °C durante três segundos para produzir uma solução de xarope. A suspensão bacteriana, e a solução de xarope foram misturadas e, em seguida, vertidas num recipiente do tipo tetra brick, através do que um produto lácteo possuindo: pH de 5,6; acidez de 3,4; teor de sólidos do leite desnatado de 8,7% e conteúdo de gordura do leite de 3,2% foi obtida (a contagem bacteriana inicial da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi de 9,5 x 108 UFC/mL).
[078]O produto lácteo fermentado assim obtido foi armazenado a 10 °C durante 14 dias, em que a taxa de sobrevivência da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi encontrada como sendo 30%. Além disso, o produto lácteo fermentado assim obtido tinha excelente paladar.
Exemplo 6 - Produção de alimentos e bebidas lácteas fermentadas
[079]Em 90 g de água, 25 g de leite em pó sem gordura foi dissolvido, seguido por esterilização a 120 °C durante 3,5 segundos. Subsequentemente, 2% de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 e 0,01% de Lactococcus lactis foram inoculadas e cultivadas a 37 °C até que o pH atingisse 4,4. A mistura resultante foi homo-geneizada a 15 MPa para produzir 115 g de suspensão bacteriana A. Além disso, 60 g de leite em pó sem gordura e 0,25 g de peptídeo de leite foram dissolvidos em água, e água foi adicionada a um volume total de 330g. A mistura resultante foi esterilizada a 120 °C durante 3,5 segundos, e 0,5% de Streptococcus thermophilus foi inoculado. As bactérias foram cultivadas a 37 °C até que o pH atingisse 4,3 e, em seguida a mistura resultante foi homogeneizada a 15 MPa para produzir 330 g de suspensão bacteriana B. Enquanto isso, 47 g de maltitol, 29 g de polidextrose, 14 g de xarope de galactooligossacarídeo , 3,5 g de ferro emulsionado, 3 g de pectina, 1 g de peptídeo colágeno, 0,3 g de mistura de vitaminas B, e 0,1 g de aspartame fo- ram dissolvidos em água, 1 g de sabor e 1 g de óleo de vitamina E foram ainda adicionados, e, em seguida, foi adicionada água para o volume total a 555 g. A mistura resultante foi esterilizada a 120 °C durante três segundos para produzir uma solução de xarope. As suspensões bacterianas A e B e a solução de xarope foram misturadas e, em seguida, vertidas para um recipiente do tipo tetra brick, através do qual um produto lácteo fermentado com: pH de 4,4; acidez de 7,5; teor de sólidos do leite desnatado de 8,1% e conteúdo de gordura do leite de 0,1 % foi obtido (a contagem bacteriana inicial de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi de 8,8 x 108 UFC/mL).O produto lácteo fermentado assim obtido foi armazenado a 10 °C durante 16 dias, no qual a taxa de sobrevivência da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi encontrada ser 34%. Além disso, o produto lácteo fermentado assim obtido tinha excelente paladar.
Exemplo 7 - Produção de alimentos e bebidas lácteas fermentadas
[080]Em 198 g de água, 58 g de leite em pó sem gordura foi dissolvido, seguido por esterilização a 120 °C durante 3,5 segundos. Subsequentemente, 1% de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272, 0,2% de Lactococcus lactis, e 0,01% de Streptococcus thermophilus foram inoculadas e cultivadas a 37 °C até que o pH atingisse 4,5. A mistura resultante foi homogeneizada a 15 MPa para produzir 256 g de suspensão bacteriana. Enquanto isso, 25 g de xarope de galactooligossacarídeo, 16 g de lactitol, 16 g de palatinose, 3 g de pectina, e 0,05 g de sucralose foram dissolvidos em água, e 1 g de sabor e de água foram ainda adicionados ao volume total a 744 g. A mistura resultante foi então esterilizada a 120 °C durante três segundos para produzir uma solução de xarope. A suspensão bacteriana e a solução de xarope foram misturadas e, em seguida, vertidas para um recipiente do tipo tetra brick, segundo o qual uma bebida láctea fermentada possuindo; pH de 4,4: acidez de 5,3; teor de sólidos do leite desnatado de 5,5% e conteúdo de gordura do leite de 0,1% foi obtida (a contagem bacteriana inicial de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi de 1,3 x 109 UFC/mL).
[081]A bebida láctea fermentada assim obtida foi armazenada a 10 °C durante 23 dias. Como resultado, a taxa de sobrevivência da cepa Bifidobacterium breve 12272 YIT foi encontrada ser 41%.Além disso, a bebida láctea fermentada assim obtida tinha excelente paladar.
Exemplo 8 - Produção de alimentos e bebidas lácteas fermentadas
[082]58 g de leite em pó integral, 42 g de leite desnatado, e 0,02 g de peptí- deo de leite foram dissolvidos em 487 g de água, seguido por esterilização a 135 °C durante três segundos. Na mistura resultante, os iniciadores de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 e Lactobacillus acidophilus foram inoculadas por cada 0,5% e 1,0%, respectivamente. A mistura resultante foi, então, cultivada a 33 °C até que o pH atingisse 5,3 e, em seguida homogeneizada a 15 MPa para produzir 587 g de uma suspensão bacteriana.
