MX2012009799A

MX2012009799A - Metodo para construir una nueva bacteria perteneciente al genero bifidobacterium.

Info

Publication number: MX2012009799A
Application number: MX2012009799A
Authority: MX
Inventors: Yasuhisa Shimakawa; Koichi Watanabe; Tomoyuki Sako; Mika Miura; Koji Miyazaki; Junji Fujimoto
Original assignee: Yakult Honsha Kk
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2012-09-12
Also published as: AR081151A1; CN102770528A; US8889120B2; TW201142019A; EP2540816A1; ES2526414T3; AU2011218925A1; MY158274A; CA2790414C; BR112012020975A2; AU2011218925B2; CA2790414A1; US20120329059A1; JPWO2011105335A1; NZ601532A; BR112012020975B1; EP2540816A4; HK1174952A1; CN102770528B; TWI495722B

Abstract

Se proporcionan un método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan excelente viabilidad incluso bajo varias condiciones con diferentes factores ambientales, nuevas bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método, y un método para detectar las bacterias; mediante el subcultivo y el almacenamiento de bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium alternadamente en sistemas bajo condiciones con diferentes factores ambientales, se pueden producir las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que exhiban excelente viabilidad bajo todas las condiciones usadas para el subcultivo y almacenamiento alternados.

Description

MÉTODO PARA CONSTRUIR UNA NUEVA BACTERIA PERTENECIENTE AL GÉNERO BIFIDOBACTERIUM CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un método para producir bacterias nuevas pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método, bacterias nuevas pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas por dicho método y un método para detectar las bacterias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium son bacterias importantes en la flora bacterial intestinal humana y son conocidas por tener efectos benéficos en la salud humana, tales como regulación de la función intestinal, por ejemplo, mejoramiento de estreñimiento y diarrea, supresión de un incremento en el colesterol sérico, e inmunoestimulación. Para esto, varios productos comerciales conteniendo las bacterias perteneciente al género Bifidobacterium están disponibles en las formas de varios alimentos y bebidas fermentados, preparaciones probióticas y similares. Particularmente, los alimentos y bebidas lácteas fermentadas tienen excelente palatabilidad; por lo tanto, son adecuados para ingestión continua de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium.

Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium son anaerobias obligadas y susceptibles al oxígeno, bajo pH y acidez alta. Así, hay muchas dificultades en el manejo de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium en alimentos y bebidas lácteas fermentadas en términos de proliferación durante la producción, viabilidad durante el almacenamiento y similares. Para obtener el efecto fisiológico de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, se considera necesario administrar las bacterias vivas en el intestino en la mayor cantidad posible. Particularmente, el incrementar la viabilidad de las bacterias en alimentos y bebidas, es decir, la tasa de arribo de bacterias ingeridas en el intestino, se considera como un factor importante.

Para resolver los problemas anteriores, se ha hecho un intento para mejorar la viabilidad en alimentos y bebidas lácteas fermentadas mediante el mejoramiento del método de producción y agregando varios agentes mejoradores de viabilidad, tales como N-acetil glucosamina, ácido pantoténico, péptidos, y lactulosa. Sin embargo, dicho agente mejorador de viabilidad para las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium no puede ser fácilmente agregado porque esto no sólo incrementa el costo de producción sino que también causa problemas tales como una reducción de la palatabilidad. Además, también se estudia un método en el que se bloquean por completo las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium para evitar su contacto con oxígeno mediante el depósito de un producto fermentado conteniendo las bacterias en un contenedor compuesto de un material de empaque impermeable al oxígeno después de que el producto es producido. Sin embargo, ningún contenedor perfecto impermeable al oxígeno está disponible todavía. Además, no hay mucha flexibilidad en el moldeado de dicho contenedor, y la eliminación de desechos es complicada debido a que el contenedor se hace usando materiales compuestos. Además, el contenedor mismo es caro, etc. Como se mencionó anteriormente, hay muchas limitaciones en el uso del contenedor.

De acuerdo con esto, una solución fundamental para mejorar la viabilidad de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium en alimentos y bebidas fermentados es producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan alta viabilidad incluso bajo condiciones aeróbicas y bajo condiciones de bajo pH y acidez alta. Ejemplos de dicha cepa bacterial incluyen Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205) (Documento de Patente 1 ), Bifidobacterium breve SBR 3212 (FERM P-11915) (Documento de Patente 2), y Bifidobacterium bifidum YIT 4002 (FERM BP-1038) (Documento de Patente 3).

Sin embargo, ha habido un problema en el sentido de que se espera que estas cepas con viabilidad mejorada muestren sus efectos de viabilidad mejorada sólo bajo las condiciones en las que son producidas. Esto es, en la producción de una cepa mutante de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, normalmente se practica un método de subcultivo y almacenamiento de bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium en un ambiente que es severo para que las bacterias crezcan y se obtiene una cepa sobreviviente. Mientras que se puede esperar un cierto nivel de efecto de mejoramiento de viabilidad bajo el cual la cepa mutante ha sido producida, no se puede esperar efecto de mejoramiento de viabilidad en otros ambientes. De acuerdo con esto, las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante un método convencional no pueden ser aplicadas a alimentos y bebidas que se distribuyan bajo una condición distinta de aquella bajo la que la cepa mutante es producida. De acuerdo con esto, la utilidad del método convencional ha sido extremadamente limitada.

También, aunque la causa es desconocida, se sabe que incluso una cepa bacterial con viabilidad mejorada obtenida mediante subcultivo y almacenamiento bajo condiciones con factores ambientales deteriorados (por ejemplo, un pH en la región acida) no muestra su efecto de mejoramiento de viabilidad cuando se usa bajo condiciones moderadas a un pH en la región neutral. Esta ha sido también una de las razones por las que se ha fracasado en obtener una cepa bacterial altamente versátil que sea aplicable a varios alimentos y bebidas.

Documento de la técnica antecedente Documento de patente [Documento de patente 1] Publicación de patente internacional No. WO03/040350 [Documento de Patente 2] JP-2922013 [Documento de Patente 3] JP-B-61 -19220 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema que se resolverá por medio de la invención De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan excelente viabilidad incluso bajo varias condiciones con diferentes factores ambientales, nuevas bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método, y un método para detectar las bacterias.

Medios para resolver el problema Los presentes inventores condujeron una intensiva investigación para resolver los problemas mencionados anteriormente. Como resultado han encontrado que, mediante subcultivo y almacenamiento de bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium alternadamente en al menos dos tipos de sistemas en los que las condiciones son diferentes en factores ambientales al menos dos veces, se pueden obtener bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan excelente viabilidad bajo todas las condiciones para el subcultivo y almacenamiento alternados.

Además, como resultado de la investigación de un método para detectar específicamente las bacterias nuevas pertenecientes al género Bifidobacterium así obtenidas, han encontrado un iniciador capaz de amplificar específicamente un fragmento de ADN de las bacterias, y encontraron que las bacterias pueden ser detectadas y cuantificadas específicamente usando el iniciador. Los presentes inventores han encontrado además que el conteo bacterial viable de las bacterias mencionadas puede ser cuantificado con una combinación de el iniciador y un colorante permeable de membrana.

Esto es, la presente invención proporciona un método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, incluyendo subcultivo y almacenamiento de bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium alternadamente en al menos dos tipos de sistemas bajo condiciones con diferentes factores ambientales al menos dos veces.

También, la presente invención proporciona las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método mencionado anteriormente.

También, la presente invención proporciona un alimento o bebida, particularmente un alimento o bebida láctea fermentada conteniendo las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium.

También, la presente invención proporciona un fragmento de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia anterior.

También, la presente invención proporciona un iniciador para Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-1 1320) que tiene una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia.

También, la presente invención proporciona un método para detectar Bifidobacterium breve YIT 12272 incluyendo el uso del iniciador.

También, la presente invención proporciona un método para cuantificar un conteo bacterial de Bifidobacterium breve YIT 12272 incluyendo el uso del iniciador.

También, la presente invención proporciona un método para cuantificar un conteo bacterial viable de Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-1 1320) incluyendo la realización de una reacción PCR sobre una muestra tratada con un colorante permeable de membrana mediante el uso del iniciador.

Efecto de la invención De acuerdo con el método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de la presente invención, se pueden obtener bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan excelente viabilidad incluso en productos terminados o bajo condiciones diferentes en factores ambientales tales como las condiciones de distribución. Debido a que dicha cepa bacterial es aplicable a varios alimentos y bebidas y tiene alta viabilidad en alimentos y bebidas, puede mostrar eficazmente el efecto fisiológico de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium.

También, una cepa bacterial utilizable en varios alimentos y bebidas puede ser producida mediante el mejoramiento de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan un efecto fisiológico específico tal como una acción de bacterias anti-Helicobacter pylori a través del método de producción de la presente invención. Por estas razones, la presente invención tiene una aplicabilidad industrial extremadamente alta.

Bifidobacterium breve YIT 12272, al tener excelente viabilidad, puede ser detectada y cuantificada específicamente en alimentos, bebidas, heces, y el intestino mediante el uso del fragmento de ADN de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de la banda RAPD específica para Bifidobacterium breve YIT 12272. La secuencia de un iniciador YIT 12272 específico está rodeada por una casilla; La figura 2 muestra el cambio en el valor cuantitativo de YIT 12272 mediante PCR cuantitativa con tratamiento de colorante permeable de membrana; La figura 3 muestra las condiciones óptimas para el tratamiento de PMA; La figura 4 muestra el cambio en el valor cuantitativo de YIT 12272 tratada con calor en las heces mediante tratamiento de PMA; y La figura 5 muestra la relación entre el conteo bacterial viable de YIT 12272 viva agregada a las heces y el valor cuantitativo de YIT 12272 obtenido mediante PCR cuantitativa (con tratamiento de PMA).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente invención, un factor ambiental se refiere a cualquier factor que afecte la proliferación y viabilidad de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium. Ejemplos de estos incluyen pH, presión osmótica, acidez, temperatura de cultivo/almacenamiento, tiempo de cultivo/almacenamiento, la cantidad de oxígeno disuelto, luz, presión, actividad del agua, un microorganismo coexistente, un factor nutricional (por ejemplo, azúcares, proteína, péptido, grasas tales como la grasa láctea, vitaminas, minerales, un sólido de leche descremada, y un factor de crecimiento de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium tal como un extracto de levadura), un antibiótico, un método de cultivo (tal como cultivo estático, cultivo revuelto, cultivo agitado, cultivo de aireación), un método de esterilización, un método de mezclado, un método de empacado, y un material de un contenedor de almacenamiento de un caldo de cultivo o de un alimento o bebida. Particularmente, el pH, la presión osmótica, la acidez, la temperatura de cultivo, y un factor nutricional, los cuales son factores ambientales importantes que afectan la proliferación y viabilidad de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, se usan preferiblemente.

Aquí, la luz incluye tanto luz visible como luz no visible, y la acidez indica la cantidad de una solución acuosa 1/10 N de hidróxido de sodio (ml_) necesaria para neutralizar 9 g de una muestra.

También, "al menos dos tipos de sistemas bajo condiciones con diferentes factores ambientales" se refiere a al menos dos tipos de sistemas en los que la calidad y/o la cantidad de ciertos factores ambientales es variada, por ejemplo, al menos dos tipos de sistemas que resultan de pH, presión osmótica, acidez, temperatura de cultivo, un factor nutricional y similares de un caldo de cultivo o de un alimento o bebida vanantes. Ejemplos más específicos incluyen sistemas que resultan de variar un caldo de cultivo o un alimento a bebida por medio del cambio de pH, por ejemplo, de 5 a 3, cambio de la presión osmótica, por ejemplo, de 600 mOsm (milliosmol) a 950 mOsm, cambio de la acidez, por ejemplo, de 6 a 20, cambio de la temperatura de cultivo del caldo de cultivo, por ejemplo, de 37°C a 30°C, cambio de los azúcares en el caldo de cultivo o alimento o bebida, por ejemplo, de azúcar digerible a azúcar no digerible, y, por ejemplo, aumentando la concentración de oxígeno disuelto mediante agitación.

