JP2022079857A - Ｄｐｐ－４阻害用組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＤＰＰ－４（ジペプチジルペプチダーゼ－４）阻害ペプチドを高含有する組成物の新規製造方法を提供する。【解決手段】タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ（Ｎ末端から２番目にプロリンを持つ構造を有するペプチドを分解するエキソペプチダーゼ）活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させてＤＰＰ－４阻害ペプチドを得る工程と、を含むことを特徴とするＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。【選択図】図１
Description
本発明は、タンパク質と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させてＤＰＰ－４阻害ペプチドを得る工程と、を含むことを特徴とするＤＰＰ－４阻害剤の製造方法およびその方法により調製される飼料、医薬品、及び飲食品に関する。本発明は、前記ＤＰＰ－４阻害剤の製造方法に用いる乳酸菌にも関する。また、本発明は、発酵飲食品の製造方法にも関する。
ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４）はタンパク質やペプチドのＮ末端から２番目のアラニンまたはプロリンを認識し、Ｎ末端のジペプチドを切り出す酵素である。食後の血糖調節に重要なホルモンであるＧＬＰ－１やＧＩＰは、ＤＰＰ－４によって速やかに分解され生理活性を失う。ＤＰＰ－４を阻害することで、ＧＬＰ－１やＧＩＰの分解が抑制される。ＤＰＰ－４を阻害することにより、食後血糖の上昇を抑制できるため、ＤＰＰ－４阻害剤が糖尿病治療薬として上市されている。
ＤＰＰ－４阻害剤は、糖尿病治療薬のような医薬品だけでなく、食品としても数多く報告されている。例えば特許文献１では小豆、インゲン豆発酵物が、特許文献２では大豆発酵物が、また特許文献３ではチーズがそれぞれＤＰＰ－４阻害活性をもつことが示されている。医薬品と違い、副作用が少なく日常的に摂取可能であるため、ＤＰＰ－４阻害剤としての食品は糖尿病等の疾患に対する予防効果が期待される。
食品中でＤＰＰ－４阻害活性を示す有効成分として報告されているものの多くは、競合阻害作用を示すペプチドである。例えば特許文献３では、ＤＰＰ－４活性を阻害するチーズ由来ペプチドを種々例示しているが、すべてＮ末端から２番目にプロリンまたはアラニンを持つ構造を持つ。これらのペプチドは、ＤＰＰ－４によって認識されるため、ＤＰＰ－４によるＧＬＰ－１やＧＩＰの分解を競合的に阻害する作用を持つと考えられる。すなわち、Ｎ末端から２番目にプロリンまたはアラニンを持つ構造を持つ競合阻害ペプチドを高含有する食品の製造方法を確立すれば、糖尿病予防食品が製造可能となる。
食品における種々のペプチドを安価に且つ高効率に増加させる工程として、古来より発酵が用いられてきた。発酵に使用される菌として最も一般的なものの一つが乳酸菌である。乳酸菌は、チーズや発酵乳などの発酵乳製品、または生ハムなどの畜肉製品の製造に広く使用されており、発酵過程で独特のペプチドやアミノ酸を産生する。これらのペプチドやアミノ酸は、乳酸菌が保有するプロテアーゼやペプチダーゼによって生じるものであり、乳酸菌の菌種、菌株で保有する酵素の種類や活性の強さが異なることが知られている。そのため、ペプチドを高含有する発酵食品を製造するために、プロテアーゼ活性やペプチダーゼ活性の高い乳酸菌を選抜するアプローチがとられてきた（非特許文献１）。
一方、特定のペプチドを高含有する食品を製造する目的においては、望ましくない活性を持つ酵素も存在する。例えば、乳酸菌の持つＰｅｐＸという酵素は、Ｎ末端から２番目にプロリンを持つ構造を有するペプチドを分解するエキソペプチダーゼである。ＰｅｐＸは前述のＤＰＰ－４競合阻害ペプチドを分解してしまうため、ＰｅｐＸ活性が高い菌株は、発酵食品のＤＰＰ－４阻害活性を低下させてしまうという問題点があった。すなわち、発酵によりＤＰＰ－４競合阻害ペプチドが産生されたとしても、該乳酸菌株が有するＰｅｐＸ活性により、産生されたＤＰＰ－４競合阻害ペプチドが分解されるという問題があった。しかしながら、非特許文献１に記載のように、従来では、ＰｅｐＸを含む種々のペプチダーゼ活性が高い株が、発酵性能の良い株として選抜されることもあった。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９５）、６２、６０１－６１０
本発明は、ＤＰＰ－４阻害ペプチドの新規製造方法を提供することを主目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、ＰｅｐＸ活性が非常に低い乳酸菌を見出し、これらの乳酸菌を用いてタンパク質を発酵することでＤＰＰ－４阻害活性を持つペプチドが高効率で得られることを見出した。
本発明は、具体的には以下のとおりである。
＜１＞
ＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法であって、
タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、
前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させてＤＰＰ－４阻害ペプチドを得る工程と、を含むことを特徴とするＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜２＞
乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性が、１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることを特徴とする＜１＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜３＞
ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌で、タンパク質又はタンパク質を含む原料を発酵したときの水溶性画分（１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ）が、純水を添加したコントロールのサンプルと比較して、ＤＰＰ－４活性を５０％以上阻害することを特徴とする＜１＞または＜２＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜４＞
ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜５＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓから成る群から選択される少なくとも１つ以上であることを特徴とする＜４＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜６＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）から成る群から選択される少なくとも１つ以上であることを特徴とする＜４＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜７＞
食品添加物グレードのエンド型プロテアーゼまたはペプチダーゼを併用した＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜８＞
＜１＞～＜７＞のいずれか一項に記載の方法により調製される、ＤＰＰ－４阻害ペプチド含有飼料、ＤＰＰ－４阻害ペプチド含有医薬品、又はＤＰＰ－４阻害ペプチド含有飲食品。