[083]Enquanto isso, 98 g de palatinose, 8 g de suco de cenoura, e 1 g de sabor foram dissolvidos em água, e a água foi ainda adicionada a um volume total de 413 g. A mistura resultante foi esterilizada a 120 °C durante três segundos para produzir uma solução de xarope.
[084]A suspensão bacteriana e a solução de xarope foram misturadas e, em seguida, vertida para um recipiente do tipo tetra brick, em que um produto lácteo fermentado com: pH de 5,6; acidez de 2,9; teor de sólidos do leite desnatado de 8,1% e conteúdo de gordura do leite de 1,4% foi obtido (a contagem bacteriana inicial de cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi de 9,5 x 108 UFC/mL).
[085]O produto lácteo fermentado assim obtido foi armazenado a 10 °C durante 14 dias, e a taxa de sobrevivência da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 foi encontrada como sendo 30%. Além disso, o produto lácteo fermentado assim obtido tinha excelente paladar.
Exemplo 9 - Produção de comprimidos
[086]Cada um dos ingredientes indicados abaixo foi misturado em conformidade com a seguinte formulação, e a mistura resultante foi submetida à granulação, secagem, e ajuste do tamanho dos grânulos, seguido de tabletagem, em que foram produzidos comprimidos.
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1Produzida pela liofilização da célula bacteriana viva da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272.
Exemplo 10 - Produção de refrigerantes
[087]Cada um dos ingredientes indicados abaixo foi misturado em conformidade com um método comum com base na formulação seguinte. A mistura resultante foi homogeneizada para produzir refrigerantes. Os refrigerantes assim obtidos fo-ram colocados em frascos castanhos e selados com uma tampa de alumínio, seguido por tratamento térmico. Os refrigerantes assim obtidos foram favoráveis tanto na aparência externa e sabor, e também teve boa estabilidade de armazenamento.
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1Produzido pela liofilização da célula bacteriana viva da cepa Bifidobacterium breve YIT 12272. Exemplo 11 - Produção de um iniciador específico de cepa bacteriana pelo método DNA polimórfico de amplificação randômica (RAPD)
[088]Usando 62 cepas de bactérias pertencentes a Bifidobacterium breve, o DNA foi extraído da célula bacteriana e o método de RAPD foi aplicado através da realização de PCR, em conformidade com o procedimento seguinte para pesquisar uma sequência de nucleotídeos específica para YIT 12272.
(1)Extração de DNA a partir de células bacterianas
[089]Sessenta e duas cepas de bactérias pertencentes à Bifidobacterium breve (Bifidobacterium breve YIT 4014T, YIT 4015, YIT 4023, YIT 4024, YIT 4043, YIT 4049, YIT 4063, YIT 4064, YIT 12272, e 53 outras cepas) foram cultivados utilizando um GAM médio (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), suplementado com 1% de glicose, durante 24 horas a 37 °C em condições anaeróbicas. A suspensão bacteria- na (0,5 mL) foi centrifugada, um sobrenadante foi removido, e 0,25 mL de um tampão de extração de DNA (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA, pH 9,0), 0,05 mL de SDS a 10%, 0,5 mL de TE-fenol saturado, e 0,7 g de pérolas de vidro (diâmetro de 0,1 mm) foram adicionados. A mistura foi agitada vigorosamente para romper a célula bacteriana. Em seguida, 0,15 mL de acetato de sódio 3 M foi adicionado e a mistura foi centrifugada, e um sobrenadante foi transferido para tubos de outros. Após precipitação com isopropanol e lavagem com etanol a 70%, o produto assim obtido foi seco ao ar e, por último dissolvido em 0,1 mL de um tampão TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM).