No se impone alguna limitación particular ni en los factores ambientales blanco ni en los cambios en la calidad y/o cantidad de los mismos. Sin embargo, es preferible tomar en consideración una o más condiciones y factores ambientales de caldos de cultivo o alimentos y bebidas a los que se aplican las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium para ser producidas mediante el método de producción de la presente invención, seleccionar ta condición y el factor ambiental que afecta la proliferación y viabilidad de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, y conducir alternadamente subcultivo y almacenamiento de las bacterias bajo la condición y el factor ambiental así seleccionados. Aunque las condiciones de cultivo de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium varían dependiendo de las especies bacteriales, en general, el cultivo se lleva a cabo aproximadamente bajo las siguientes condiciones; un contenido sólido de leche descremada de 5 a 30%, un contenido de grasa láctea de 0 a 10%, una presión osmótica de 150 a 1000 mOsm, un pH de 4.0 a 7.0, una concentración de oxígeno disuelto de 0 a 2 ppm, y una temperatura de cultivo de 30 a 39°C. Las condiciones pueden ser variadas dentro del rango anterior, o las condiciones pueden establecerse fuera del rango anterior. Además, las condiciones de almacenamiento varían dependiendo del tipo y la forma de un caldo de cultivo o un alimento o bebida, por ejemplo, la temperatura de almacenamiento para alimentos y bebidas puede ser una temperatura normal, una temperatura refrigerada, o una temperatura congelante. Así, el factor ambiental y la condición de un caldo de cultivo o un alimento o bebida a la que las bacterias son aplicadas pueden ser apropiadamente seleccionados y usados.

También, cuando un jarabe (endulzante) se agrega a un caldo de cultivo para proporcionar un alimento o bebida, se usarán varios tipos de azúcares. En ese caso, la presión osmótica puede ser aumentada o disminuida dependiendo del tipo de azúcar usado; por lo tanto, dicho cambio en la presión osmótica puede ser usado como la condición a ser vanada.

Además, cuando un alimento o bebida es almacenado en un tanque de mezclado por un cierto período de tiempo antes de llenar un contenedor, la bebida o alimento necesita ser homogeneizado mediante agitación antes de llenar un contenedor. En este momento, el oxígeno en el espacio libre del tanque de mezclado puede ser tomado y la concentración de oxígeno disuelto es aumentada a la concentración de saturación en algunos casos. Así, dicho cambio en la concentración de oxígeno dísuelto puede ser usado como la condición a ser variada.

Aunque no se impone una limitación particular sobre el tipo de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que puede ser usado en el método de producción de la presente invención, ejemplos del mismo incluyen Bifidobacterium breve, B. longum, B. bifidum, B. animalis, B. suis, B. infantis, B. adolescentis, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. lactis, y B. globosum. Entre ellas, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, y Bifidobacterium bifidum son preferibles, ya que han sido usadas en varios productos lácteos por algún tiempo y se han acumulado datos de la seguridad y lo similar, y además, esas bacterias muestran también un efecto de viabilidad-mejoramiento alto. Entre ellas, Bifidobacterium breve es particularmente preferible.

Usando las antes mencionadas bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium como una cepa madre, mediante el subcultivo y almacenamiento alternados de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium al menos dos veces en al menos dos tipos de sistemas bajo condiciones con diferentes factores ambientales, se pueden obtener las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan una excelente viabilidad bajo todas las condiciones usadas para el subcultivo y el almacenamiento alternados. Específicamente, (1 ) la cepa madre de bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium es cultivada bajo el factor ambiental A para de este modo obtener un caldo de cultivo o uri alimento o bebida. El caldo de cultivo o el alimento o bebida así obtenidos se almacenan de modo que la cepa que muestra viabilidad mejorada bajo las condiciones con el factor ambiental A es concentrada o seleccionada. (2) Después de eso, la cepa que muestra viabilidad mejorada es cultivada bajo el factor ambiental B para de este modo obtener un caldo de cultivo o un alimento o bebida. El caldo de cultivo o el alimento o bebida así obtenidos se almacenan de modo que la cepa que muestra viabilidad mejorada bajo las condiciones con el factor ambiental B es concentrada o seleccionada. (3) Los pasos mencionados se repiten al menos dos veces, de donde se pueden obtener las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que muestren excelente viabilidad bajo los factores ambientales A y B.

Un método de subcultivo y almacenamiento alternados, cuando las condiciones son variadas, basado en los factores ambientales A y B, incluye realizar el subcultivo y el almacenamiento alternados en cualquier combinación y orden como A?B?A?B?A y A?A?B?B?A?A — » B?- B?A?A? B? B; sin embargo, el subcultivo y almacenamiento alternados se realizan preferiblemente al menos dos veces. Es preferiblemente realizado de 2 a 100 veces, más preferiblemente de 4 a 100 veces, particularmente preferible de 4 a 50 veces.

Al menos dos tipos de variaciones de condición del factor ambiental se pueden establecer. Un método de subcultivo y almacenamiento alternados en el que tres variaciones de condición, A, B, y C son establecidas se puede llevar a cabo de cualquier manera, por ejemplo, A?B?C?A? B?C?A?B?C y A?A?A?B?B?C?A?B?B?B?C? C? A.

Los factores ambientales son preferiblemente cambiados en al menos un tipo, además, al menos dos tipos, y particularmente al menos tres tipos seleccionados de pH, presión osmótica, acidez, temperatura de cultivo, y un factor nutricional en términos de A y B. Aquí, estos factores son preferiblemente cambiados en el siguiente rango: pH cambiado de 0.1 a 3 entre 4.0 y 7.0, la presión osmótica cambiada de 10 a 700 mOsm entre 150 y 1000 mOsm, la acidez cambiada de 1 a 20 entre 5 y 30, y la temperatura de cultivo cambiada de 1 a 6°C entre 30 y 39°C. Como el factor nutricional, es preferible cambiar el tipo de azúcar de palatinosa a jarabe de maltosa reducido. También, un contenido de grasa láctea es preferiblemente cambiado de 0.1 a 6% entre 0 y 10%. También, un contenido sólido de leche descremada es preferiblemente cambiado de 0.1 a 20% entre 5 y 30%.

Además, también es posible tratar la cepa madre de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium con un agente inductor de mutación y lo similar tal como rayos ultravioleta, nitrosoguanidina (NTG, por sus siglas en inglés), y metanosulfonato de etilo (E S, por sus siglas en inglés), y someter la cepa madre tratada con el agente inductor de mutación al ya mencionado subcultivo y almacenamiento alternados para seleccionar una cepa bacterial que tenga la calidad deseada.

Aquí, la viabilidad indica aproximadamente cuantas bacterias vivas están presentes en un caldo de cultivo o un alimento o bebida después del almacenamiento, y el conteo bacterial viable puede ser obtenido mediante un método ordinario. Por ejemplo, un caldo de cultivo o un alimento o bebida usada para almacenamiento es apropiadamente diluida y aplicada a un medio de agar propionato TOS, esto seguido de un cultivo anaeróbico a 37°C por 72 horas. Entonces, el conteo bacterial viable puede ser obtenido mediante la determinación de colonias formadas en el medio. La viabilidad puede ser indicada basándose en la proporción del conteo bacterial viable en un caldo de cultivo, o una bebida o alimento usado para almacenamiento después del almacenamiento a esa etapa anterior.

Cualquier medio en el que las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium puedan crecer, tales como el medio GAM, el medio MILS (Iwata y Morishita, Letter in Applied icrobiology, vol. 9, 165-168, 1989), un medio de propionato TOS, leche de soya, jugo vegetal, jugo de fruta, y malta se pueden usar como un caldo de cultivo en el método de producción de la presente invención. Sin embargo, un medio que contiene leche como componente principal es preferible, y ejemplos de la leche incluyen leche de vaca (leche entera) y un producto procesado de la misma tal como leche desnatada y una leche derivada de péptido. Un contenido sólido de leche descremada y un contenido de grasa se pueden establecer en cualquier cantidad dependiendo del material lácteo a usarse y la cantidad de mezcla del mismo, y se puede agregar un factor de crecimiento de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium como el extracto de levadura. Cualquiera de estos contenidos sólidos de leche descremada, contenidos de grasa, y factores de crecimiento de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium pueden ser un factor ambiental.

También, el factor ambiental o alimentos y bebidas lácteas fermentadas obtenidas mediante la adición de un ingrediente opcional como un jarabe a un caldo de cultivo que contiene un medio lácteo está cerca de el de un producto terminado; por lo tanto, las bacterias que muestran alta viabilidad en un producto terminado pueden ser concentradas más eficientemente. Así, los alimentos y bebidas lácteas fermentadas son preferiblemente usados para la crianza y mejoramiento de la cepa bacterial antes mencionada. Un ingrediente opcional, por ejemplo, un jarabe (endulzante) como azúcares, un agente emulsionante, un espesante (un estabilizador), vitaminas, y minerales se pueden agregar a los alimentos y bebidas lácteas fermentadas, cualquiera de los cuales puede ser un factor ambiental. Ejemplos de jarabe incluyen azúcares como glucosa, sacarosa, fructosa, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, jarabe de glucosa fructosa, palatinosa, trehalosa, lactosa, xilosa, azúcar de malta, miel, y melazas, alcohol de azúcar como sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, palatinita, un jarabe reducido en azúcar, y un jarabe reducido en azúcar de malta, un endulzante altamente dulce como aspartame, taumatina, sucralosa, acesulfamo-K y estevia. También, un agente emulsionante como un éster de ácido graso de sacarosa, un éster de ácidos grasos de glicerina, un éster de ácido graso de poliglicerina, un éster de ácido graso de sorbitán, y lecitina, un espesante (un estabilizador) como agar, gelatina, carragenano, goma guar, goma de xantano, pectina, goma de algarroba, goma gellan, carboximetil celulosa, polisacárido de soya, y alginato de propilen glicol se pueden agregar a los alimentos y bebidas lácteas fermentadas. Además de estos, se pueden agregar vitaminas como la vitamina A, vitaminas B, vitamina C, vitamina D, y vitaminas E, minerales como el calcio, magnesio, cinc, hierro, y manganeso, un acidificante como el ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, ácido mélico, ácido tartárico, y ácido glucónico, un contenido de grasa láctea como crema, mantequilla, y crema agria, sabores de, por ejemplo, yogurt, baya, naranja, membrillo Chino, perilla, cítricos, manzana, menta, uva, chabacano, pera, crema pastelera, durazno, melón, plátano, los trópicos, hierba, té, y café, un extracto herbal, y un extracto de azúcar moreno y similares.

Para el caldo de cultivo y el alimento o bebida láctea fermentada, se pueden usar también en combinación microorganismos distintos de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium. Ejemplos de el microorganismo incluyen bacterias pertenecientes al género Lactobacillus como Lactobacillus casei, L. acidophilus, L. plantarum, L. buchneri, L. gallinarum, L amylovorus, L. brevis, L. rhamnosus, L. kefiri, L. paracasei, L. curvatus, L. zeae, L. helveticus, L salivarius, L. gasseri, L. fermentum, L. reuteri, L. crispatus, L. delbrueckii subesp. bulgaricus, L delbrueckii subesp. delbrueckii, y L. johnsonii, bacterias pertenecientes al género Streptococcus como Streptococcus thermophilus, bacterias pertenecientes al género Lactococcus como Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp. cremoris, bacterias pertenecientes al género Enterococcus como Enterococcus faecalis y E. faecium, bacterias pertenecientes al género Bacillus como Bacillus subtilis, levadura perteneciente a los géneros Saccharomyses, Torulaspora, y Candida como Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, y Candida kefyr.

Los alimentos y bebidas fermentados pueden ser producidos de acuerdo con un método ordinario. Por ejemplo, cuando se producen alimentos y bebidas lácteas fermentadas, la cepa madre o las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium son inoculadas en el medio esterilizado lácteo solas o en combinación con otros microorganismos y cultivadas, y el producto resultante se somete a un tratamiento de homogeneización para dar leche fermentada. Subsecuentemente, una solución de jarabe preparada por separado se agrega y se mezcla, y el producto resultante es homogeneizado usando un homogeneizador y similares, y un sabor se agrega además para preparar el producto final.