＜９＞
新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）
＜１０＞
新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）
＜１１＞
発酵飲食品の製造方法であって、
タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、
前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させて発酵飲食品を得る工程と、
を含み、
前記乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性が、１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることを特徴とする発酵飲食品の製造方法。
＜１＞
ＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法であって、
タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、
前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させてＤＰＰ－４阻害ペプチドを得る工程と、を含むことを特徴とするＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜２＞
乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性が、１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることを特徴とする＜１＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜３＞
ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌で、タンパク質又はタンパク質を含む原料を発酵したときの水溶性画分（１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ）が、純水を添加したコントロールのサンプルと比較して、ＤＰＰ－４活性を５０％以上阻害することを特徴とする＜１＞または＜２＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜４＞
ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜５＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓから成る群から選択される少なくとも１つ以上であることを特徴とする＜４＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜６＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）から成る群から選択される少なくとも１つ以上であることを特徴とする＜４＞に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜７＞
食品添加物グレードのエンド型プロテアーゼまたはペプチダーゼを併用した＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
＜８＞
＜１＞～＜７＞のいずれか一項に記載の方法により調製される、ＤＰＰ－４阻害ペプチド含有飼料、ＤＰＰ－４阻害ペプチド含有医薬品、又はＤＰＰ－４阻害ペプチド含有飲食品。
＜９＞
新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）
＜１０＞
新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）
＜１１＞
発酵飲食品の製造方法であって、
タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、
前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させて発酵飲食品を得る工程と、
を含み、
前記乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性が、１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることを特徴とする発酵飲食品の製造方法。
本発明によればＤＰＰ－４阻害活性を持つペプチドを効率良く製造することができる。
（原材料に用いるタンパク質）
本発明の製造方法における発酵ミックス調製工程の原材料としては、動物由来、植物由来いずれのタンパク質でも使用することもできる。そのような原材料として、例えば、肉類、魚介類、乳類、大豆、小麦等が挙げられるが、その中でも、食経験が豊かで安全な乳酸菌の生育に適した乳類、大豆又はそれらの加工品が好ましい。乳類としては、食品製造に通常用いられる乳であればいずれの乳を使用してもよく、例えば全乳、脱脂調製乳、還元乳、濃縮乳、バターミルク、クリーム、脱脂粉乳、乳蛋白、豆乳等又はこれらの混合物を挙げることができる。
本発明の製造方法における発酵ミックス調製工程の原材料としては、動物由来、植物由来いずれのタンパク質でも使用することもできる。そのような原材料として、例えば、肉類、魚介類、乳類、大豆、小麦等が挙げられるが、その中でも、食経験が豊かで安全な乳酸菌の生育に適した乳類、大豆又はそれらの加工品が好ましい。乳類としては、食品製造に通常用いられる乳であればいずれの乳を使用してもよく、例えば全乳、脱脂調製乳、還元乳、濃縮乳、バターミルク、クリーム、脱脂粉乳、乳蛋白、豆乳等又はこれらの混合物を挙げることができる。
（ラクトバチルス属またはラクトコッカス属に属する乳酸菌）
本発明の製造方法における発酵ミックス調製工程においては、粗酵素のＸ－Ｐｒｏジペプチダーゼ活性（ＰｅｐＸ活性）が１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下の乳酸菌を用いることが好ましい。乳酸菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に分類される乳酸菌が好ましい。なお、本明細書において「粗酵素」とは、乳酸菌を破砕して、遠心分離などを行うことにより得られた抽出物を意味する。
具体的にはラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ブルガリクスデルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス パラカゼイ サブスピーシーズ パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
本発明の製造方法における発酵ミックス調製工程においては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）を使用することが好ましい。
上記の菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（日本、千葉県、木更津市）から入手することができる。
本発明の製造方法における発酵ミックス調製工程においては、粗酵素のＸ－Ｐｒｏジペプチダーゼ活性（ＰｅｐＸ活性）が１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下の乳酸菌を用いることが好ましい。乳酸菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に分類される乳酸菌が好ましい。なお、本明細書において「粗酵素」とは、乳酸菌を破砕して、遠心分離などを行うことにより得られた抽出物を意味する。