(2) Método RAPD
[090]O método RAPD foi realizado usando 27 tipos de iniciadores randômi- cos (Tabela 7). Um líquido de reação tinha um volume total de 20 μL contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), KCl 50 mM, 1,5 mM MgCl2, 200 μM de mistura dNTP, 1,5 μM iniciador randômico, 1,5 U de Taq DNA polimerase (o produto de Takara Bio Inc.), e 10 ng de modelo DNA. As reações de PCR foram realizadas usando termoci- clador de DNA PTC200 (MJ Research, Inc.), na qual a reação de PCR incluiu as seguintes etapas; 94 °C durante 120 segundos, seis ciclos de (94 °C durante 20 segundos, 36 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 90 segundos), 30 ciclos de (94 °C durante 20 segundos, 36 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 90 segundos), e 72 °C durante 180 segundos. O produto de amplificação assim obtido foi submetido à eletroforese a 50 V em um gel de agarose 1,5%. Em seguida, o gel foi corado com brometo de etídio para confirmação sob irradiação UV. Tabela 7: Sequência de um iniciador randômico para método RAPD
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(3) Clonagem
[091]Comparando padrões de bandas de RAPD de 62 cepas de bactérias pertencentes à Bifidobacterium breve, um produto de amplificação de PCR, que foi descoberto ser específico para YIT 12272 foi clonado utilizando kit de clonagem TA (produto da Invitrogen Corporation), em conformidade com o manual anexo.Isto é, o produto de amplificação de PCR foi inserido num vetor pCR2.1 e introduzido em E. coli para a transformação. Em seguida, a E.coli transformada foi inoculada em um meio ágar Luria Bertani (LB) contendo X-gal e 50 μg/mL de ampicilina e cultivado. Em seguida, as bactérias formadoras de colônias brancas assim obtidas foram proliferadas no meio líquido LB, e a partir daí, DNA foi extraído para obter o DNA clona- do. De acordo com o método padrão, a sequência de nucleotídeos DNA do produto de amplificação de PCR foi determinada por um método terminador de corante (Figura 1). (4) Produção de um iniciador específico de cepa bacteriana e confirmação da sua especificidade
[092]Entre as sequências de nucleotídeos DNA do produto de amplificação por PCR específico para YIT 12272 obtida por clonagem, uma sequência que foi mais específica para YIT 12272 e tinha alta reatividade PCR foi selecionada para produzir um iniciador 12272 YIT específico. A sequência do iniciador foi mostrada na Tabela 8. Usando este iniciador 12272 YIT específico, PCR foi realizada em DNA extraído de um total de 144 cepas bacterianas incluindo 62 cepas bacterianas das bactérias pertencentes à Bifidobacterium breve e 82 cepas de 78 espécies de 12 gêneros de bactérias frequentemente isoladas do trato intestinal humano (Tabela 9) para confirmar a especificidade. Usando uma mistura de reação com um volume to-tal de 20 μL contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 μM de mistura dNTP, 0,3 μM iniciador, 0,5 U de Taq DNA polimerase, e 10 ng de modelo DNA, as reações de PCR foram realizadas, na qual a reação de PCR incluiu os seguintes passos; 94 °C durante 120 segundos, 32 ciclos de (94 °C durante 20 segundos, 60 °C durante 10 segundos, e 72 °C durante 20 segundos), e 72 °C durante 180 segundos. O produto de amplificação assim obtido foi submetido à eletroforese a 100 V em um gel de agarose 1,5%. Em seguida, o gel foi corado com brometo de etídio para confirmação sob irradiação UV. Como resultado, o iniciador YIT 12272 específico assim produzido foi confirmado como sendo específico para Bifidobacterium breve YIT 12272. Tabela 8: Sequência do iniciador YIT 12272 específico (pBbrY)
Figure img0012
Tabela 9: Cepa bacteriana utilizada
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Exemplo 12 - Detecção de YIT 12272 viva pelo método de PCR
(1) Otimização de um corante permeável à membrana
[093]Monoazida de etídio (EMA), e de monoazida de propídio (PMA), que eram corantes permeáveis à membrana, foram usados para Bifidobacterium breve YIT 12272. Usando um meio líquido com GAM + 1% glicose, a cada um dos YIT 12272 não tratados que tinham sido cultivadas durante 24 horas a 37 °C sob condi- ções anaeróbicas (bactérias vivas), as células mortas obtidas dos mesmos por aquecimento das bactérias a 80 °C durante 10 minutos, ou células mortas das mesmas obtidas por cultura contínua das bactérias durante 10 dias a 37 °C, o corante foi adicionado em concentrações finais de EMA e PMA de 240 μM e 50 μM, respectivamente. Depois de manter quente durante cinco minutos à temperatura ambiente, as bactérias foram irradiadas com luz durante dois minutos, utilizando duas lâmpadas halógenas de 500 W, a uma distância de 20 cm abaixo da lâmpada. Posteriormente, o DNA foi extraído de cada uma das células bacterianas, e YIT 12272 foi quantificada por PCR quantitativo utilizando o iniciador 12272 YIT específico.(Como um método de PCR quantitativo, o método descrito em International Journal of Food Microbiology (2008) vol. 126, p. 210-215 foi usado.) Como resultado, embora ambos EMA e PMA inibissem a amplificação PCR em células bacterianas mortas, EMA também inibiu a amplificação PCR em bactéria vivas. Com base no fato de que PMA inibiu a amplificação PCR em YIT 12272 viva, foi descoberto que PMA foi adequado para a detecção e quantificação de YIT 12272 por PCR quantitativo. [FIG. 2]