Mediante el método mencionado anteriormente, usando Bifidobacterium breve YIT 4125 (FERM BP-7813) como la cepa madre, se produjo una cepa de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tiene una viabilidad particularmente excelente bajo las condiciones de diferentes factores ambientales. La cepa bacterial así obtenida fue depositada como Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) en el Organismo Depositario Internacional de Patentes, el Instituto Nacional de Ciencia Industrial Avanzada (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki) el 16 de Febrero de 2010. Bifidobacterium breve YIT 12272 tiene las siguientes características bacteriológicas en comparación con su cepa madre, Bifidobacterium breve YIT 4125.

CUADRO 1 Morfología de la célula bacterial y características de la colonia Las células bacteriales de cada cepa fueron cultivadas en un medio MILS con agar agregado (Iwata y Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol. 9, 165-168, 1989) a 37°C bajo condición anaeróbica (Anaero Pack (Mitsubishi gas chemical company, Inc.)) y una sola colonia fue elegida del medio agar (aislamiento de una sola colonia). Este proceso de aislamiento de una sola colonia fue repetido para purificar una cepa bacterial. Entonces, fueron observadas la morfología bacterial (cultivando en el medio MILS durante toda la noche seguido de tinción de Gram) y la característica de la colonia (cultivando en medio agar) de la cepa bacterial purificada.

CUADRO 2 Resultados de la prueba de carácter de fermentación de azúcar mediante API 50CH +: Fuertemente positivo (+): Débilmente positivo -: Negativo ±: Negativo o retrasado y débilmente positivo De acuerdo con el manual de API 50CH (el producto de bioMerieux Japón), cada suspensión bacterial después del cultivo durante toda la noche fue inoculada en el medio que contiene cada sustrato y entonces cultivada anaeróbicamente a 37°C por siete días. Después de eso, se determinó la fermentación característica para cada sustrato.

No se impone una limitación particular en la forma de utilización de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención, y se pueden usar bacterias liofilizadas o se puede usar también un producto de cultivo que contenga las bacterias. Sin embargo, en cualquier forma, preferiblemente las bacterias están vivas.

Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención pueden ser mezcladas con un portador no tóxico farmacéutico sólido o líquido y usadas en la forma de una preparación farmacéutica convencional. Ejemplos de la preparación incluyen una preparación sólida como una tableta, un gránulo, polvo, y una cápsula, una preparación líquida como una solución, una suspensión, y una emulsión, y una preparación liofilizada. Estas preparaciones pueden ser preparadas mediante un método ordinario usado en la tecnología de preparación farmacéutica. Ejemplos del portador no tóxico farmacéutico incluyen glucosa, lactosa, sacarosa, almidón, manitol, dextrina, glicéridos de ácidos grasos, polietilenglicol, hidroxietil almidón, etilenglicol, ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitán, aminoácidos, gelatina, albúmina, agua, solución salina fisiológica. También, un aditivo convencional como un estabilizador, un humectante, un agente emulsionante, un ligante, un agente ajustador de tonicidad, y un diluyente pueden ser agregados apropiadamente como se necesite.

Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención pueden ser no sólo preparadas como una preparación farmacéutica como se describió anteriormente sino también usadas agregándolas a alimentos y bebidas. Cuando se agregan a alimentos y bebidas, las bacterias pueden ser agregadas solas o en conjunto con vahos ingredientes nutricionales. Específicamente, cuando se agregan las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención a alimentos y bebidas, un aditivo que es utilizable en alimentos y bebidas puede ser apropiadamente usado, y los alimentos y bebidas pueden ser moldeados en una forma adecuada para el consumo, específicamente un gránulo, un grano, una tableta, una cápsula, una masa, y lo similar mediante medios convencionales. Además, las bacterias pueden ser agregadas a varios productos alimenticios, por ejemplo, un producto de carne procesada como jamón y salchicha, un producto de mariscos procesados como pescado picado cocido (kamaboko) o salchicha de pescado (chikuwa), pan, repostería, mantequilla, y leche en polvo, o las bacterias pueden también ser agregadas a bebidas como el agua, jugo de fruta, leche, una bebida no alcohólica, y un té. Se debe notar que los alimentos y bebidas también incluyen alimentación para el animal.

Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención pueden ser aplicadas a varios tipos de alimentos y bebidas de diferentes ambientes, y debido a su alta viabilidad en alimentos y bebidas, las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium pueden mostrar eficazmente su función fisiológica general como una acción reguladora del intestino. También, el mejoramiento de la bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tienen naturalmente un efecto fisiológico específico como una acción de erradicación de bacterias Helicobacter pylori mediante el método de producción de la presente invención permite la utilización de la cepa bacterial en varios alimentos y bebidas. Esto aumenta la palatabilidad de los alimentos y bebidas que contienen la cepa bacterial, y al mismo tiempo amplía la elección de los consumidores. Además, el mejoramiento de la viabilidad de la cepa bacterial puede mejorar el efecto fisiológico de la cepa bacterial.

Además, el alimento y la bebida son preferiblemente usados como alimentos y bebidas fermentados, como alimentos y bebidas lácteas fermentadas, leche de soya fermentada, jugo de fruta fermentado, y jugo de verduras fermentado que contiene bacterias vivas pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención. Entre ellos, preferiblemente se emplean los alimentos y bebidas lácteas fermentadas. Estos alimentos y bebidas lácteas fermentadas pueden ser producidos mediante un método ordinario, y pueden ser producidos mediante el método mencionado anteriormente. Los alimentos y bebidas lácteas fermentadas así obtenidas pueden ser también proporcionadas como un producto en la forma de cualquiera de un tipo simple sin jarabe (un endulzante), un tipo suave, un tipo con sabor a frutas, sólido, líquido, y similares.

Además, la presente invención se refiere a alimentos y bebidas que contienen las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención, particularmente alimentos y bebidas lácteas fermentadas que contienen un endulzante. El tipo, el método de producción, y la forma de los alimentos y bebidas lácteas fermentadas pueden ser similares a las descritas anteriormente. Es preferible producir alimentos y bebidas lácteas fermentadas usando una combinación de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención y al menos un tipo de bacteria seleccionado de bacterias pertenecientes al género Lactobacillus, bacterias pertenecientes al género Streptococcus, y bacterias pertenecientes al género Lactococcus debido a que se alcanza alta palatibilidad, y esto permite la ingestión continua.

Además, para los alimentos y bebidas preparados mediante el uso de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, un contenedor compuesto de un material de empaque impermeable al oxígeno como vidrio y papel recubierto de aluminio ha sido usado principalmente con el propósito de aumentar la viabilidad de las bacterias durante el almacenamiento. Sin embargo, debido a que las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de la presente invención no requieren una condición anaeróbica estricta dada su alta viabilidad, se puede usar también como material para el contenedor una resina altamente permeable al oxígeno (como poliestireno, políetileno y tereftalato de polietileno) Un contenedor hecho de dicha resina tiene méritos de bajo costo y alta flexibilidad al formarse, en comparación con un contenedor compuesto de un material de empaque impermeable al oxígeno.

Un fragmento de ADN y un iniciador de la presente invención tienen una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia. El iniciador del fragmento de ADN de la presente invención puede ser obtenido mediante la realización de PCR en el ADN derivado de numerosas bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium y bacterias relacionadas y buscando a través del método RAPD. Esto es, el PCR se realiza en el ADN derivado de bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium usando numerosos iniciadores aleatorios para amplificar el fragmento de ADN atrapado entre los iniciadores aleatorios. Basándose en el patrón de banda RAPD así obtenido, se realiza una clonación y la secuencia de nucleótidos del producto de amplificación PCR específico de Bifidobacterium breve YIT 12272 es determinada (SEQ ID NO: 3). El iniciador del fragmento de ADN de la presente invención está diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos así determinada (SEQ ID NOs: 1 y 2). El iniciador del fragmento de ADN de la presente invención incluye un iniciador de fragmento de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2.

Para el iniciador de la presente invención, una combinación de dos secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NOs: 1 y 2; o una combinación de dos secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias se usa con mayor preferencia. Además, es preferible usar un iniciador que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria a la secuencia como un iniciador directo y un iniciador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia complementaria a la secuencia como un iniciador inverso.

El iniciador de la presente invención es específico para la Bifidobacterium breve YIT 12272, y útil para la detección, cuantificación del conteo bacterial, y cuantificación del conteo bacterial viable para la Bifidobacterium breve YIT 2272. Ejemplos de una muestra para el método de detección y cuantificación de la presente invención incluyen alimentos y bebidas, productos farmacéuticos, y heces que contienen YIT 12272.

Ejemplos del método para detectar y cuantificar YIT 12272 incluyen los pasos de (1 ) extraer el ADN de una muestra, (2) realizar una reacción PCR usando el iniciador de la presente invención, y (3) detectar el fragmento de ADN amplificado mediante el paso (2).

En mayor detalle, primero, el ADN extraído de heces, alimentos, bebidas y similares, como muestra para PCR. Como un método de extracción de ADN de una solución diluida de heces y similares, son preferibles el método de Marmur, que es un método estándar, un método enzimático, el cual es el método modificado de Marmur, y un método de cloruro de bencilo. Además, una muestra obtenida mediante la suspensión de las células bacteriales en un regulador de pH o agua esterilizada, seguida de calentamiento a 95°C por aproximadamente 15 minutos puede proporcionarse como un modelo para PCR.

Un fragmento blanco de ADN (producto de PCR) puede ser obtenido llevando a cabo la reacción de amplificación usando una combinación de ADN así extraído y el iniciador de la presente invención. Generalmente, cuando se usa un iniciador en el método PCR y similares, es preferible usar un par de dos tipos de iniciadores. Por ejemplo, usando un primer grupo de iniciadores que tiene las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 1 y 2, sólo una región atrapada entre los iniciadores en el ADN de Bifidobacterium breve YIT 12272 puede ser amplificada entre otros numerosos tipos de bacterias que están, presentes, en donde las bacterias pueden ser identificadas. También, cuando se realiza la PCR, la cuantificación de las bacterias blanco también es posible mediante el sometimiento del modelo de ADN a una dilución seriada con anticipación para encontrar el límite de detección y entonces se conduce el análisis similar.

El ADN así obtenido puede ser sometido a electroforesis, y la Bifidobacterium breve YIT 12272 puede ser identificada basándose en la presencia o ausencia de una banda.

También, sólo las bacterias vivas de la Bifidobacterium breve YIT 12272 pueden ser detectadas y cuantificadas al realizar la reacción PCR en una muestra después de ser tratada con un colorante permeable de membrana. Ejemplos de un colorante permeable de membrana que se puede usar incluyen monoazida de etidio (EMA, por sus siglas en inglés), y el monoazida de propidio (PMA, por sus siglas en inglés), y el monoazida de propidio (PMA) es particularmente preferible. El tratamiento de colorante permeable de membrana de una muestra se lleva a cabo mediante, por ejemplo, la adición de una solución de colorante permeable de membrana que tenga una concentración final de 5 a 250 µ?, seguida de irradiación de luz. La reacción PCR se puede realizar de la misma manera que se mencionó anteriormente.

EJEMPLOS A continuación, el contenido de la presente invención se describirá en mayor detalle con Ejemplos; sin embargo, la presente invención no está limitada de ninguna forma por estos Ejemplos.