具体的にはラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ブルガリクスデルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス パラカゼイ サブスピーシーズ パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
本発明の製造方法における発酵ミックス調製工程においては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）を使用することが好ましい。
上記の菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（日本、千葉県、木更津市）から入手することができる。
（ラクトバチルス属またはラクトコッカス属に属する菌の調製）
本発明の製造方法における発酵工程において使用する乳酸菌は、各菌の培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一例を以下に示す。ラクトバチルス属に属する乳酸菌はＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、ラクトコッカス属に属する乳酸菌はＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いてそれぞれ培養し、得られた培養物を遠心分離により集菌することにより菌体を得る。得られた菌体をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体を用いることもできる。ビーズショッカー、超音波破砕機、フレンチプレス等の破砕装置により破砕した菌体をそのまま用いてもよいし、破砕した菌体を遠心分離して上清の粗酵素抽出物を用いることもできる。
本発明の製造方法においては、培養前の発酵ミックスにおいて、生菌が１×１０４ｃｆｕ／ｇ～１×１０１０ｃｆｕ／ｇ、１×１０５ｃｆｕ／ｇ～１×１０９ｃｆｕ／ｇ、又は１×１０６ｃｆｕ／ｇ１×１０８ｃｆｕ／ｇとなるように調整することができる。粗酵素抽出物を用いる場合は、実施例の手順により調製したものを、培養前の発酵ミックスにおいて、０．０１質量％～２０質量％、０．０５質量％～１０質量％、０．０５質量％～１０質量％、又は０．１質量％～５％となるように調整することができる。
本発明の製造方法における発酵工程において使用する乳酸菌は、各菌の培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一例を以下に示す。ラクトバチルス属に属する乳酸菌はＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、ラクトコッカス属に属する乳酸菌はＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いてそれぞれ培養し、得られた培養物を遠心分離により集菌することにより菌体を得る。得られた菌体をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体を用いることもできる。ビーズショッカー、超音波破砕機、フレンチプレス等の破砕装置により破砕した菌体をそのまま用いてもよいし、破砕した菌体を遠心分離して上清の粗酵素抽出物を用いることもできる。
本発明の製造方法においては、培養前の発酵ミックスにおいて、生菌が１×１０４ｃｆｕ／ｇ～１×１０１０ｃｆｕ／ｇ、１×１０５ｃｆｕ／ｇ～１×１０９ｃｆｕ／ｇ、又は１×１０６ｃｆｕ／ｇ１×１０８ｃｆｕ／ｇとなるように調整することができる。粗酵素抽出物を用いる場合は、実施例の手順により調製したものを、培養前の発酵ミックスにおいて、０．０１質量％～２０質量％、０．０５質量％～１０質量％、０．０５質量％～１０質量％、又は０．１質量％～５％となるように調整することができる。
（ＰｅｐＸ活性の評価方法）
実施例に記載の方法、すなわち、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた方法で評価が可能である。具体的には、以下のとおりである。
（１）菌体粉末を１ｍｇ／ｍｌになるように緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＳＦＸ１５０ＨＨ（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて氷上にて超音波破砕する（ｏｎ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｏｆｆ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｔｏｔａｌ ３０ｍｉｎ、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０％）。
（２）破砕後、４℃にて１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収する。
（３）キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを調製する。
（４）３８４ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）または実施例品１を２０μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。
（５）インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００ｍｓｅｃにて発光強度（ＲＬＵ）を測定する。
（６）タンパク質濃度を、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて測定する。
（７）ＲＬＵを、反応時間（３０ｍｉｎ）、反応液量（４５μｌ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）にて補正し、ＰｅｐＸ活性単位（ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として算出する。
実施例に記載の方法、すなわち、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた方法で評価が可能である。具体的には、以下のとおりである。
（１）菌体粉末を１ｍｇ／ｍｌになるように緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＳＦＸ１５０ＨＨ（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて氷上にて超音波破砕する（ｏｎ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｏｆｆ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｔｏｔａｌ ３０ｍｉｎ、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０％）。
（２）破砕後、４℃にて１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収する。
（３）キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを調製する。
（４）３８４ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）または実施例品１を２０μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。