[094]A fim de otimizar o tratamento por PMA, PCR quantitativo foi realizado utilizando o iniciador YIT 12272 específico, e bactérias vivas e células bacterianas mortas por calor de YIT 12272 tratadas com várias concentrações de PMA (5 μM, 50 μM, e 150 μM) e tempo de irradiação de luz (um, dois e cinco minutos). Como resultado, verificou-se que o tempo de irradiação de luz não influencia o tratamento PMA, e que o tratamento com baixa concentração (5 μM) e concentração elevada (150 μM) de PMA exibiu um fraco efeito inibitório sobre a amplificação por PCR na célula bacteriana morta por calor, comparado ao tratamento com 50 μM de PMA (FIG. 3). Assim, verificou-se que o tratamento com 50 μM de PMA e dois minutos de irradiação de luz foi adequado para o tratamento de PMA a ser aplicado em YIT 12272. (2) Detecção e quantificação de YIT 12272 vivo nas fezes
[095]Fezes nas quais a ausência de YIT 12272 foi confirmada por um meio seletivo e PCR quantitativo utilizando o iniciador YIT 12272 específico foi preparado. Para as fezes, células bacterianas de YIT 12272 mortas por calor foram acrescentadas, seguida pelo tratamento PMA 12272 foram adicionados, seguido pelo tratamento PMA (50 μM de PMA e dois minutos de irradiação de luz). Como resultado, verificou-se que a amplificação por PCR em células bacterianas de YIT 12272 mortas por calor nas fezes foi inibida, e o valor quantitativo das bactérias mortas de YIT 12272 foi reduzido para cerca de 1-20 milésimos (FIG. 4). Em contraste, YIT 12272 vivas que tinham sido cultivadas durante 24 horas foram adicionadas às fezes e o tratamento PMA foi realizado, e YIT 12272 foi quantificada por PCR quantitativo utilizando o iniciador específico para YIT 12272. Como resultado, o tratamento PMA não inibiu a amplificação por PCR em YIT 12272 viável, resultando que, quando YIT 12272 está presente numa quantidade de 105 ou mais por grama de fezes, YIT 12272 viável pode ser quantificada com exatidão (FIG. 5). Nesse ponto, a contagem bacteriana viável de YIT 12272 pode ser calculada pela fórmula 3 seguinte. Valor do PCR quantitativo de YIT 12272 sem tratamento PMA: células X/g Valor do PCR quantitativo de YIT 12272 submetido a tratamento PMA: células Y/g A contagem bacteriana viável de YIT 12272 em uma amostra: células L/g A contagem bacteriana morta de YIT 12272 em uma amostra: células D/g Fórmula 1: X = L + D Fórmula 2: Y = L + D/20000 Fórmula 3: (a fórmula 3 é derivada das fórmulas 1 e 2): L = (20000Y - X)/19999
[096]O método seguinte foi utilizado para a extração do DNA a partir de fezes. Usando uma solução de diluição anaeróbica (Tabela 10), uma solução 10-vezes diluída de fezes foi preparada. Em seguida, 0,2 mL da solução foi centrifugada e um sobrenadante foi removido, seguido por ressuspensão em 1,0 mL de um tampão PBS. A operação de lavagem acima foi repetida três vezes. Posteriormente, o pellet de fezes assim obtido foi armazenado a -80 °C até a extração do ácido nucleico. O sedimento liofilizado de fezes foi descongelado, e ao mesmo 0,6 mL de um tampão ASL (QIAGEN) foi adicionado, seguido por aquecimento a 70 °C durante cinco minutos. Subsequentemente, 0,5 mL de fenol TE-saturado e 0,7 g de pérolas de vidro com um diâmetro de 0,1 mm foram adicionados, e a mistura resultante foi vigorosamente agitada a 6,5 m/s durante 30 segundos usando FastPrep FP120 (Bio101, Inc.). Em seguida, 0,1 mL de acetato de sódio 3 M foi adicionado e um sobrenadante foi obtido por centrifugação. A 0,7 mL de sobrenadante, 0,7 mL de um tampão ASL e tabletes de Inhibit EX (Qiagen) foram adicionados. A mistura resultante foi bem misturada e centrifugada para se obter um sobrenadante. A 0,55 mL de sobrenadante, 0,55 mL de um tampão AL (QIAGEN) e 0,55 mL de etanol a 100% foram adiciona-dos, seguido por agitação. Subsequentemente, toda a mistura resultante foi passada através de coluna spin QIAmp (QIAGEN) para permitir ao DNA adsorver à coluna. Após lavagem da coluna, 0,1 mL de um tampão AE (QIAGEN) foi adicionado e a solução resultante foi centrifugada, pelo que o DNA foi coletado. Tabela 10 - Composição da solução anaeróbica de dissolução
Figure img0014
(3) Detecção e quantificação de YIT 12272 vivo nas fezes em um teste de ingestão oral
[097]Foi realizado um estudo em que os adultos saudáveis que tinham sido impedidos de consumir produtos alimentícios contendo bactéria vivas por três sema- nas foram submetidos à ingestão de uma embalagem (100 mL) de produto lácteo fermentado do Exemplo 6 (contendo YIT 12272 em uma quantidade de 1010,5/embalagem) diariamente, continuamente por 10 dias.