EJEMPLO 1 Crianza y mejoramiento de Bifidobacterium breve YIT 10001 y YIT 4125 mediante el método de subcultivo alternado Usando la cepa Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205) y la cepa Bifidobacterium breve YIT 4125 (FERM BP-7813) como la cepa madre, se conduce el subcultivo alternado y la concentración de las bacterias. (1) Después de esterilizar 20.7% del medio de leche entera en polvo a 135°C por 3.5 segundos, se inocularon 0.5% de la semilla de arranque 1 de la cepa Bifidobacterium breve YIT 10001 o de la cepa YIT 4125 y 1 % de un iniciador de semilla deBifidobacterium bifidum y entonces se co-cultivaron a 33°C hasta que el pH alcanzó 5.3, en donde se preparó la suspensión bacterial A1 (400 mL). (2) Dentro de la suspensión bacterial A1 , la solución de jarabe A fue mezclada con 10% de la concentración final de palatinosa, en donde se preparó el producto lácteo A1 (630 ml_). El producto lácteo A1 (200 mL) fue depositado en frascos de 300-mL, esto seguido de almacenamiento a 5°C por una semana mientras se agitó (a 90 rpm) bajo condiciones aeróbicas con un tapón de algodón (de aquí en adelante, abreviado como almacenamiento de agitación aeróbica). Subsecuentemente, se llenaron tubos de ensayo con el producto lácteo resultante A1 y se cerraron con un tapón de butilo, esto seguido de almacenamiento estático a 10°C por una semana bajo condiciones anaeróbicas (de aquí en adelante, abreviado como almacenamiento anaeróbico estático). (3) El producto lácteo A1 (1 mL) almacenado bajo las condiciones mencionadas fue inoculado en 10 mL de un medio de leche con cefalotina agregada (12% de leche desnatada, 0.1 % de extracto de levadura, 0.03% de clorhidrato de L-cisteína, 0.2% de carbonato de calcio sedimentario, y 5 µg/mL de cefalotina, de aquí en adelante abreviado como medio lácteo con cefalotina agregada), esto seguido de un cultivo anaeróbico a 37°C por 24 horas, en donde se obtuvo la masa madre 2 de Bifidobacterium breve. La masa madre 2 (0.03 mL) fue inoculado en 30 mL de un medio lácteo (12% de leche desnatada, 0.1 % de extracto de levadura, 0.03% de clorhidrato de L-cisteína, 0.2% de carbonato de calcio sedimentario, de aquí en adelante abreviado como medio lácteo), esto seguido por cultivo anaeróbico a 37°C por 24 horas, en donde se preparó la semilla de arranque 2 de Bifidobacterium breve. Se repitieron operaciones similares a las mencionadas usando la semilla de arranque 2. Esto eso, el producto lácteo A2 preparado usando la semilla de arranque 2 fue sometido a almacenamiento de agitación aeróbica, seguido por almacenamiento estático anaeróbico, en donde fueron preparados la masa madre 3 de Bifidobacterium breve, y además, la semilla de arranque 3 de Bifidobacterium breve. (4) Subsecuentemente, un medio de 23.5% de leche desnatada fue esterilizado a 120°C por 3.5 segundos, y 2% de la semilla de arranque 3 de Bifidobacterium breve y 0.01 % de una semilla de arranque de Lactococcus lactis fueron inoculadas y después mezcladas y co-cultivadas a 37°C hasta que el pH llegó a 4.4, en donde se preparó la suspensión bacterial B1 (100 mL). (5) Además, a un medio con 19.7% de leche desnatada que fue esterilizado a 120°C por 3.5 segundos, se le agregó 0.08% de péptido lácteo, y después 0.5% de una semilla de arranque de Streptococcus thermophilus fue inoculado y cultivado a 37°C hasta que el pH alcanzó 4.3, en donde se preparó la suspensión bacterial C1 (700 mL). La suspensión bacterial C1 fue agregada a la suspensión bacterial B1 (relación de mezclado 1 : 2), y además, la solución de jarabe B fue mezclada a 5% de la concentración final de jarabe de maltosa reducido, en donde se preparó el producto lácteo B1 (870 mL). (6) De forma similar al producto lácteo A1 , el producto lácteo B1 (1 mL) fue sometido a almacenamiento de agitación aeróbica, seguido de almacenamiento estático anaeróbico, y después inoculado en 10 ml_ del medio lácteo de cefalotina agregada, esto seguido por cultivo anaeróbico a 37°C por 24 horas para proporcionar la masa madre 4 de Bifidobacterium breve. La masa madre 4 (0.03 mL) fue inoculada en 30 ml_ del medio lácteo, esto seguido de cultivo anaeróbico a 37°C por 24 horas, en donde se preparó la semilla de arranque 4 de Bifidobacterium breve. Se repitieron operaciones similares a las mencionadas usando la semilla de arranque 4. Esto eso, el producto lácteo B2 preparado usando la semilla de arranque 4 fue sometido a almacenamiento de agitación aeróbica, seguido por almacenamiento estático anaeróbico, en donde fueron preparados la masa madre 5, y además, la semilla de arranque 5 de Bifidobacterium breve.

Como se ha mostrado anteriormente, la preparación, el almacenamiento de agitación aeróbica, y el almacenamiento estático anaeróbico del producto lácteo A fueron repetidos dos veces. Subsecuentemente, el uso de la Bifidobacterium breve sobreviviente, la preparación, el almacenamiento de agitación aeróbica, y el almacenamiento estático anaeróbico del producto lácteo B fueron repetidos dos veces y se concentró la Bifidobacterium breve. Una serie de los pasos mencionados se estableció como un ciclo, el cual fue repetido para un total de cuatro ciclos. Finalmente, el producto lácteo A8 y el producto lácteo B8 fueron sometidos a almacenamiento estático anaeróbico a 10°C por dos semanas y después una porción (1 mL) de cada producto fue aplicada a un medio de agar propionato TOS (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) que contiene 5 µ p\1 de cefalotina y se condujo cultivo anaeróbico a 37°C usando el Anaero Pack (Mitsubishi gas chemical company, Inc.) para aislar a la única colonia. El aislamiento de la única colonia fue repetido por purificación, en donde fueron aisladas colonias únicas de un total de 42 cepas derivadas de la cepa Bifidobacterium breve YIT 10001 y YIT 4125, específicamente un total de 21 cepas del producto lácteo A8 y un total de 21 cepas el producto lácteo B8.

EJEMPLO 2 Ensayo de confirmación de viabilidad Usando la cepa madre y las cepas aisladas, se prepararon y almacenaron los productos lácteos A y B mientras se agitaban a 5°C por una semana bajo condiciones aeróbicas, esto seguido de almacenamiento estático a 10°C por dos semanas bajo condiciones anaeróbicas de acuerdo con el método del Ejemplo 1. Entonces, se seleccionó la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 (derivada de la cepa YIT 4125, aislada del producto lácteo A8), la cual mostró excelente viabilidad en ambos productos lácteos A y B.

Los resultados de viabilidad de la cepa YIT 12272 y la cepa control (cepa YIT 10001 y cepa YIT 4125) en los productos lácteos A y B se muestran en el cuadro 3. Con respecto a la cepa YIT 12272, 3 ? 107 CFU/mL o más células vivas sobrevivieron después del almacenamiento mientras se agitaban a 5°C por una semana bajo condiciones aeróbicas, esto seguido de almacenamiento estático a 10°C por dos semanas bajo condiciones anaeróbicas en ambos productos lácteos A y B. En contraste, en los productos lácteos A y B preparados usando bacterias control, 3 ? 107 CFU/mL o más células vivas sobrevivieron en uno de los productos lácteos; sin embargo, las bacterias control no mostraron excelente viabilidad en ambos productos.

También, las propiedades físicas de los productos lácteos A y B se muestran en el cuadro 4. El jarabe A fue mezclado en la suspensión bacterial A para preparar el producto lácteo A, en el cual se encontró que el pH y la acidez son 5.6 y 3.4 respectivamente. Aunque la presión osmótica de la suspensión bacterial A fue 550 mOsm, fue aumentada a 950 mOsm en la producto lácteo A. Mientras tanto, la suspensión bacterial C y el jarabe B fueron mezclados en la suspensión bacterial B para preparar el producto lácteo B, en el cual se encontró que el pH y la acidez son 4.4 y 7.5 respectivamente. Aunque la presión osmótica de la suspensión bacterial fue de 900 mOsm, fue disminuida a 600 mOsm en el producto lácteo B.

Como se muestra, fue revelado que la viabilidad de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue mejorada, comparada con la cepa control, en ambos productos lácteos A y B, los cuales difirieron en temperatura de cultivo, pH, acidez, un cambio en la presión osmótica debido al mezclado del jarabe, un contenido sólido de leche descremada, y un contenido de grasa láctea.

CUADRO 3 El conteo bacterial viable de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 en los productos lácteos A y B después del almacenamiento El conteo bacterial viable fue determinado en un medio de agar propionato TOS que contiene 5 µg/mL de cefalotina después del almacenamiento mientras se agitaba a 5°C por una semana bajo condiciones aeróbicas, esto seguido por almacenamiento estático bajo condiciones anaeróbicas a 10°C por dos semanas.

CUADRO 4 Las propiedades físicas de los productos lácteos A y B La presión osmótica se midió con Osmostat OM-6040, fabricado por Kyoto Daiichi Kagaku.

EJEMPLO 3 Prueba de confirmación para la resistencia contra jugo gástrico artificial.

La cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 y la cepa control (cepa YIT 10001 y cepa YIT 4125) fueron cultivadas anaeróbicamente durante toda la noche a 37°C en el medio lácteo. Entonces, 0.5 mL del cultivo bacterial asi obtenido fue agregado a 10 mL de jugo gástrico artificial que había sido calentado a 37°C por 30 minutos, mezclado inmediatamente, y después incubado a 37°C. A los 0 minutos y a los 120 minutos después de la incubación (tratamiento con jugo gástrico artificial), 1 mL de la mezcla se colectó y se diluyó apropiadamente, y después de eso se determinó el conteo bacterial viable usando un medio agar propionato TOS (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd., 37°C, cultivo anaeróbico).

El jugo gástrico artificial fue preparado de la siguiente manera. Esto es, las siguientes sustancias fueron disueltas en agua de intercambio iónico de modo que la concentración final de cada sustancia fue; proteosa peptona (Becton, Dickinson and Co.): 5 g/L, mucina gástrica (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.): 1.5 g/L, cloruro de sodio: 5g/L, bicarbonato de sodio: 3 g/L, y fosfato dihidrogenado de potasio: 1 g/L. El pH de la solución resultante fue ajustado a 2.8 con ácido hidroclorhídrico 3.6 N, y la solución así obtenida fue esterilizada mediante autoclave a 115°C por 15 minutos, y después almacenada a 4°C. Subsecuentemente, la pepsina (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) fue disuelta en agua de intercambio iónico a 400 mg/L, y la solución resultante fue esterilizada por filtración a través de un filtro de membrana (DISMIC-25cs, Advantec, 0.45 µ??) para dar una solución de pepsina. El pH de la solución fue reajustado a 2.8 y 20 ml_ de la solución de pepsina fueron agregados a 180 mL de la solución preparada como se mencionó justo antes de usarse, en donde se preparó jugo gástrico artificial.

Los conteos bacteriales viables al minuto 0 y a los 120 minutos después del tratamiento con jugo gástrico artificial se muestran en el cuadro 5. Aunque el conteo bacterial viable de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 apenas cambió incluso 20 minutos después del tratamiento con jugo gástrico artificial, el conteo bacterial viable de la cepa control (cepa YIT 10001 y cepa YIT 4125) fue disminuido por el tratamiento. Se reveló que la resistencia de la cepa YIT 12272 contra jugo gástrico artificial también fue mejorada, comparada con la cepa control.

CUADRO 5 Resistencia de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 contra jugo gástrico artificial EJEMPLO 4 Ensayo de confirmación de la resistencia contra tratamiento secuencial con jugo gástrico artificial/bilis artificial y fluido intestinal Usando la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 y la cepa control (cepa YIT 10001 y cepa YIT 4125), se preparó el producto lácteo B de forma similar al ejemplo 1. Los productos lácteos B (200 mL) preparados mediante el uso de cada cepa bacterial fueron depositados en frascos de 300-mL, esto seguido por almacenamiento a 5°C por una semana mientras se agitaba (90 rpm) bajo condiciones aeróbicas con un tapón de algodón. Subsecuentemente, se llenaron tubos de ensayo con los productos lácteos resultantes B mediante almacenamiento estático a 10°C bajo condiciones anaeróbicas con un tapón de butilo. Se debe notar que sólo la fase gaseosa de un frasco de 300-mL que contiene el producto lácteo B preparado usando la cepa YIT 4125 fue reemplazada por gas nitrógeno, y después el producto resultante fue almacenado a 5°C por una semana mientras se agitaba (90 rpm) bajo condiciones anaeróbicas con un tapón de butilo, esto seguido de almacenamiento estático a 10°C bajo condiciones anaeróbicas.

