CZ308157B6 - Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití - Google Patents
Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308157B6 CZ308157B6 CZ2017-537A CZ2017537A CZ308157B6 CZ 308157 B6 CZ308157 B6 CZ 308157B6 CZ 2017537 A CZ2017537 A CZ 2017537A CZ 308157 B6 CZ308157 B6 CZ 308157B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- collagenase
- strain
- col
- clostridium histolyticum
- ccm
- Prior art date
Links
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 title claims abstract description 92
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 title claims abstract description 75
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims abstract description 5
- -1 elastinase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 9
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 5
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 5
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 5
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 5
- 101100328886 Caenorhabditis elegans col-2 gene Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 108010013295 Microbial collagenase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 241000237364 Achatina fulica Species 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100328884 Caenorhabditis elegans sqt-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 101710105199 Collagenolytic protease Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186568 Hathewaya limosa Species 0.000 description 1
- 241001147793 Hathewaya proteolytica Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12Y304/22008—Clostripain (3.4.22.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24007—Interstitial collagenase (3.4.24.7), i.e. matrix metalloprotease 1 or MMP1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Kmen bakterieuložený v CCM - České sbírce mikroorganismů Masarykové univerzity Přírodovědecké fakulty, pod depozitním č. CCM 8656, produkující za anaerobních podmínek při teplotě od 25 °C do 45 °C proteolytické enzymy včetně kolagenázy, elastinázy, neutrálních proteáz a clostripainu. Použití tohoto kmene k produkci směsi dvou kolagenáz col 1 a col 2 o molekulové hmotnosti 116 kDa a 126 kDa a případně clostripainu. Použití směsi uvedených kolagenáz a případně clostripainu získané z uvedeného kmene pro izolaci Langerhansových ostrůvků.
Description
Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití
Oblast techniky
Vynález se týká nového kmene bakterie Clostridium histolyticum, jeho použití pro výrobu kolagenázy s vysokou výtěžností, enzymu kolagenázy připraveného s použitím tohoto kmene a použití tohoto enzymu kolagenázy pro izolaci Langerhansových ostrůvků.
Dosavadní stav techniky
Kolagenáza je proteáza schopná rozkládat bílkovinu kolagen (základní složku mezibuněčné hmoty, např. ve vazivu). Kolagenázy se běžně používají ve výzkumu, a to zejména v případě, kdy je potřeba rozrušit mezibuněčnou hmotu a uvolnit zní buňky. V tomto ohledu se osvědčila clostridiopeptidáza A izolovaná z bakterie Clostridium histolyticum (název této bakterie, histolyticum, odráží právě její schopnost rozkládat tkáně). Enzym kolagenáza se používá nejen pro vědecké účely, ale našel své místo při léčení lidí i zvířat, zvláště pokud jde o léčení onemocnění kůže. Ve spojení s některými nespecifikými proteinázami urychluje hojení rány odstraňováním odumřelé tkáně a v důsledku toho zlepšuje epitelizaci. Kolagenáza se používá v případech transplantace tkáně a pro dezintegraci tkáně. Používá se při léčbě spálenin (poleptání) různých stupňů, proleženin, kožních vředů, strupů atd. Epitelizace a vyléčení kůže pomocí kolagenázy je kromě toho více účinné a rychlé, také zabraňuje tvoření koloidů (zbytnělých jizev nádorovitého vzhledu) a hypertrofickému růstu jako výsledek utvoření rozpadlého kolagenu za působení kolagenázy.
Pro syntetizování kolagenázy jsou známy rozmanité druhy mikroorganizmů, kultivovaných za definovaných podmínek. Bylo zjištěno, že mezi všemi organizmy, které dokáží syntetizovat kolagenázu, je nejlepším jejím producentem bakterie Clostridium histolyticum. Maclennan J.D., Mandl I. A Howes E.I.: J. Clin. Inv. 32, 1317 (1953) popsali podmínky pro růst Clostridium histolyticum. Zkoumali složení kapalného prostředí, které sestává hlavně z proteozovéhopeptonu, anorganických solí a roztoku vitamínů. Bakterie se kultivují při teplotě od 37 °C a při hodnotě pH 7,2. Berman S., Lewenthal J.P., Webster Μ. E., Altieri P.L. a Gochenour R.B.: J. Bact. 82, 582 (1961) rovněž zkoumali podmínky pro růst Clostridium histolyticum s cílem produkovat kolagenázu. Měli úspěch při kultivování Clostridium histolyticum v živném prostředí, neobsahujícím žádné anorganické soli, ale pouze proteozový pepton, enzymaticky hydrolyzované proteinu kaseinu a sóji (sójovou živnou půdu) a roztok vitaminu. Takové složení živného prostředí také podmiňuje další hodnoty podmínek, vyžadované pro uspokojivý růst a biosysntézu kolagenázy, jako je hodnota pH 8,5 a teplota od 30 °C.