[098](3-1) Detecção de YIT 12272 vivo mediante uma combinação de meio seletivo e do iniciador específico para YIT 12272
[099]As fezes foram recolhidas a partir dos indivíduos antes e após a ingestão do produto lácteo fermentado contendo YIT 12272 do Exemplo 6 e submetidas a uma diluição de 10 vezes em série usando um tampão de diluição (PBS). A partir da solução resultante, 100 μL foi aplicado a um meio YIT 12272-seletivo (T-CBPC, Tabela 11), seguido por cultura anaeróbica a 37 °C durante 72 horas para formar colônias. As colônias assim obtidas foram anaerobicamente cultivadas a 37 °C durante 24 horas em um meio líquido GAM adicionado de 1% de glicose (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), pelo que as células bacterianas foram obtidas. O DNA foi extraído a partir das células bacterianas, e PCR foi efetuado utilizando o DNA assim obtido como um modelo e o iniciador específico para YIT 12272.Além disso, parte das cepas bacterianas foram submetidas à identificação da cepa bacteriana pelo teste de RAPD. Como resultado, as respostas de identificação do YIT 12272 por ambos os métodos acima foram perfeitamente compatíveis. Até agora, para determinar uma colônia formada no meio seletivo como YIT 12272, era necessário um demorado e complexo ensaio RAPD e ELISA (Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay) utilizando um anticorpo monoclonal YIT 12272 específico. Todavia, foi demonstrado que o uso do iniciador específico para YIT 12272 permitiu a rápida e simples determinação de YIT 12272. Tabela 11 - Composição de meio seletivo YIT 12272 (T-CBPC) Componente Composição (/L)
Figure img0015
[0100]A fim de detectar YIT 12272 vivo nas fezes recolhidas a partir dos indivíduos antes e após a ingestão do produto lácteo fermentado contendo YIT 12272 do Exemplo 6, pelotas dissolvidas de fezes foram suspensas em 0,5 mL de PBS, e a elas 1,4 μL de uma solução 20 mM PMA foi adicionada (concentração final de 50 μM). A mistura resultante foi agitada suavemente e armazenada no escuro durante cinco minutos. Subsequentemente, a mistura foi irradiada com luz intensa durante dois minutos, utilizando uma lâmpada de halogênio e centrifugou-se, e um sobrena- dante foi removido. O DNA foi extraído a partir das fezes tratadas com PMA, e YIT 12272 vivo nas fezes foi quantificada através da combinação de PCR quantitativo utilizando o iniciador específico para YIT 12272. Além disso, a contagem bacteriana total de YIT 12272 incluindo células mortas nas fezes foi quantificada simultaneamente sem tratamento PMA. Os resultados assim obtidos são mostrados na Tabela 12 conjuntamente com UFC de YIT 12272 obtidos usando um meio seletivo de ágar T-CBPC. YIT 12272 não foi detectada em fezes recolhidas a partir dos indivíduos antes de ingerir o produto lácteo fermentado contendo YIT 12272 seja pelo método de cultura ou pó PCR usando o iniciador específico para YIT 12272. Em contraste, o número total (viável e mortos) de B. breve YIT 12272 detectado por qPCR sem tratamento PMA foi 108,1 ± 0,8, B. breve YIT 12272 viável detectado por qPCR com o tratamento com PMA foi de 107,5 ± 1,0, e 106,9 ± 1,5 UFC de YIT 12272 foi detectada usando meio seletivo cepa-específico, por grama de fezes coletadas a partir dos indivíduos que completaram a ingestão. Além disso, devido ao fato do valor quantitativo das células bacterianas mortas tratadas com PMA obtidas por PCR ter sido suficientemente pequeno, a contagem de YIT 12272 calculada pela fórmula 3 foi igual à contagem bacteriana obtida por PCR quantitativo após tratamento PMA (Tabela 12). Por conseguinte, foi confirmado que o uso do tratamento PMA e PCR quantitativo permitiu a determinação da contagem bacteriana viável de YIT 12272. Tabela 12 - Contagem bacteriana de YIT 12272 em fezes coletadas dos in divíduos antes e após a ingestão de produto lácteo contendo YIT 12272
Figure img0016
a)O limite de detecção de YIT 12272 by PCR quantitativo é de 105 células/grama de fezes e aquele pelo método de cultura é 102 UFC. b)se qualquer amostra estivesse presente abaixo do limite de detecção, um valor médio e S.D da amostra eram calculados com base na contagem bacteriana do limite de detecção.
[0101]Até agora, um método de detectar e quantificar YIT 12272 nas fezes era realizado mediante permitir que a bactéria formasse uma colônia no meio seletivo, e um teste para a confirmação de uma colônia como YIT 12272 exigia trabalho e tempo consideráveis. Além disso, considerando que o meio seletivo contém uma alta concentração de antibiótico, a possibilidade de que bactérias danificadas possam não sofrer divisão, para o que YIT 12272 vivo é subestimada, é apontado. O PCR quantitativo utilizando o iniciador específico para YIT 12272 da presente invenção permite a quantificação da totalidade de YIT 12272 nas fezes, independentemente de estar vivo ou morto. Além disso, apenas YIT 12272 vivo nas fezes poderia ser rapidamente e simplesmente quantificado mediante combinação PMA, que é um corante permeável na membrana.