De manera similar al método del ejemplo 3, se realizó el tratamiento con jugo gástrico artificial agregando 0.5 mL del producto lácteo B que había sido sometido a almacenamiento estático a 10°C por cuatro días a 10 mL de jugo gástrico artificial ajustado a un pH de 3.3, esto seguido de incubación a 37°C por 60 minutos. A 2 mL de la solución de prueba así obtenida, se le agregó 1 mL de bilis artificial que había sido calentada a 37°C con anterioridad, esto seguido inmediatamente de agitación. Subsecuentemente, a la mezcla así obtenida se le agregó una mezcla de 5 mL de 4mL de fluido intestinal artificial y 1 mL de fluido pancreático artificial que había sido calentado a 37°C por 30 minutos, y la mezcla resultante fue agitada e incubada a 37°C. Entonces, a los 0 minutos y a los 60 minutos después del tratamiento con jugo gástrico artificial y 60 minutos después del tratamiento con bilis y fluido intestinal artificiales, se colectó cada vez y se diluyó apropiadamente 1 mL de la mezcla resultante, y se determinó el conteo bacterial viable usando un medio agar ácido propionato TOS (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd., 37°C, cultivo anaeróbico).

La bilis artificial fue preparada disolviendo polvo de bilis (Oxgall, Difco) en agua de intercambio iónico a 40 g/L y ajustando el pH de la solución resultante a 8.0 con carbonato de sodio 3 M, y después diluyendo la solución resultante con agua de intercambio iónico de modo que la concentración del polvo de bilis fuera 1% (P V), esto seguido de esterilización con autoclave a 121°C por 15 minutos. Se usó la bilis artificial así preparada. También, el fluido intestinal artificial se preparó disolviendo las siguientes sustancias en agua de intercambio iónico de que modo que la concentración final de cada sustancia fuera; cloruro de sodio: 5 g/L, cloruro de potasio: 1 g/L, y bicarbonato de sodio: 3 g/L, y ajustando el pH de la solución resultante a 8.0 con carbonato de sodio 3 M, esto seguido de esterilización con autoclave a 121°C por 15 minutos. El fluido pancreático artificial se preparó disolviendo lipasa pancreática (MP Biomedicals) en el fluido intestinal artificial a 20 g/L inmediatamente antes de la prueba, y la solución resultante fue esterilizada por filtración a través de un filtro de membrana (DISMIC-25cs, Advantec 0.45 µp?), esto seguido de almacenamiento en hielo. Se usó el fluido pancreático artificial así preparado.

El conteo bacterial viable al minuto 0 y a los 60 minutos después del tratamiento con jugo gástrico artificial, y 60 minutos después del tratamiento con bilis y fluido intestinal artificiales se muestra en el cuadro 6. El conteo bacterial viable de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 en el producto lácteo B almacenado fue más alto que el de la cepa control (cepa Bifidobacterium breve YIT 10001 , cepa YIT 4125) no sólo después del tratamiento con jugo gástrico artificial sino también después del tratamiento secuencial con jugo gástrico artificial y fluido intestinal que contiene bilis artificial. Se reveló que la cepa YIT 12272 mejoró más tanto por la resistencia al jugo gástrico artificial como por la resistencia a la bilis artificial/fluido intestinal que por las bacterias control.

CUADRO 6 Resistencia de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 en el producto lácteo B contra el tratamiento secuencial con jugo gástrico y bilis artificiales y fluido intestinal después del almacenamiento El producto lácteo B fue almacenado mientras se agitaba a 5°C por una semana bajo condiciones aeróbicas (solo la cepa YIT 4125 se almacenó bajo condiciones anaeróbicas), esto seguido de almacenamiento por cuatro días a 10°C bajo condiciones anaeróbicas, y después tratado con jugo gástrico artificial (pH 3.3), y secuencialmente con bilis artificial (1 % de polvo de bilis). El conteo bacterial viable fue enumerado en el producto lácteo B así contenido.

EJEMPLO 5 Producción de alimentos y bebidas lácteas fermentadas En 506 g de agua, se disolvieron 124 g de leche entera en polvo, esto seguido de esterilización a 135°C por 3 segundos. Subsecuentemente, se inocularon y cultivaron 0.5% de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272, 1 % de Bifidobacterium bifidum, y 0.001% de Lactobacillus acidophilus a 33°C hasta que el pH alcanzó 5.3. La mezcla resultante fue homogeneizada a 15 MPa para dar 630 g de una suspensión bacterial. Mientras tanto, se disolvieron en agua 98 g de palatinosa, 8 g de jugo de zanahoria, 2.5 g de aceite que contiene DHA, 7 g de calcio emulsionado, 0.1 g de lactoferrina, 0.02 g de vitamina D, y 1 g de sabor, y se agregó agua a los mismos hasta un volumen total de 370 g. La mezcla resultante fue esterilizada a 120°C por tres segundos para dar una solución de jarabe. La suspensión bacterial y la solución de jarabe se mezclaron y se vertieron en un contenedor de cartón (Tetra Brik), en donde se obtuvo un producto lácteo fermentado que tiene: pH de 5.6; acidez de 3.4; contenido sólido de leche descremada de 8.7%; y contenido de grasa láctea de 3.2% (el conteo bacterial inicial de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue 9.5 ? 10a CFU/mL).

El producto lácteo fermentado así obtenido fue almacenado a 10°C por 14 días, en los que se encontró que la tasa de supervivencia de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue de 30%. También, el producto lácteo fermentado así obtenido tenía un excelente sabor.

EJEMPLO 6 Producción de alimentos y bebidas lácteas fermentadas En 90 g de agua, se disolvieron 25 g de leche desnatada en polvo, esto seguido de esterilización a 120°C por 3.5 segundos. Subsecuentemente, se inocularon y cultivaron 2% de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272, y 0.01% de Lactococcus lactis a 37°C hasta que el pH alcanzó 4.4. La mezcla resultante fue homogeneizada a 15 MPa para dar 1 15 g de suspensión bacterial A. También, se disolvieron en agua 60 g de leche en polvo desnatada y 0.25 g de péptido lácteo, y se agregó agua a los mismos hasta un volumen total de 330 g. La mezcla resultante fue esterilizada a 120°C por 3.5 segundos, y se inoculó 0.5% de Streptococcus thermophilus. Las bacterias fueron cultivadas a 37°C hasta que el pH alcanzó 4.3, y entonces la mezcla resultante fue homogeneizada a 15 MPa para dar 330 g de suspensión bacterial B. Mientras tanto, se disolvieron en agua 47 g de maltitol, 29 g de polidextrosa, 14 g de jarabe de galactooligosacárido, 3.5 g de hierro emulsionado, 3 g de pectina, 1 g de péptido de colágeno, 0.3 g de mezcla de vitamina B, y 0.1 g de aspartame, se agregaron después 1 g de sabor y 1 g de aceite de vitamina E, y entonces se agregó agua hasta un volumen total de 555 g. La mezcla resultante fue esterilizada a 120°C por tres segundos para dar una solución de jarabe. La suspensiones bacteriales A y B y la solución de jarabe se mezclaron y se vertieron en un contenedor de cartón (Tetra Brik), en donde se obtuvo un producto lácteo fermentado que tiene: pH de 4.4; acidez de 7.5; contenido sólido de leche descremada de 8.1 %; y contenido de grasa láctea de 0.1 % (el conteo bacterial inicial de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue 8.8 x 108 CFU/mL).

El producto lácteo fermentado así obtenido fue almacenado a 10°C por 16 días, en los que se encontró que la tasa de supervivencia de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue de 34%. También, el producto lácteo fermentado así obtenido tenía un excelente sabor.

EJEMPLO 7 Producción de alimentos y bebidas lácteas fermentadas En 198 g de agua, se disolvieron 58 g de leche desnatada en polvo, esto seguido de esterilización a 120°C por 3.5 segundos. Subsecuentemente, se inocularon y cultivaron 1 % de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272, 0.2% de Lactococcus lactis, y 0.01 % de Streptococcus thermophilus a 37°C hasta que el pH alcanzó 4.5. La mezcla resultante fue homogeneizada a 15 MPa para dar 256 g de suspensión bacterial. Mientras tanto, se disolvieron en agua 25 g de jarabe de galactooligosacárido, 16 g de lactitol, 16 g de palatinosa, 3 g de pectina, y 0.05g de sucralosa, y se agregaron después 1 g de sabor y agua hasta un volumen total de 744 g. La mezcla resultante fue entonces esterilizada a 120°C por tres segundos para dar una solución de jarabe. La suspensión bacterial y la solución de jarabe fueron mezcladas y después vertidas en un contenedor de cartón (Tetra Brik), en donde se obtuvo la bebida láctea fermentada que tiene; pH de 4.4: acidez de 5.3; contenido sólido de leche descremada de 5.5%; y contenido de grasa láctea de 0.1 % (el conteo bacterial inicial de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue 1.3 ? 109 CFU/mL).

La bebida láctea fermentada así obtenida fue almacenada a 10°C por 23 días. Como resultado, se encontró que la tasa de supervivencia de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue de 41 %. También, la bebida láctea fermentada así obtenida tenía un excelente sabor.

EJEMPLO 8 Producción de alimentos y bebidas lácteas fermentadas Se disolvieron 58 g de leche entera en polvo, 42 g de leche desnatada, y 0.02 g de péptido lácteo en 487 g de agua, esto seguido de esterilización a 135°C por tres segundos. En la mezcla resultante, los arrancadores de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 y Lactobacillus acidophilus fueron inoculados en un 0.5% y 1.0% respectivamente. La mezcla resultante fue entonces cultivada a 33°C hasta que el pH alcanzó 5.3, y entonces se homogeneizó a 15 MPa para dar 587 g de una suspensión bacterial.

Mientras tanto, se disolvieron en agua 98 g de palatinosa, 8 g de jugo de zanahoria y 1 g de sabor, y se agregó después agua hasta un volumen total de 4 3 g. La mezcla resultante fue esterilizada a 120°C por tres segundos para dar una solución de jarabe.

La suspensión bacterial y la solución de jarabe fueron mezcladas y después vertidas en un contenedor de cartón (Tetra Brik), en donde se obtuvo el producto lácteo fermentado que tiene; pH de 5.6: acidez de 2.9; contenido sólido de leche descremada de 8.1%; y contenido de grasa láctea de 1.4% (el conteo bacterial inicial de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272 fue 9.5 x 108 CFU/mL).

EJEMPLO 9 Producción de Tabletas Cada uno de los ingredientes mostrados a continuación fueron mezclados de acuerdo con la siguiente formulación, y la mezcla resultante fue sometida a granulación, secado, y ajuste de tamaño de gránulo, seguido de formación de tabletas, en donde se produjeron tabletas.

(Formulación) (mg) Célula bacterial seca de la presente invención1' 20 Celulosa Microcristalina 100 Lactosa 80 Estearato de magnesio 0.5 Metilcelulosa 12 1) Producido por liofilización de la célula bacterial viva de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272.

EJEMPLO 10 Producción de bebidas no alcohólicas Cada uno de los ingredientes mostrados a continuación fue mezclado de acuerdo con un método ordinario basado en la siguiente formulación. La mezcla resultante fue homogeneizada para dar bebidas no alcohólicas. Las bebidas no alcohólicas así obtenidas fueron puestas en botellas ámbar y selladas con una tapa de aluminio, esto seguido de tratamiento con calor. Las bebidas no alcohólicas así obtenidas fueron favorables tanto en apariencia externa como en sabor, y también tenían buena estabilidad de almacenamiento.

(Formulación) (g) Célula bacterial seca de la presente invención1' 5 Sabor 0.8 Agua 100 Almidón sacarificado reducido 24 Fructosa 18 1 ) Producido por liofilización de la célula bacterial viva de la cepa Bifidobacterium breve YIT 12272.