（５）インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００ｍｓｅｃにて発光強度（ＲＬＵ）を測定する。
（６）タンパク質濃度を、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて測定する。
（７）ＲＬＵを、反応時間（３０ｍｉｎ）、反応液量（４５μｌ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）にて補正し、ＰｅｐＸ活性単位（ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として算出する。
本明細書において、「ＰｅｐＸ活性が低い」とは、好ましくは、上記工程（１）～（７）により乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性を評価した時に、ＰｅｐＸ活性単位（ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が１０００以下となることを意味する。本明細書の製造方法における発酵ミックス調製工程に用いられる乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性は、好ましくは６００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下、より好ましくは３００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下である。
（利用方法）
本発明の製造方法により得られる飲食品としては、例えば、発酵乳食品、発酵豆乳食品、漬物、納豆、酒類等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られる飲食品としては、例えば、発酵乳食品、発酵豆乳食品、漬物、納豆、酒類等が挙げられる。
本発明の製造方法においては、ＰｅｐＸ活性が低い菌に加えて、Ｎ末端から２番目にプロリンまたはアラニンを持つ構造を認識しないエンド型プロテアーゼやペプチダーゼを併用してもよい。これらの酵素は、ＤＰＰ－４阻害ペプチドを分解しないため、本発明の効果をより高めることができる。ＰｅｐＸ活性が低い菌と併用する酵素としては、例えば、食品添加物グレードのペプシン、トリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。
乳類を含有する原材料にＰｅｐＸ活性が低い菌を複数種接種して発酵する際にも、用いる菌の増殖や酵素反応等に好適な条件を設定すればよい。条件は、一般に１０～４２℃で１～３日発酵すればよい。このようにして得られた食品はＤＰＰ－４阻害ペプチドを含有する発酵乳食品である。
乳類を含有する原材料を用いることにより、良好に発酵し、発酵時間を短くすることが
でき、得られる発酵乳食品の風味及び香り等は非常に良好なものとなる。このような発酵
乳食品の例としては、チーズ、ヨーグルトや豆乳等が挙げられる。
乳類を含有する原材料を用いることにより、良好に発酵し、発酵時間を短くすることが
でき、得られる発酵乳食品の風味及び香り等は非常に良好なものとなる。このような発酵
乳食品の例としては、チーズ、ヨーグルトや豆乳等が挙げられる。
本発明の製造方法では、ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌で、タンパク質又はタンパク質を含む原料を発酵したときの水溶性画分（１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ）が、純水を添加したコントロールのサンプルと比較して、ＤＰＰ－４活性を、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上阻害する。
本発明の方法により得られる医薬品としては、例えば、得られるＤＰＰ－４阻害ペプチド含有物をそのまま用いてもよいし、また乾燥した粉末を有効成分としてもよい。乾燥方法に特に制限はないが、成分の変質を抑制できる凍結乾燥法が好ましい。これらの粉末は乳糖等の適当な賦形剤と混合し、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤又はシロップ剤等として製剤化することができる。
さらに、本発明の方法により得られる飼料としては、例えば、得られるＤＰＰ－４阻害ペプチド含有物をどのような飼料に配合しても良く、その製造工程中に原料に添加しても良い。
また、本発明の方法により得られる飲食品は、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品、又は美容用食品として使用することも可能である。
また、本発明の方法により得られる飲食品は、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品、又は美容用食品として使用することも可能である。
以下、本発明を試験例、比較例、実施例をもとにさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例等に限定されて解釈されるものではない。なお、特に説明のない限り、％の表示は質量％を示す。
［試験例１］
ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌を選抜するため、下記の評価を行った。
下記（１）の各供試菌を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属はＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属はＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ）にそれぞれ植菌し、３０～３７℃にて１６～２４時間静置培養を行った。培養物を、生理食塩水にて２回、滅菌水にて１回洗浄し、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥して菌体粉末を得た。菌体粉末を１ｍｇ／ｍｌになるように緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＳＦＸ１５０ＨＨ（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて氷上にて超音波破砕した（ｏｎ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｏｆｆ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｔｏｔａｌ ３０ｍｉｎ、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０％）。破砕後、４℃にて１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を乳酸菌粗酵素抽出物とした。
（１）供試菌
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ Ａ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ Ｂ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｃ株、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ Ｄ株、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ Ｅ株を供試菌とした。