Exemplo 13 - Teste de recuperação da bactéria ingerida
[0102]Dezenove adultos saudáveis na faixa dos vinte aos cinquenta anos foram divididos aleatoriamente em dois grupos, e após sete dias de observação (período de observação), os indivíduos ingeriram uma embalagem (100 mL) de um ou outro produto lácteo fermentado preparado usando cepa YIT 12272 (bebida teste) ou um produto lácteo fermentado preparado usando cepa YIT 10001 em vez de YIT 12272 (bebida de controle), ambos os quais foram produzidos em conformidade com o método descrito no Exemplo 6, diariamente durante sete dias (período de ingestão 1). Após 10 dias de interrupção (período de interrupção), os indivíduos que ingeriram tanto a bebida do teste ou a bebida de controle foram misturados e a ingestão foi ainda continuada durante sete dias (período de ingestão 2). As fezes foram recolhidas no dia seguinte ao dia final do período de observação, cada um dos períodos de ingestão, e o período de interrupção. É de notar que os indivíduos estavam proibidos de ingerir quaisquer produtos lácteos fermentados ou outros produtos probióticas além da bebida de teste ou da bebida de controle durante o período de teste. Além disso, as contagens bacterianas do Bifidobacterium na bebida de teste e na bebida de controle foram 6,8 a 8,9 x 108 UFC/mL e 2,9 a 4,2 x 108 UFC/mL, respectivamente.
[0103]De acordo com o Exemplo 12, usando o meio seletivo ágar T-CBPC, a UFC das bactérias ingeridas nas fezes (cepa YIT 12272 ou cepa 10001 YIT) foi obtida. Usando o método RAPD ou o iniciador específico para a cepa YIT 12272, como mostrado na Tabela 8, um ensaio qualitativo da cepa bacteriana foi conduzido.
[0104]Embora as bactérias ingeridas não fossem detectadas nas fezes coletadas provenientes dos indivíduos antes da ingestão do produto lácteo fermentado, as contagens bacterianas das bactérias ingeridas no grupo de ingestão da bebida de teste e no grupo de ingestão da bebida controle após ingestão foi de 7,3 ± 0,8 Log UFC/g, e 5,9 ± 1,1 log UFC/g, respectivamente, mostrando que a contagem de bac- térias foi significativamente maior no grupo de ingestão da bebida de teste do que no grupo de ingestão da bebida controle (Tabela 13). É de notar que nenhum evento adverso associado tanto com a ingestão da bebida de teste ou da bebida controle foi observado durante o período de estudo. Tabela 13 - Contagem bacteriana da bactéria ingerida, nas fezes
Figure img0017
##:p<0.01Comparado com o grupo de ingestão da bebida controle (dois grupos independentes t-teste) ND:Abaixo do limite de detecção (102 UFC)
[0105]Foi revelado que, pela ingestão do presente produto lácteo fermentado, ambas a cepa 12272 YIT e cepa YIT 10001 foram coletadas vivas a partir de fezes, no entanto, a contagem de bactérias da cepa YIT 12272 foi significativamente maior do que a da cepa YIT 10001. Considerou-se que este resultado refletiu que a cepa YIT 12272 tinha viabilidade favorável em um produto, e ao mesmo tempo a sua resistência contra o suco gástrico artificial e bílis artificial/fluido intestinal foi aumentada.
Exemplo 14 - Teste Ação 1 regulador intestinal
[0106]Um teste aberto foi realizado em 57 indivíduos de 63 anos ou mais que sofriam de prisão de ventre ou tendência a constipação (três a cinco vezes de movimento de evacuação/semana, teor de água das fezes de menos de 70%, 27 machos e 30 fêmeas, com idade média de 68,7 ± 5,4) ingerida, após duas semanas do período de observação, uma embalagem (100 mL) do produto lácteo fermentado descrito no Exemplo 8 ao dia durante quatro semanas. Na semana final do período de observação e do período de ingestão, a condição de movimento intestinal e a propriedade das fezes (escala de fezes Bristol) foram examinadas. É de notar que os indivíduos ficaram proibidos de ingerir quaisquer produtos lácteos fermentados ou outros produtos probióticas que não o presente produto lácteo fermentado durante o período de teste. Além disso, a contagem bacteriana do Bifidobacterium no presente produto lácteo fermentado foi de 1 x 108 UFC/mL ou mais.
[0107]Em comparação com antes da ingestão, o número de movimentos intestinais, o número de dias com movimento intestinal, e a quantidade de fezes foram significativamente aumentados após a ingestão. Além disso, a pontuação na Escala de fezes Bristol foi significativamente melhorada, e as fezes duras foram normalizadas (Tabela 14). É de notar que nenhum evento adverso associado com a ingestão do presente produto lácteo fermentado foi observado durante o período de teste. A partir dos resultados acima, foi confirmado que o presente produto lácteo fermentado teve uma ação reguladora dos intestinos. Tabela 14 - Condição do movimento intestinal e propriedades das fezes durante o período de observação e o período de ingestão
Figure img0018
Exemplo 15 - Teste Ação 2 regulador intestinal
[0108]Um teste de comparação de grupo paralelo duplo cego controlado por placebo foi conduzido, no qual 75 estudantes do sexo feminino com tendência à constipação (com idade entre 18 a 23, com cinco ou menos movimentos intesti- nais/semana) ingeriram, após quatro semanas de período de observação, uma embalagem ( 100 mL) de um ou outro o produto lácteo fermentado como descrito no Exemplo 6 (grupo de teste), ou uma bebida placebo (leite fermentado sem bactérias, galactooligossacarídeo e polidextrose, o grupo placebo) por dia durante quatro se-manas. Na semana final do período de observação e do período de ingestão, a condição de movimento intestinal e da propriedade das fezes (a escala de fezes Bristol) foram examinadas. É de notar que os indivíduos foram proibidos de ingerir quaisquer produtos lácteos fermentados ou outros produtos probióticos além do presente leite fermentado ou da bebida placebo durante o período de estudo. Além disso, a contagem de bactérias Bifidobacterium no presente produto lácteo fermentado foi de 1 x 108 UFC/mL ou mais.