EJEMPLO 11 Producción de un iniciador de cepa específica mediante el método aleatorio de ADN polimórfico amplificado (RAPD, por sus siglas en inglés) Usando 62 cepas de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium breve, se extrajo ADN de la célula bacterial y se aplicó el método RAPD realizando PCR de acuerdo con el siguiente procedimiento para buscar una secuencia de nucleótidos específica para YIT 12272. (1 ) Extracción de ADN de la célula bacterial Se cultivaron sesenta y dos cepas de las bacterias pertenecientes a Bifidobacterium breve (Bifidobacterium breve YIT 4014T, YIT 4015, YIT 4023, YIT 4024, YIT 4043, YIT 4049, YIT 4063, YIT 4064, YIT 12272 y otras 53 cepas) usando un medio GAM (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) complementado con glucosa al 1 %, por 24 horas a 37°C bajo condiciones anaeróbicas. La suspensión bacterial (0.5 mL) se centrifugó, se removió un sobrenadante y se agregaron 0.25 mL de un regulador de pH de extracción de ADN (100 mM de Tris-HCL, 40 mM de EDTA, pH 9.0), 0.05 mL de SDS al 10%, 0.5 mL de fenol TE-saturado, y 0.7 g de perlas de vidrio (el diámetro de 0.1 mm). La mezcla fue agitada vigorosamente para romper la célula bacterial. Entonces, se agregaron 0.15 mL de acetato de sodio 3M y la mezcla se centrifugó, y un sobrenadante fue transferido a otros tubos. Después de la precipitación con isopropanol y el lavado con etanol al 70%, el producto así obtenido fue secado con aire y finalmente disuelto en 0.1 mL de un regulador de pH TE (10 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM de EDTA). (2) Método RAPD El método RAPD se llevó a cabo usando 27 tipos de iniciadores aleatorios (Cuadro 7). Un líquido de reacción tuvo un volumen total de 20 µ? conteniendo 10 mM de Tris-HCI (pH 8.3), 50mM de KCI, 1.5 mM de MgCI2, 200 µ? de mezcla dNTP, 1.5 µ? de iniciador aleatorio, 1.5 U de polimerasa ADN Taq (el producto de Takara Bio Inc.), y 10 ng de modelo de ADN. Las reacciones PCR se llevaron a cabo usando el termociclador de ADN PTC200 (MJ Research, Inc.), en el que la reacción PCR incluyó los siguientes pasos; 94°C por 120 segundos, seis ciclos de (94°C por 20 segundos, 36°C por 30 segundos, 72°C por 90 segundos), 30 ciclos de (94°C por 20 segundos, 36°C por 30 segundos, y 72°C por 90 segundos), y 72°C por 180 segundos. El producto de amplificación así obtenido fue sometido a electroforesis a 50 V en un gel de agarosa al 1.5%. Entonces, el gel fue teñido con bromuro de etidio para confirmación bajo radiación UV.

CUADRO 7 Secuencia de un iniciador aleatorio para el método APD Nombre Nombre del Secuencia (5'... 3') del Secuencia (5'... 3') iniciador iniciador GTGAAGTAGG(SEQ ID NO AAGACTGTCC(SEQ ID NO ID NO ID NO ID NO GAGGACAAAG(SEQ ID NO p1005 CAGTACCTTC(SEQ ID NO (8)) p1280 (22)) GGTTAAAGCC(SEQ ID NO AACGCGCAAC(SEQ ID NO p1006 (9)) p1281 (23)) TCGACGATAG(SEQ ID NO GACGACTATC(SEQ ID NO p1007 (10)) p1282 (24)) AGCCAACGAA(SEQ ID NO GTCAACGAAG(SEQ ID NO p1008 (11 )) p1284 (25)) GTTGCGGTCC(SEQ ID NO AGCCAGTTTC(SEQ ID NO p1009 (12)) p1285 (26)) TGCGACTTAC(SEQ ID NO CGCATAGGTT(SEQ ID NO p1010 (13)) p1287 (27)) GTAGACAAGC(SEQ ID NO GGGGTTGACC(SEQ ID NO p101 1 (14)) p1288 (28)) TGCCGAATTC(SEQ ID NO ACTTGCATCC(SEQ ID NO p1248 (15)) P1289 (29)) CGAACTAGAC(SEQ ID NO CCCGTCAGCA(SEQ ID NO p1249 (16)) p1292 (30)) GGCTTAACAC(SEQ ID NO p1250 (17)) (3) Clonación Comparando los patrones de bandas RAPD de 62 cepas de las bacterias pertenecientes a Bifidobacterium breve, se clonó un producto de amplificación PCR que, según se encontró, es específico para YIT 122762, usando un kit de clonación TA (el producto de Invitrogen Corporation) de acuerdo con el manual adjunto. Esto es, el producto de amplificación PCR fue insertado en un vector pCR2.1 e introducido en Escherichia coli para transformación. Posteriormente, la E. coli transformada fue inoculada en un medio de agar Luria Bertani (LB) que contiene X-gal y 50 g/mL de ampicilina, y se cultivó. Entonces, las bacterias blancas formadoras de colonias así obtenidas fueron proliferadas en el medio líquido LB, y de estas se extrajo ADN para obtener ADN clonado. De acuerdo con el método estándar, la secuencia de nucleótidos de ADN del producto de amplificación PCR fue determinada con un método de colorante terminador (Fig. 1). (4) Producción de un iniciador bacterial de cepa específica v confirmación de su especificidad Entre las secuencias de nucleótidos de ADN del producto de amplificación PCR específico para YIT 12272 obtenido por clonación, se seleccionó una secuencia que era de lo más específica para YIT 12272 y tenía alta reactividad PCR para producir un iniciador específico de YIT 12272. La secuencia del iniciador fue mostrada en el Cuadro 8. Usando este iniciador específico de YIT 12272, se llevó a cabo una PCR en ADN extraído de un total de 144 cepas bacteriales incluyendo 62 cepas bacteriales de las bacterias pertenecientes a Bifidobacterium breve y 82 cepas de 78 especies de 12 géneros de bacterias frecuentemente aisladas del tracto intestinal humano (Cuadro 9) para confirmar especificidad. Usando una mezcla de reacción que tiene un volumen total de 20 µ?_ conteniendo 10 mM de Tris-HCI (pH 8.3), 50 mM de KCI, 1.5 mM de MgCI2, 200 µ? de mezcla de dNTP, iniciador 0.3 µ?, 0.5 U de polimerasa ADN Taq, y 10 ng de modelo de ADN, se llevaron a cabo reacciones PCR, en las que la reacción PCR incluyó los siguientes pasos; 94°C por 120 segundos, 32 ciclos de (94°C por 20 segundos, 60°C por 10 segundos, y 72°C por 20 segundos), y 72°C por 180 segundos. El producto de amplificación así obtenido fue sometido a electroforesis a 100 V en un gel de agarosa al 1.5%. Entonces, el gel fue teñido con bromuro de etidio para confirmación bajo radiación UV. Como resultado, se confirmó que el iniciador específico de YIT 12272 así producido es específico para Bifidobacterium breve YIT 12272.

CUADRO 8 Secuencia del iniciador específico de YIT 12272 (pBbrY) Nombre SEQ ID NO Organismo blanco del Secuencia (5'...3') iniciador 1 ATG GCA AAA CCG GGC pBbrY-F B. breve YIT 12272 TGA A 2 pBbrY-R GCG GAT GAG AGG TGG G CUADRO 9 Cepa bacterial usada EJEMPLO 12 Detección de YIT 12272 viva mediante el método PCR (1 ) Optimización de un colorante permeable de membrana El monoazida de etidio (EMA) y monoazida de propidio (PMA), los cuales fueron un colorante permeable de membrana, se usaron para Bifidobacterium breve YIT 12272. Usando un medio líquido con GAM + glucosa al 1%, para cada una de las YIT 12272 no tratadas que habían sido cultivados por 24 horas a 37°C bajó condiciones anaeróbicas (bacterias vivas), células muertas de las mismas obtenidas mediante calentamiento de las bacterias a 80°C por 10 minutos, o células muertas de las mismas obtenidas mediante cultivo continuo de las bacterias por 10 días a 37°C, se agregó el colorante a las concentraciones finales de EMA y PMA de 240 µ? y 50, µ?, respectivamente. Después de ser mantenidas cálidas por cinco minutos a temperatura ambiente, las bacterias fueron irradiadas con luz por dos minutos usando lámparas de halógeno de 500 W a una distancia de 20 cm bajo la lámpara. Posteriormente, se extrajo ADN de cada una de las células bacteriales, y se cuantificó la YIT 12272 mediante PCR cuantitativo usando el iniciador específico de YIT 12272. (Como un método cuantitativo PCR, se usó el método descrito en International Journal of Food Microbiology (2008) Vol. 126, p. 210 a 215) Como resultado, mientras que tanto el EMA como el PMA inhibieron la amplificación PCR en células bacteriales muertas, el EMA también inhibió la amplificación PCR en bacterias vivas. Basándose en que el PMA inhibió la amplificación PCR en bacterias muertas sin inhibir la amplificación PCR en YIT 12272 vivas, se encontró que el PMA es adecuado para la detección y cuantificación de YIT 12272 vivas mediante PCR cuantitativo (figura 2).

Para optimizar el tratamiento con PMA, se llevó a cabo un PCR cuantitativo usando el iniciador específico de YIT 12272, y bacterias vivas y bacterias muertas por calor de YIT 12272 tratadas con varias concentraciones de PMA (5 µ?, 50 µ?, y 150 µ?) y tiempo de irradiación de luz (uno, dos y cinco minutos). Como resultado, se encontró que el tiempo de irradiación de luz no afectó el tratamiento con PMA, y que el tratamiento con baja concentración (5 µ?) y alta concentración (150 µ?) de PMA mostró un efecto inhibitorio más débil en la amplificación PCR en la célula bacterial muerta por calor, comparado con el tratamiento con PMA 50 µ? (figura 3). De acuerdo con esto, se encontró que el tratamiento con PMA 50 µ? y dos minutos de irradiación de luz era adecuado para el tratamiento con PMA a ser aplicado en YIT 12272. (2) Detección y cuantificación de YIT 12272 vivas en heces Se prepararon las heces en las que la ausencia de YIT 12272 fue confirmada mediante un medio selectivo y PCR cuantitativo usando el iniciador específico de YIT 12272. Se agregaron células bacteriales muertas por calor de YIT 12272 a las heces, esto seguido de tratamiento con PMA (PMA 50 µ? y dos minutos de irradiación de luz). Como resultado, se encontró que fue inhibida la amplificación PCR en las células bacteriales muertas por calor de YIT 12272 en las heces, y el valor cuantitativo de las bacterias muertas de YIT 12272 disminuyó a aproximadamente uno punto veinte milésimas (figura 4). En contraste, las YIT 12272 vivas que habían sido cultivadas por 24 horas se agregaron a las heces y se llevó a cabo el tratamiento con PMA, y se cuantificó la YIT 12272 mediante PCR cuantitativo usando el iniciador específico para YIT 12272. Como resultado, el tratamiento con PMA no inhibió la amplificación PCR en la YIT 12272 viable, resultando que, cuando la YIT 12272 está presente en una cantidad de 105, o más por gramo de heces, la YIT 12272 viable se puede cuantificar precisamente (figura 5). Aquí, el conteo bacterial viable de YIT 12272 puede ser calculado con la siguiente fórmula 3.

Símbolo Valor cuantitativo PCR de YIT 12272 sin tratamiento con PMA: células X/g Valor cuantitativo PCR de YIT 12272 sometido a tratamiento con PMA: células Y/g El conteo bacterial viable de YIT 12272 en una muestra: células L/g El conteo bacterial muerto de YIT 12272 en una muestra: células D/g Fórmula 1 : X = L + D Fórmula 2: Y = L + D/20000 Fórmula 3 (la fórmula 3 se deriva de las fórmulas 1 y 2): L = (20000Y - X)/19999 El siguiente método se usó para la extracción de ADN de las heces. Usando una solución diluyente anaeróbica (Cuadro 10), se preparó una solución de heces diluida 10 veces. Entonces, se centrifugaron 0.2 mL de la solución y se removió un sobrenadante, esto seguido de una re-suspensión en 1.0 mL de un regulador de pH PBS. La operación de lavado anterior se repitió tres veces. Posteriormente, el gránulo de heces así obtenido se almacenó a -80°C hasta la extracción del ácido nucleico. El gránulo liofilizado de heces se descongeló, y al mismo se le agregaron 0.6 mL de un regulador de pH ASL, esto seguido de calentamiento a 70°C por cinco minutos. Subsecuentemente, se agregaron 0.5 mL de fenol TE-saturado y 0.7 g de perlas de vidrio con un diámetro de 0.1 mm, y la mezcla resultante fue agitada vigorosamente a 6.5 m/s por 30 segundos usando FastPrep FP120 (Bio101 , Inc.). Entonces, se agregaron 0.1 mL de acetato de sodio 3M y un sobrenadante se obtuvo por centrifugación. En 0.7 mL del sobrenadante, se agregaron 0.7 mL de un regulador de pH ASL y tabletas Inhibit EX (QIAGEN). La mezcla resultante fue muy bien mezclada y centrifugada para obtener un sobrenadante. A 0.55 mL del sobrenadante, se les agregó 0.55 mL de un regulador de pH AL (QIAGEN) y 0.55 mL de etanol al 100%, esto seguido por agitación. Subsecuentemente, toda la mezcla resultante fue pasada a través de una columna giratoria QIAmp (QIAGEN) para permitir que el ADN adsorbiera en la columna. Después de lavar la columna, se agregaron 0.1 mL de un regulador de pH AE (QIAGEN) y la solución resultante se centrifugó, de donde se colectó el ADN.