上記の菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（日本、千葉県、木更津市）から入手することができる。
ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌を選抜するため、下記の評価を行った。
下記（１）の各供試菌を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属はＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属はＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ）にそれぞれ植菌し、３０～３７℃にて１６～２４時間静置培養を行った。培養物を、生理食塩水にて２回、滅菌水にて１回洗浄し、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥して菌体粉末を得た。菌体粉末を１ｍｇ／ｍｌになるように緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＳＦＸ１５０ＨＨ（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて氷上にて超音波破砕した（ｏｎ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｏｆｆ ｔｉｍｅ ５ｓｅｃ、ｔｏｔａｌ ３０ｍｉｎ、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０％）。破砕後、４℃にて１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を乳酸菌粗酵素抽出物とした。
（１）供試菌
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ Ａ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ Ｂ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｃ株、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ Ｄ株、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ Ｅ株を供試菌とした。
上記の菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（日本、千葉県、木更津市）から入手することができる。
乳酸菌粗酵素抽出物のＰｅｐＸ活性は、Ｎ末端から２番目にプロリンを持つ基質（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｍｉｎｏｌｕｃｉｆｅｒｉｎｅ）を含有するＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを調製した。３８４ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２）または乳酸菌粗酵素抽出物を２０μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００ｍｓｅｃにて発光強度（ＲＬＵ）を測定した。
乳酸菌粗酵素抽出物中のタンパク質濃度は、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて測定した。
乳酸菌粗酵素抽出物のＰｅｐＸ活性の単位は、ＲＬＵを、反応時間（３０ｍｉｎ）、反応液量（４５μｌ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）にて補正し、ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎとして算出した。
乳酸菌粗酵素抽出物中のタンパク質濃度は、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて測定した。
乳酸菌粗酵素抽出物のＰｅｐＸ活性の単位は、ＲＬＵを、反応時間（３０ｍｉｎ）、反応液量（４５μｌ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）にて補正し、ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎとして算出した。
乳酸菌粗酵素抽出物のＰｅｐＸ活性を図１に示した。ＰｅｐＸ活性は菌種や菌株によって異なり、ＰｅｐＸ活性が高い株として知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔは９０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以上の活性を示した。一方、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３は、いずれも活性が１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であった。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９は２２１ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６は２３１ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３は５４２ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３をＰｅｐＸ活性が低い菌として見出した。
（比較例１）
ＰｅｐＸ活性が高い菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔを用いて、発酵乳Ａを製造した。すなわち１０％脱脂乳を８５℃にて２０秒間殺菌した後、３７℃まで冷却した。その後、試験例１で調製したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔの粗酵素抽出物を１％または生菌を１×１０７ ｃｆｕ／ｇとなるように添加し、３７℃にて７２時間反応させた。ついで、８０℃にて３０分間加熱することで、酵素反応を停止した。遠心分離で沈殿を除いた上清を、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）および限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、透過液を得た。得られた透過液のタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈して、ＤＰＰ４－阻害活性を測定した。
ＰｅｐＸ活性が高い菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔを用いて、発酵乳Ａを製造した。すなわち１０％脱脂乳を８５℃にて２０秒間殺菌した後、３７℃まで冷却した。その後、試験例１で調製したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔの粗酵素抽出物を１％または生菌を１×１０７ ｃｆｕ／ｇとなるように添加し、３７℃にて７２時間反応させた。ついで、８０℃にて３０分間加熱することで、酵素反応を停止した。遠心分離で沈殿を除いた上清を、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）および限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、透過液を得た。得られた透過液のタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈して、ＤＰＰ４－阻害活性を測定した。