Clostridium histolyticum je anaerobní bakterie a pro její kultivaci v kapalném prostředí musí být zabezpečeny anaerobní podmínky. Takahashi S., a Seifert S.: J. Appl. Bact. 35, 47 (1972) použili při svých výzkumech redukční činidla thioglykolát sodný a bisulfit sodný pro získání anaerobních podmínek, nezbytných pro bakteriální růst. Optimální výsledky, tj. nejvyšší výtěžek kolagenázy, byl získán při použití uvedených redukčních činidel v poměru 1:1.
Pro extrakci kolagenázy z různých zdrojů (jak bakteriálních, tak jiných) bylo doposud popsáno větší množství postupů využívajících nejrůznější pufrační systémy a většinou zahrnující precipitaci k izolaci funkčního proteinu. Tyto postupy jsou však prováděny ve fyziologickém pH 7,4 až 7,6, které není optimální pro produkcí bakteriální kolagenázy a za nízké teploty, která brání degradaci enzymu. Podstatou je, že se využívá fyziologické pH, které není pro Clostridii nejvhodnější. Např. Yoshida, E. and H. Noda, 1965. Isolation and characterization of collagenase I and II from Clostridium histolyticum. Biochem. Biophys. Acta, 10593: 562-574. DOI: 10.1016/S0926-6593(65)80239-9; nebo Sakamoto, S., P. Goldhaber and M.J. Glimcher, 1972.
- 1 CZ 308157 B6
The further purification and characterization of mouše bone collagenase. Calcified Tissiue Res., 10: 142-151. DOI: 10.1007/BF02012544; nebo Bond, M.D. and H.E. Van Wart, 1984. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry, 19: 3085-3091. DOI: 10.102l/bi00308 a036; nebo Matsushita, O., K. Yoshihara, S.l. Katayama, J. Minami and A. Okabe, 1994. Purification and characterization of a Clostridium perfringes 120Kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the corresponding gene. J. Bacteriol., 176:149-156. PMCID: PMC205026.
Také se využívají pro purifikaci kolagenázy jiné pufry než Tris-HCI jako např. bikarbonát sodný, který by měl také napomáhat slabilitě kolagenázy. U použití bikarbonátu se užívá již vyšší pH, které-by je v našem případě vhodné pro kolagenázu z Clostridium histolyticum, ale kolagenáza je izolovaná z plžů. Indra, D., K. Ramalingam and M. Babu, 2005. Isolation, purification and characterization of collagenase from hepatopancreas of the land snail Achatina fulica. Comparative Biochem. Phys., 142:1-7. DOI: 10.1016/J.CBPC.2005.02.004.
Také množství použitých iontů vhodných pro stabilitu a účinné působení enzymů degraduj ícíh extracelulámí komponenty se u jednotlivých přístupů liší. Klímova, O.A., S.l. Borukhov, N.l. Solovyeva, T.O. Balaevskaya and A.Y. Strongin, 1990. The isolation and properties of collagenolytic proteases from crab hepatopancreas. Biochem. Biophys. Res. Commun., 166:1411-1420. DOI: 10.1016/0006-291x(90)91024-M.
Kombinací použití specifického produkčního kmene ze sbírky MB Pharma a vhodných kultivačních podmínek dochází k dostatečné produkci požadovaných enzymů. Unikátní je kombinace kolagenázy produkované bakterií Clostridium histolyticum a zavedení optimálních podmínek pro její purifikaci. Nejdříve totiž stabilizujeme enzym dialýzou do pufru o vyšším pH (8), které je více přirozené pro kolagenázu Clostridium histolyticum než fyziologické pH ve výše uvedených postupech. Až postupnou dialýzou do pufrů o nižším pH se zajišťuje pozvolný přechod do fyziologických podmínek vhodnějších pro klinickou praxi.
Cílem tohoto vynálezu je poskytnout přípravek enzymu kolagenázy, který ve své finální podobě bude určen ke štěpení vazivových struktur pankreatu za účelem získání vitálních Langerhansových ostrůvků, které pak mohou být použity k transplantační léčbě diabetů. Kolagenáza je směsí 12 proteolytických enzymů a jiných proteinů získaných z filtrátu kultur Clostridium histolyticum. Digesce pankreatu probíhá v izolační komoře, která byla navržena Dr. Ricordim a spol. a používá se v téměř všech izolačních centrech Berková Z., Zacharovová K., Kříž J., Jirák D., Girman P., Dovolilová E., Koblas T., Hájek M., Saudek F.: The impact of islet labeling with superparamagnetic nanoparticles for magnetic resonance imaging on islet vitality; 10th world congress of IPITA, Geneva, Switzerland, 4.-7.5.2005. Jedná se o uzavřený systém, ve kterém cirkuluje roztok kolagenázy a za mírného třepání dochází k postupnému uvolňování ostrůvků.