CUADRO 10 Composición de la solución diluyente anaeróbica.

Componente composición (g/L) KH2P04 0.225 K2HP04 0.225 NaCI 0.45 (NH4)2S04 0.225 CaCI2 0.0225 MgS04 0.0225 L-Cisteína clorhidrato monohidrato 0.5 Resazurina 0.001 Bacto agar 0.5 Tween 80 0.5 (3) Detección y cuantificación de YIT 12272 vivas en heces en una prueba de ingestión oral.

Se condujo un estudio en el que adultos sanos a quienes se les había prohibido consumir productos alimenticios que contuvieran bacterias vivas por tres semanas se sometieron a ingestión de un paquete (100 mL) de producto lácteo fermentado del ejemplo 6 (que contiene YIT 12272 en una cantidad de 1010 5/paquete) de forma diaria y continua por 10 días. (3-1 ) Detección de YIT 12272 vivas mediante una combinación de medio selectivo y el iniciador especifico para YIT 12272 Se colectaron heces de los sujetos de estudio antes y después de ingerir el producto lácteo fermentado que contiene YIT 12272 del ejemplo 6 y se sometieron a dilución en serie de 10 usando un regulador de pH de dilución (PBS) De la solución resultante, se aplicaron 100 µ? a un medio selectivo de YIT 12272 (T-CBPC, Cuadro 1 1 ), esto seguido de cultivo anaeróbico a 37°C por 72 horas para formar colonias. Las colonias así obtenidas se cultivaron anaeróbicamente a 37°C por 24 horas en un medio líquido GAM con glucosa al 1 % agregada (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), de donde se obtuvieron las células bacteriales. Se extrajo el ADN de las células bacteriales, y se llevó a cabo PCR usando el ADN así obtenido como un modelo y el iniciador específico para YIT 12272. También, algunas de las cepas bacteriales se sometieron a identificación de cepa bacterial mediante la prueba RAPD. Como consecuencia, los resultados de la identificación de YIT 12272 de ambos métodos mencionados anteriormente coincidieron perfectamente. Hasta ahora, para determinar una colonia formada en el medio selectivo como YIT 12272, han sido necesarios ensayos RAPD y ELISA muy tardados y complejos (Ensayo inmunosorbente vinculado a Enzima) usando un anticuerpo monoclonal específico de YIT 12272. Sin embargo, se mostró que el uso del iniciador específico para YIT 12272 permitió una rápida y simple determinación de ??? 2272.

CUADRO 11 Composición del medio selectivo de YIT 12272 (T-CBPC) Componente Composición (/L) medio de agar propionato TOS (Yakult g„ 5 Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) ' ^ Solución antibiótica* 50 mL 'Agregado después de autoclave a 115°C por 15 min.

Contiene lo siguiente por 50 mL Sal disódica de Carbenicilina y sal sulfato de n nn A .. . . . . 3 0.001 g Estreptomicina 5000000U (3-2) Cuantificación de YIT 12272 vivas en heces Para detectar YIT 12272 vivas en heces colectadas de sujetos de estudio antes y después de ingerir el producto lácteo fermentado que contiene YIT 12272 del ejemplo 6, se suspendieron granulos de heces en 0.5 mL de PBS, y en la misma se agregaron 1.4 µ?_ de una solución de 20 mM de PMA (concentración final de 50 µ?). La mezcla resultante se agitó suavemente y se almacenó en la oscuridad por cinco minutos. Subsecuentemente, la mezcla se irradió con luz intensa por dos minutos usando una lámpara halógena y se centrifugó, y se removió un sobrenadante. Se extrajo ADN de las heces tratadas con PMA, y las YIT 12272 vivas en las heces se cuantificaron combinando PCR cuantitativo usando el iniciador específico para YIT 12272. También, el conteo bacterial total de YIY 12272, incluyendo células muertas en heces fue simultáneamente cuantificado sin tratamiento PMA. Los resultados así obtenidos se muestran en el Cuadro 12, junto con el CFU de YIT 12272 obtenido usando un medio selectivo de agar T- CBPC. YIT 12272 no fue detectada en heces colectadas de los sujetos de estudio antes de ingerir el producto lácteo fermentado que contiene YIT 12272 ya sea por el método de cultivo o por PCR cuantitativo usando el iniciador específico para YIT 12272. En contraste, el número total (viable y muerto) de B. breve YIT 12272 detectado por qPCR sin tratamiento PMA fue de 08 ± 0 8 , el número viable de B. breve YIT 12272 detectado por qPCR con tratamiento PMA fue de 107 5 ± 1 0 , y 106 9 ± 1 5 CFU de YIT 12272 fue detectado usando un medio selectivo específico de una cepa, por gramo de las heces colectadas de los sujetos de estudio que completaron la ingestión. Además, debido a que el valor cuantitativo de la célula bacterial muerta tratada con PMA obtenida de PCR fue lo suficientemente pequeño, el conteo bacterial viable de YIT 12272 calculado mediante la fórmula 3 fue igual que el del conteo bacterial obtenido mediante el PCR cuantitativo después del tratamiento con PMA (Cuadro 12). De acuerdo con esto, se confirmó que el uso del tratamiento PMA y PCR cuantitativo permitía la determinación del conteo bacterial viable de YIT 12272.

CUADRO 12 Conteo bacterial de YIT 12272 en heces colectadas de sujetos de estudio antes y después de la ingestión del producto lácteo fermentado que contiene YIT 12272 Conteo bacterial de YIT 12272 en heces colectadas de sujetos de estudio antes y después de la ingestión del producto lácteo fermentado que contiene YIT 12272.

Muestra Células Logto o heces CFU/g Antes de la ingestión Después de la ingestión PCR cuantitativo PCR cuantitativo CFU Sin tratamiento Tratamien Sin Tratamien PMA to PMA tratamiento to PMA (Célula viva + (Célula CFU PMA (Célula célula muerta) viva) (Célula viva viva) + célula muerta) a < 5.0a) < 5.0 < 2.0a) 8.5 8 4 7.9 b < 5.0 < 5.0 < 2.0 6.7 < 5.0 3.3 c < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.5 8.3 7.4 d < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.8 8.4 7.9 e < 5.0 < 5.0 < 2.0 6.4 5.3 4.8 ( < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.4 7.9 7.6 9 < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.4 7.7 6.9 h < 5.0 < 5.0 < 2.0 9.1 8.8 8.3 I < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.2 7.1 6.8 j < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.2 8.0 7.2 k < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.5 8.1 7.5 Promedio"1 < 5.0 < 5.0 < 2.0 8.1 7.5 6.9 S.D.b) - - - 0.8 1.0 1.5 a) El limite de detección de YIT 12272 mediante PCR cuantitativo es 10 células/gramo de heces y el del método de cultivo es 102 CFU. b) Si cualquier muestra se presentara por debajo del límite de detección, se calcularían un valor promedio y un S.D. de la muestra basándose en el conteo bacterial del límite de detección.

Hasta ahora, se llevó a cabo un método para detectar y cuantificar YIT 12272 en heces permitiendo que las bacterias formen una colonia en el medio selectivo, y una prueba para confirmar una colonia como YIT 12272 ha requerido trabajo y tiempo considerables. También, considerando que el medio selectivo contiene una alta concentración de antibiótico, se señala una posibilidad de que las bacterias dañadas no se puedan dividir, por lo que la YIT 12272 viva es subestimada. El PCR cuantitativo usando el iniciador específico para YIT 12272 de la presente invención permite la cuantificación de toda la YIT 12272 en heces sin importar si está viva o muerta. Además, sólo la YIT 12272 viva en heces puede ser rápida y simplemente cuantificada combinando P A, el cual un colorante permeable de membrana.

EJEMPL0 13 Prueba de recuperación de bacterias ingeridas Diecinueve adultos sanos entre veinte y cincuenta años fueron divididos aleatoriamente en dos grupos, y después de siete días de observación (periodo de observación), los sujetos de estudio ingirieron un paquete (100 ml_) ya sea del producto lácteo fermentado preparado usando la cepa YIT 12272 (bebida de prueba) o un producto lácteo fermentado preparado usando la cepa YIT 10001 en lugar de YIT 12272 (bebida control), los cuales fueron producidos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6 por siete días (período de ingestión 1 ). Después de 10 días de interrupción (período de interrupción), los sujetos de estudio que ingirieron ya sea la bebida de prueba o la bebida control se compararon, y la ingestión se continuó por siete días (período de ingestión 2) Las heces se colectaron al día siguiente del día final del período del observación, cada período de ingestión, y el período de interrupción. Se debe notar que a los sujetos de estudio se les prohibió ingerir cualquier producto lácteo fermentado o productos probióticos distintos de la bebida de prueba o la bebida control durante el período de prueba. También, los conteos bacteriales de la Bifidobacterium en la bebida de prueba y la bebida de control fueron de 6.8 a 8.9 ? 108 CFU/mL y 2.9 a 4.2 x 108 CFU/mL, respectivamente.

De acuerdo con el Ejemplo 12, usando el medio selectivo de agar T-CBPC, se obtuvo el CFU de las bacterias ingeridas en heces (cepa YIT 12272 o cepa YIT 10001). Usando el método RAPD o el iniciador específico para la cepa YIT 12272 como se muestra en el Cuadro 8, se condujo una prueba cualitativa de la cepa bacterial.

Aunque las bacterias ingeridas no fueron detectadas en heces colectadas de ninguno de los sujetos de estudio antes de la ingestión del producto lácteo fermentado, los conteos bacteriales de las bacterias ingeridas en el grupo que ingirió la bebida de prueba y en el grupo que ingirió la bebida control después de la ingestión fueron de 7.3 ± 0.8 Log CFU/g y 5.9 ± 1.1 Log CFU/g, respectivamente, mostrando que el conteo bacterial fue significativamente más alto en el grupo que ingirió la bebida de prueba que en el grupo que ingirió la bebida control (Cuadro 13). Se debe notar que no se observó ningún evento adverso asociado con la ingestión ya sea de la bebida de prueba o de la bebida control durante el período de estudio.

CUADRO 13 El conteo bacterial de bacterias ingeridas en heces ##: p<0.01 Comparado con el grupo que ingirió la bebida control (prueba t independiente de dos grupos) ND: Por debajo del límite de detección (102 CFU) Se reveló que, mediante la ingestión del presente producto lácteo fermentado, tanto la cepa YIT 12272 como la cepa YIT 10001 fueron colectadas vivas de las heces; sin embargo, el conteo bacterial de la cepa YIT 12272 fue significativamente más alto que el de YIT 10001. Se consideró que este resultado reflejó que la cepa YIT 12272 tenía viabilidad favorable en un producto, y al mismo tiempo su resistencia contra jugo gástrico artificial y fluido biliar o intestinal artificiales fue mejorada.