ＤＰＰ－４活性は、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。キットの説明書に従ってＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを調製した。ヒトリコンビナントＤＰＰ－４（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）は、氷上にて解凍したのち、ＰＢＳ（－）で１０ｎｇ／ｍｌとなるように希釈した。３８４ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の各ｗｅｌｌに、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ、サンプルまたは１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈した脱脂乳培地を２０μｌ加え、ピペッティングにてよく混合し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて１０００ｍｓｅｃにて発光強度（ＲＬＵ）を測定した。発光強度は、ＤＰＰ－４を含まないＢｌａｎｋ（ＤＰＰ－４の代わりにＰＢＳ（－）を添加したｗｅｌｌ）の測定値にて補正したのち、Ｃｏｎｔｒｏｌ（サンプルの代わりに超純水を添加したｗｅｌｌ）の値を１００％としたときの相対値として示した。
ＰｅｐＸ活性が低い菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）を用いて、発酵乳Ｂを製造した。すなわち１０％脱脂乳を８５℃にて２０秒間殺菌した後、３７℃まで冷却した。その後、試験例１で調製したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）の粗酵素抽出物を１％または生菌を１×１０７ｃｆｕ／ｇとなるように添加し、３７℃にて７２時間反応させた。ついで、８０℃にて３０分間加熱することで、酵素反応を停止した。遠心分離で沈殿を除いた上清を、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）および限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、透過液を得た。得られた透過液のタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈して、比較例１と同様の方法でＤＰＰ４－阻害活性を測定した。結果を表１に示す。
表１に示される結果から、ＰｅｐＸ活性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔで製造した発酵乳Ａと比較して、ＰｅｐＸ活性が低いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）で製造した発酵乳Ｂは強くＤＰＰ－４活性を阻害することが示された。したがって、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌を用いて発酵を行うことで、ＤＰＰ－４阻害ペプチドが効率的に製造可能であることが示された。
（比較例２）
ＰｅｐＸ活性が高い乳酸菌を用いてゴーダチーズを製造した。原料乳（脂肪分３．５％）１００ｋｇを７５℃で１５秒間加熱殺菌した後、ＰｅｐＸ活性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔを含む混合スターターを１％添加し、３１℃で発酵し、凝乳酵素のレンネットを添加した。カッティングを行った後、撹拌しながらホエーを排除し、最終温度が３７℃になるように８０℃の温水を徐々に加えた。その後さらに３０分撹拌した後、生成したカードを沈降させてスチールの板でプレスした。カードが固化したらホエーを排除し、型詰、圧搾、加塩の行程を経てワックスでコーティングし、１２ヶ月熟成した。熟成後、このチーズを細かく切断し、１０倍量の水を加え、ホモジナイザで粉砕して懸濁した後、遠心分離で沈殿を除いた上清を、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）および限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、透過液を得た。得られた透過液のタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈して、比較例１と同様の方法でＤＰＰ４－阻害活性を測定した。
ＰｅｐＸ活性が高い乳酸菌を用いてゴーダチーズを製造した。原料乳（脂肪分３．５％）１００ｋｇを７５℃で１５秒間加熱殺菌した後、ＰｅｐＸ活性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＪＣＭ１１２０Ｔを含む混合スターターを１％添加し、３１℃で発酵し、凝乳酵素のレンネットを添加した。カッティングを行った後、撹拌しながらホエーを排除し、最終温度が３７℃になるように８０℃の温水を徐々に加えた。その後さらに３０分撹拌した後、生成したカードを沈降させてスチールの板でプレスした。カードが固化したらホエーを排除し、型詰、圧搾、加塩の行程を経てワックスでコーティングし、１２ヶ月熟成した。熟成後、このチーズを細かく切断し、１０倍量の水を加え、ホモジナイザで粉砕して懸濁した後、遠心分離で沈殿を除いた上清を、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）および限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、透過液を得た。得られた透過液のタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈して、比較例１と同様の方法でＤＰＰ４－阻害活性を測定した。
ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌を用いてゴーダチーズを製造した。原料乳（脂肪分３．５％）１００ｋｇを７５℃で１５秒間加熱殺菌した後、ＰｅｐＸ活性が低いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）を含む混合スターターを１％添加し、３１℃で発酵し、凝乳酵素のレンネットを添加した。カッティングを行った後、撹拌しながらホエーを排除し、最終温度が３７℃になるように８０℃の温水を徐々に加えた。その後さらに３０分撹拌した後、生成したカードを沈降させてスチールの板でプレスした。カードが固化したらホエーを排除し、型詰、圧搾、加塩の行程を経てワックスでコーティングし、１２ヶ月熟成した。熟成後、このチーズを細かく切断し、１０倍量の水を加え、ホモジナイザで粉砕して懸濁した後、遠心分離で沈殿を除いた上清を、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）および限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過し、透過液を得た。得られた透過液のタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌとなるように超純水にて希釈して、比較例１と同様の方法でＤＰＰ４－阻害活性を測定した。その結果、比較例２で製造したゴーダチーズと比較して、ＰｅｐＸ活性が低いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）で製造したゴーダチーズは強くＤＰＰ－４活性を阻害した。
ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌を用いて豆乳を製造した。原料の大豆を浸漬した後、ＰｅｐＸ活性が低いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）を添加した。次いで、原料を磨砕、加熱、圧搾して豆乳を製造した。なお、この方法に用いた微生物以外の原料、使用量、各工程における温度、時間等の条件は、通常の豆乳の製造に用いる条件と同様とした。
本発明によれば、タンパク質と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌を含有する発酵ミックスを調製する工程と、前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させてＤＰＰ－４阻害ペプチドを得る工程と、を含むことを特徴とするＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法を提供することができる。
［寄託生物材料への言及］
（１）ＳＢＴ１８５９
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和１年６月２６日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６
（２）ＳＢＴ１０９６６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和２年７月１４日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ―０３２４５
（３）ＳＢＴ１１３７３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和２年７月１４（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６
（１）ＳＢＴ１８５９
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和１年６月２６日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６
（２）ＳＢＴ１０９６６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和２年７月１４日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ―０３２４５
（３）ＳＢＴ１１３７３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和２年７月１４（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６
Claims (11)
- ＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法であって、
タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、
前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させてＤＰＰ－４阻害ペプチドを得る工程と、を含むことを特徴とするＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。 - 乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性が、１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることを特徴とする請求項１に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
- ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌で、タンパク質又はタンパク質を含む原料を発酵したときの水溶性画分（１ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ）が、純水を添加したコントロールのサンプルと比較して、ＤＰＰ－４活性を５０％以上阻害することを特徴とする請求項１または２に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
- ＰｅｐＸ活性が低い前記乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
- Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓから成る群から選択される少なくとも１つ以上であることを特徴とする請求項４に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
- Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＳＢＴ１８５９（ＮＩＴＥ Ｐ－０２９９６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）から成る群から選択される少なくとも１つ以上であることを特徴とする請求項４に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
- 食品添加物グレードのエンド型プロテアーゼまたはペプチダーゼを併用した請求項１～６のいずれか一項に記載のＤＰＰ－４阻害ペプチドの製造方法。
- 請求項１～７のいずれか一項に記載の方法により調製される、ＤＰＰ－４阻害ペプチド含有飼料、ＤＰＰ－４阻害ペプチド含有医薬品、又はＤＰＰ－４阻害ペプチド含有飲食品。
- 新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＢＴ１０９６６（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４５）
- 新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＳＢＴ１１３７３（ＮＩＴＥ Ｐ－０３２４６）
- 発酵飲食品の製造方法であって、
タンパク質又はタンパク質を含む原料と、ＰｅｐＸ活性が低い乳酸菌とを含有する発酵ミックスを調製する工程と、
前記発酵ミックスを前記乳酸菌により発酵させて発酵飲食品を得る工程と、
を含み、
前記乳酸菌の粗酵素のＰｅｐＸ活性が、１０００ＲＬＵ／ｍｉｎ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることを特徴とする発酵飲食品の製造方法。
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| JP2020190696A JP2022079857A (ja) | 2020-11-17 | 2020-11-17 | Ｄｐｐ－４阻害用組成物 |
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| JP2020190696A Pending JP2022079857A (ja) | 2020-11-17 | 2020-11-17 | Ｄｐｐ－４阻害用組成物 |
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-
2020
- 2020-11-17 JP JP2020190696A patent/JP2022079857A/ja active Pending
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