[0109]Quarenta e quatro indivíduos cujos teores de água nas fezes foram menores que 70% foram analisados (Tabela 15). Como resultado, verificou-se que o grupo de teste apresentou uma tendência de movimentos intestinais mais frequentes durante o período de ingestão comparado com o grupo placebo (p = 0,081). Embora nenhuma alteração fosse observada no número de dias com movimento intestinal entre o período de ingestão e o período de observação no grupo do placebo, ele aumentou significativamente no grupo de teste durante o período de ingestão em comparação com o período de observação, e foi significativamente maior no grupo de teste em comparação com o grupo placebo durante o período de ingestão. Embora a pontuação na propriedade fecal não tenha se alterado no grupo de placebo durante o período de ingestão em comparação com o período de observação, a pontuação aumentou significativamente no grupo de teste, indicando uma melhorada pro- priedade fecal. Além disso, durante o período de ingestão, o grupo de teste apresentou uma tendência de ter uma maior pontuação para a propriedade fecal (P = 0,070) em comparação com o grupo placebo. É de notar que nenhum evento adverso associado com a ingestão do presente produto lácteo fermentado ou da bebida placebo foi observado durante o período de estudo. A partir dos resultados acima, foi confirmado que o presente produto lácteo fermentado tinha uma ação reguladora intestinal. Tabela 15 - Condição do movimento intestinal e propriedades das fezes du-rante o período de observação e o período de ingestão
Figure img0019
1:Com base na Escala de Fezes Bristol, as fezes foram avaliadas em uma escala de 1 a 7: (1) grumos separados, (2) dura, (3) rachaduras na superfície, (4) superfície lisa, (5) semissólida, (6) lamacenta, e (7) líquida. *: p<0,05Comparado com o período de observação (relacionado a dois grupos teste-t ou Teste de somatório de pontuação atribuído a Wilcoxon) #: p<0,05Comparado com o grupo placebo (dois grupos independentes, teste-t) a: p=0,081Comparado com o grupo placebo (dois grupos independentes, teste-t) b: p=0,070Comparado com o grupo placebo (Teste de somatório de pontuação atribuído a Wilcoxon) Exemplo 16 - Teste sobre uma ação inibitória sobre a produção de um produto de putrefação
[0110]Um teste de comparação de grupo paralelo duplo cego controlado por placebo foi conduzido, no qual 39 mulheres saudáveis com idades entre vinte a setenta foram divididas em dois grupos tal que ambos os grupos foram equiparados em termos de idade, altura, peso corporal e IMC, e após quatro semanas de período de observação, ingeriram uma embalagem (100 mL) de um ou outro do produto lácteo fermentado do Exemplo 6 (grupo de teste), ou de uma bebida placebo (leite fermentado sem bactérias, galactooligossacarídeo e polidextrose, um grupo placebo) por dia durante quatro semanas. Na semana final do período de observação e do período de ingestão, o sangue foi coletado dos braços dos indivíduos. É de notar que os indivíduos foram proibidos de ingerir quaisquer produtos lácteos fermentados ou outros produtos probióticos além do presente leite fermentado ou da bebida placebo durante o período de teste. Além disso, a contagem bacteriana do Bifidobacterium no presente leite fermentado foi de 1 x 108 UFC/mL ou mais.