EJEMPLO 14 Prueba 1 de la acción reguladora intestinal Se condujo una prueba abierta en la que 57 sujetos de estudio de 63 años o más que sufren de estreñimiento o son proclives al estreñimiento (de tres a cinco veces de movimiento intestinal/semana, contenido de agua en las heces de menos de 70%, 27 hombres y 30 mujeres, edad promedio de 68.7 ± 5.4) ingirieron, después de dos semanas del período de observación, un paquete (100 ml_) del producto lácteo fermentado descrito en el Ejemplo 8 diariamente por cuatro semanas. En la semana final del período de observación y del período de ingestión, se examinaron la condición del movimiento intestinal y la propiedad de las heces (La Escala de Heces de Bristol). Se debe notar que a los sujetos de estudio se les prohibió ingerir cualquier producto lácteo fermentado o productos probióticos distintos del producto lácteo fermentado durante el período de prueba. También, el conteo bacterial de la Bifidobacterium en el presente producto lácteo fermentado fue de 1 x 108 CFU/mL o más.

Comparado con el de antes de la ingestión, el número de movimientos intestinales, el número de días teniendo movimiento intestinal, y la cantidad de heces fueron significativamente incrementados después de la ingestión. También, se mejoró significativamente el puntaje en la Escala de Heces de Bristol, y se normalizaron las heces duras (Cuadro 14). Se debe notar que no se observó ningún evento adverso asociado con la ingestión del presente producto lácteo fermentado durante el período de prueba. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que el presente producto lácteo fermentado tenía un acción reguladora intestinal.

CUADRO 14 Condición de movimiento intestinal y propiedad de las heces durante el período de observación y el período de ingestión una forma cilindrica de un diámetro de 2 cm y una altura de 5 cm se estableció como una unidad. 21 : Basándose en la Escala de Heces de Bristol, se evaluaron las heces en una escala del uno al siete: (1) trozos separados, (2) duras, (3) grietas en la superficie, (4) superficie lisa, (5) semisólidas, (6) lodosas, y (7) líquidas. : p<0.01 Comparado con el período de observación (prueba t de dos grupos relacionados) #: p<0.05 Comparado con el periodo de observación (prueba de suma de rangos con signos de Wilcoxon) EJEMPLO 15 Prueba 2 de la acción reguladora intestinal Se condujo una prueba de comparación de grupos paralelos, doble ciego, controlada con placebo, en la que 75 estudiantes mujeres proclives al estreñimiento (de 18 a 23 años, con cinco o menos movimientos intestinales/semana) ingirieron, después de cuatro semanas de período de observación, un paquete (100 mL) ya sea del producto lácteo fermentado descrito en el Ejemplo 6 (el grupo de prueba) o una bebida placebo (leche no fermentada sin bacterias, galactooligosacárido, y polidextrosa, el grupo placebo) diariamente por cuatro semanas. En la semana final del periodo de observación y del período de ingestión, se examinaron la condición del movimiento intestinal y la propiedad de las heces (La Escala de Heces de Bristol). Se debe notar que a los sujetos de estudio se les prohibió ingerir cualquier producto lácteo fermentado o productos probióticos distintos del presente lácteo fermentado o la bebida placebo durante el período de estudio. También, el conteo bacterial de la Bifidobacterium en el presente producto lácteo fermentado fue de 1 ? 108 CFU/mL o más.

Se analizaron cuarenta y cuatro sujetos de estudio en quienes el contenido de agua en las heces era de menos de 70% (Cuadro 15). Como resultado, se encontró que el grupo de prueba mostró una tendencia a movimientos intestinales más frecuentes en el período de ingestión comparada con el grupo placebo (p = 0.081 ). Aunque no se observó cambio en el número de días teniendo movimiento intestinal entre el período de ingestión y el período de observación en el grupo placebo, este se incrementó significativamente en el grupo de prueba en el período de ingestión comparado con el período de observación, y fue significativamente más alto en el grupo de prueba comparado con el grupo placebo en el período de ingestión. Aunque el puntaje de la propiedad fecal no cambió en el grupo placebo en el período de ingestión comparado con el período de observación, el puntaje se incrementó significativamente en el grupo de prueba, indicando un propiedad fecal mejorada. También, en el período de ingestión, el grupo de prueba mostró una tendencia a tener un puntaje alto para la propiedad fecal (P = 0.070) comparado con el del grupo placebo. Se debe notar que no se observó ningún evento adverso asociado con la ingestión del presente producto lácteo fermentado o de la bebida placebo durante el período de estudio. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que el presente producto lácteo fermentado tenía una acción reguladora intestinal.

CUADRO 15 Condición de movimiento intestinal y propiedad de las heces durante el período de observación y el periodo de ingestión siete: (1 ) trozos separados, (2) duras, (3) grietas en la superficie, (4) superficie lisa, (5) semisólidas, (6) lodosas, y (7) liquidas. ": p<0.05 Comparado con el periodo de observación (prueba de t de dos grupos relacionados o suma de rangos con signos de Wilcoxon) #: p<0.05 Comparado con el grupo placebo (prueba t de dos grupos independientes) al: p=0.081 Comparado con el grupo placebo (prueba t de dos grupos independientes) p=0.070 Comparado con el grupo placebo (prueba de suma de rangos con signos de Wilcoxon) EJEMPLO 16 Prueba sobre una acción inhibidora en la producción de un producto de putrefacción.

Se condujo una prueba de comparación de grupos paralelos, doble ciego, controlada con placebo, en la que 39 estudiantes mujeres de entre veinte y setenta años se dividieron en dos grupos de modo que ambos grupos fueran igualados en términos de edad, estatura, peso corporal, e IMC, y después de cuatro semanas de período de observación, ingirieron un paquete (100 ml_) ya sea del producto lácteo fermentado del Ejemplo 6 (el grupo de prueba) o una bebida placebo (leche no fermentada sin bacterias, galactooligosacárido, y polidextrosa, el grupo placebo) diariamente por cuatro semanas. En la semana final del período de observación y del período de ingestión, se colectó sangre de los brazos de los sujetos de estudio. Se debe notar que a los sujetos de estudio se les prohibió ingerir cualquier producto lácteo fermentado o productos probióticos distintos del presente lácteo fermentado o la bebida placebo durante el período de prueba. También, el conteo bacterial de la Bifidobacterium en el presente lácteo fermentado fue de 1 x 108 CFU/mL o más.

Se preparó suero a partir de la sangre así colectada de acuerdo con el método ordinario, la cual se almacenó congelada a -80°C. Entonces, 25 µ?_ del suero, 475 µ?_ de agua milli-Q, 200 µ?_ de ácido clorhídrico, y 10 µ?_ de una solución estándar interna (obtenida por dilución 300 veces de 4-clorofenol (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) con acetato de etilo (Sigma)) se agitaron y mezclaron, y la mezcla resultante fue calentada a 100°C por 60 minutos en un tubo de ensayo sellado. Después de enfriar, se agregaron 2 ml_ de dietil éter a la mezcla resultante: esto seguido de agitación, y se colectó 1 ml_ de la capa resultante de dietil éter y se mezcló con 1 ml_ de metanol conteniendo hidróxido de sodio 0.05 N. La mezcla resultante se secó para ser solidificada con un evaporador centrífugo y después se disolvió en 200 µL· de acetato de etilo. La mezcla resultante se filtró a través de un filtro de 0.45 µ?t? (Ultrafree-MC, Millipore Corporation), en donde se preparó una muestra HPLC. También, se mezclaron y proporcionaron como una solución estándar 25 µ? de una solución obtenida al diluir para-cresol (Nacalai tesque, Inc.) de 0 a 0.01 % con acetato de etilo, 675 µ? de acetato de etilo, y 10 µ? de la solución estándar interna. Se condujo un análisis HPLC de para-cresol bajo las siguientes condiciones.

Sistema HPLC: Alliance 2695 (Waters Corporation) Detector: detector de fluorescencia Ex 260 nm, Ev 305 nm (usando un detector UV de 270 nm en combinación) Columna: Columna L 4.6 ? 50 mm, un diámetro de partícula de 5 µ?? (Chemical Evaluation and Research Institute) Temperatura de columna: 40°C Eluyente: %A; 0.1 % ácido fosfórico, %B; acetonitrílo, %A/%B = 80/20 (¡socrático) Caudal: 1.0 mL/min Volumen de inyección: 10 µ?_ Temperatura de la cámara de muestra: 10°C Tiempo de medición: 30 minutos Aunque la concentración de para-cresol en sangre después de la ingestión no cambió comparada con el grupo placebo antes de la ingestión, la concentración disminuyó significativamente en el grupo de prueba. También, fue significativamente más baja en el grupo de prueba comparada con la del grupo placebo (Cuadro 16). Se debe notar que no se observó ningún evento adverso asociado con la ingestión del presente producto lácteo fermentado o de la bebida placebo durante el período de prueba.

CUADRO 16 Concentración de para-cresol en sangre antes v después de la ingestión : p<0.05 Comparado con antes de la ingestión (prueba t de dos grupos relacionados) p<0.05 Comparado con el grupo placebo (prueba t de dos grupos independientes) Los resultados anteriores revelaron que la ingestión del presente lácteo fermentado disminuyó la concentración de sangre en un producto de putrefacción intestinal (para-cresol), el cual es una sustancia biológicamente tóxica producida por bacterias intestinales. Esto se consideró como un resultado de la inhibición de la producción de para-cresol en el intestino debido a una acción mejoradora del ambiente intestinal. Esto es, se consideró que el presente lácteo fermentado tiene una acción mejoradora del ambiente intestinal.

Aplicación industrial El método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de la presente invención permite la adquisición de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tienen excelente viabilidad incluso bajo condiciones con diferentes factores ambientales. Esta cepa bacterial puede ser aplicada a varios alimentos y bebidas, y debido a su alta viabilidad en alimentos y bebidas, las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium pueden mostrar de manera efectiva sus funciones fisiológicas. También, una cepa bacterial utilizable en varios alimentos y bebidas puede ser producida mediante el mejoramiento de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que tengan un efecto fisiológico específico como una acción de bacterias anti-Helicobacter pylori a través del método de producción de la presente invención; por lo tanto, la presente invención tiene una aplicabilidad industrial extremadamente alta.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que comprende subcultivo y almacenamiento de las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium al menos dos veces alternadamente en al menos dos tipos de sistemas bajo condiciones con diferentes factores ambientales.

2 - El método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el factor ambiental es uno o más seleccionado del grupo que consiste de pH, presión osmótica, acidez, temperatura de cultivo, y un factor nutricional.

3.- El método para producir bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 1 ó 2; caracterizado además porque comprende los pasos de (1) cultivar una cepa madre o bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium bajo una condición con el factor ambiental A para obtener un caldo de cultivo o un alimento o bebida, y almacenar el caldo de cultivo o el alimento o bebida para concentrar o seleccionar una cepa que exhiba viabilidad mejorada bajo la condición con el factor ambiental A, (2) entonces, cultivar la cepa que exhiba viabilidad mejorada bajo una condición con el factor ambiental B diferente del factor ambiental A, para obtener un caldo de cultivo o un alimento o bebida, y almacenar el caldo de cultivo o el alimento o bebida para concentrar o seleccionar una cepa que exhiba viabilidad mejorada bajo la condición con el factor ambiental B, y (3) repetir los pasos de (1) y (2) al menos dos veces para obtener bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium que exhiban excelente viabilidad bajo la condición con los factores ambientales A y B.

4. - Bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium obtenidas mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. - Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas además porque las bacterias son Bifidobacterium breve.

6. - Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de conformidad con la reivindicación 5, caracterizadas además porque las bacterias son Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320).

7.- Un alimento o bebida que comprende las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. - El alimento o bebida de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el alimento o bebida es un alimento o bebida fermentada.

9. - El alimento o bebida de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el alimento o bebida es un alimento o bebida láctea fermentada.

10. - El alimento o bebida de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado además porque también comprende un endulzante.

11. - Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia.

12. - Un iniciador para Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) que comprende una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia.

13.- Un iniciador establecido para Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) que comprende una combinación de dos secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NOs: 1 y 2 o una combinación de dos secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias.

14. - Un método para detectar Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) que comprende detección mediante el uso del iniciador de la reivindicación 12 ó 13.

15. - Un método para detectar Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) que comprende detección mediante el uso del iniciador de la reivindicación 12 ó 13.

16.- Un método para cuantificar un conteo bacterial viable de Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) que comprende realizar una reacción PCR mediante el uso de una muestra tratada con un colorante permeable de membrana y el iniciador de la reivindicación 12 ó 13.