[0111]Soro foi preparado a partir do sangue assim obtido de acordo com o método usual, o qual foi armazenado congelado a -80 °C. Em seguida, 25 μL do soro, 475 μL de água Milli-Q, 200 μL de ácido clorídrico, e 10 μL de uma solução padrão interno (obtida por diluição de 4-clorofenol (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. ) 300 vezes, com acetato de etila (Sigma)) foram agitados e misturados, e a mistura resultante foi aquecida a 100 °C durante 60 minutos num tubo de ensaio selado. Após resfriamento, 2 mL de éter dietílico foi adicionado à mistura resultante seguido por agitação, e 1 mL da camada de éter dietílico resultante foi recolhida e misturada com 1 mL de metanol contendo 0,05 N hidróxido de sódio. A mistura resultante foi secada para ser solidificada com um evaporador centrífugo e, em seguida, dissolvida em 200 μL de acetato de etila. A mistura resultante foi filtrada através de um filtro de 0,45 μm (Ultrafree-MC, Millipore Corporation), por meio do que uma amostra para HPLC foi preparada. Além disso, 25 μL de uma solução obtida por diluição de paracresol (Nacalai Tesque, Inc.) a 0 a 0,01% com acetato de etila, 675 μL de acetato de etila, e 10 μL da solução de padrão interno foram misturados e providos como uma solução padrão. Uma análise por HPLC de para-cresol foi conduzida sob as condições seguintes. Sistema HPLC: Alliance 2695 (Waters Corporation) Detector: Detector de fluorescência 260 nm, Ex Ev 305 nm (utilizando um detector de UV de 270 nm em combinação) Coluna: coluna L 4,6 x 150 mm, um diâmetro de partícula de 5 μm (Chemical Evaluation and Research Institute) Temperatura da coluna: 40 °C Eluente: % A; ácido fosfórico 0,1%, B%; acetonitrila, % A /% B = 80/20 (iso- crático) Vazão: 1,0 mL/min Volume de injeção: 10 μL Temperatura da câmara de amostra: 10 °C Tempo de medição: 30 minutos
[0112]Embora a concentração de para-cresol no sangue após a ingestão não tenha se alterado em comparação com antes da ingestão no grupo placebo, a concentração diminuiu significativamente no grupo de teste. Além disso, foi significativamente menor no grupo de teste em comparação com aquela do grupo de placebo (Tabela 16). É de notar que nenhum evento adverso associado tanto com a ingestão do presente produto lácteo fermentado ou da bebida placebo foi observado durante o período de teste. Tabela 6 - Concentração de para-cresol no sangue antes e após ingestão
Figure img0020
*:p<0,05Comparado com antes da ingestão (dois grupos relacionados teste-t) #:p<0,05Comparado com o grupo placebo (dois grupos independentes teste-t)
[0113]Os resultados acima mostraram que a ingestão do presente leite fermentado diminuiu a concentração sanguínea de um produto putrefação intestinal (para-cresol), que era uma substância biologicamente tóxica produzida pelas bactérias intestinais. Isto foi considerado como sendo um resultado da inibição da produção para-cresol no intestino devido a um ambiente de melhoria da ação intestinal. Isto é, o presente leite fermentado foi considerado como possuindo um ambiente de melhoria da ação intestinal.
Aplicabilidade industrial
[0114]O método para a produção de bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium da presente invenção permite a aquisição das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo excelente viabilidade, mesmo sob condições com diferentes fatores ambientais. Esta cepa bacteriana pode ser aplicada a diversos alimentos e bebidas, e devido à sua alta viabilidade em alimentos e bebidas, as bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium podem exigir eficazmente as suas funções fisiológicas. Além disso, uma cepa bacteriana que é utilizável em vários alimentos e bebidas pode ser produzida através da melhoria das bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium possuindo um efeito fisiológico específico, tal como uma ação antibacteriana Helicobacter pylori pelo método de produção da presente invenção; e, portanto, a presente invenção tem uma aplicabilidade industrial extremamente alta.

Claims (9)

1. Bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é Bifidobacterium breve YIT 12272 que tem número de acesso FERM BP-11320.
2. Alimento ou bebida CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium, como definida na reivindicação 1.
3. Alimento ou bebida, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o alimento ou bebida é um alimento ou bebida fermentado, tal como um alimento ou bebida de leite fermentado.
4. Alimento ou bebida, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende um adoçante.
5. Uso de um fragmento de DNA que consiste em uma sequência de nucleo- tídeos representada pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para detectar ou quantificar Bifidobacterium breve YIT 12272 que tem número de acesso FERM BP-11320.
6. Uso de um conjunto de iniciadores que consistem em uma combinação de duas sequências de nucleotídeos representadas pelas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para detectar ou quantificar Bifidobacterium breve YIT 12272 que tem número de acesso FERM BP-11320.
7. Método para detecção de Bifidobacterium breve YIT 12272 que tem número de acesso FERM BP-11320, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende extrair DNA de uma amostra, realizar uma reação de PCR pelo uso da amostra e do iniciador, como definido na reivindicação 6, e detectar um fragmento de DNA amplificado.
8. Método para quantificação de uma contagem bacteriana de Bifidobacterium breve YIT 12272 que tem número de acesso FERM BP-11320, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende extrair DNA de uma amostra, rea- lizar uma reação de PCR pelo uso da amostra e do iniciador, como definido na reivindicação 6, e detectar um fragmento de DNA amplificado.
9. Método para quantificação de uma contagem bacteriana viável de Bifidobacterium breve YIT 12272 que tem número de acesso FERM BP-11320, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende realizar uma reação de PCR pelo uso de uma amostra tratada com um corante permeável à membrana e o iniciador, como definido na reivindicação 6.
BR112012020975-2A 2010-02-24 2011-02-21 bactéria pertencente ao gênero bifidobacterium, alimento ou bebida, usos de um fragmento de dna e de um conjunto de iniciadores e métodos para a detecção e quantificação da dita bactéria BR112012020975B1 (pt)

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