Podstata vynálezu
Podstatou řešení je kmen bakterie Clostridium histolyticum CCM 8656 produkující kolagenázu. Kolagenáza produkovaná uvedeným kmenem má následující charakteristiku:
Jedná se o směs dvou kolagenáz col 1 a col 2, které produkuje kmen bakterie Clostridium histolyticum (CCM 8656) o molekulové hmotnosti 116 kDa a 126 kDa. Ve směsi proteinů je kolagenáza a její přirozené degradované části, které tvoří většinu sušiny ve finálním produktu. Na gelu SDS-PAGE musí být patrné oba dva pruhy a je zde možnost i výskytu proužků o nižší molekulové hmotnosti, které mají stále katalytickou aktivitu. Oba druhy kolagenázy se skládají ze dvou peptidických domén, které jsou samy o sobě schopny rozkládat kolagen. Zbytek proteinu tvoří vazebná doména, která váže celý enzym k substrátu, a i když zvyšuje jeho aktivitu vazbou na kolagen, není pro aktivitu nezbytná. Menší molekuly samotných katalytických domén tak díky
-2CZ 308157 B6 lepší difúzi v substrátu doplňují aktivitu poměrně velké molekuly kompletních enzymů. Kolagenáza musí mít specifickou aktivitu vyšší než 200 PZS/g. Tato jednotka (PZS/g) je definována, jako počet mikromolů substrátu rozložených jedním gramem enzymu za jednu minutu při teplotě 25 °C. Žádoucí může být i clostripainová aktivita, která však není nezbytně nutná. Clostripain může být žádoucí příměsí výsledné kolagenázové směsi. Jednotka U/mg je taková enzymová aktivita clostripainu, která katalyzuje hydrolýzu 1 pmol substrátu (BAEE) za 1 minutu při teplotě 25 °C, pH 7,6 a za přítomnosti 2,5 mmol/1 DTT. Optimální hodnota aktivity by měla ležet mezi 1,2 až 1,45 U/mg.
Dalším předmětem vynálezu je použití kolagenázy pro izolaci Langerhansových ostrůvků.
Příklady uskutečnění vynálezu
Kmen bakterie Clostridium histolyticum s pracovním označením MB204 byl uložen ve sbírce mikroorganismů CCM - Česká sbírka mikroorganismů, Kamenice 5, 625 00 Brno dne 20.1.2016 pod č. CCM 8656. Kmen mikroorganismu Clostridium histolyticum CCM 8656, který byl námi vyšlechtěn (selekce dlouhotrvajícím pasážováním), byl získán ze směsi 3 kmenů, které byly získány z německé sbírky mikroorganismů kmenů jako kmeny DSM 627, 1126 a 2158.
Kultivace obecně probíhá v tryptonové půdě, vhodné pro dostatečnou produkci kolagenázy: (Trypton 60 g/1, pepton 1,5 g/1, NaCl 2,5 g/1, glukóza 1,25 g/1, Na2HPO4 3,4 g/1) pH 8,4 před zaočkováním se do kultivačního média přidává 100 μΐ vitamínu K o zásobní koncentraci 1% a 100 μΐ L-cysteinu o zásobní koncentraci 0,5 g/ml. Kultura se kultivuje 24 hodin při 37 °C ±1 °C bez třepání. U kmenu došlo pomocí řízené evoluce a dlouhodobého pasážování (adaptivní laboratorní evoluce) (Dragonits, 2013. Dragosits M, Mattanovich D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factories. 2013;12:64. doi: 10.1186/1475-2859-12-64.) k deleci jedné kopie genu pro kolagenázu. Pomocí selekčního tlaku a dlouhodobé kultivace v laboratoři došlo k této selektivně výhodné deleci. I přes tuto deleci je kmen schopný produkovat velké množství obou typů kolagenázy. To může být způsobeno silným promotorem, který vynahradí produkci genů ze dvou míst v genomu. Do kultivačního média byl přidáván jako substrát kolagen, který selektivně podporoval tvorbu enzymu, jejž jej má degradovat. Tím došlo k přirozené selekci kmenu, který je používán pro produkci bakteriální kolagenázy. Složení tryptonové půdy vhodné pro dostatečnou produkci kolagenázy s kolagenem: (Trypton 60 g/1, pepton 1,5 g/1, NaCl 2,5 g/1, glukóza 1,25 g/1, Na2HPO4 3,4 g/1, kolagen 50 g/1) pH 8,4 před zaočkováním se do kultivačního média přidává 100 μΐ vitamínu K o zásobní koncentraci 1% a 100 μΐ L-cysteinu o zásobní koncentraci 0,5 g/ml. Kultura se kultivuje 72 hodin při 37 °C ±1 °C bez třepání ideálně v anaerobních podmínkách.
Charakteristika kmene Clostridium histolyticum CCM 8656: Clostridium histolyticum je anaerobní, gram-pozitivní bakterie. Bakterie jsou pohyblivé, peritrichální rovné tyčky o velikosti 0,5 až 0,9 x 1,3 až 9,2 pm a formují se do párů nebo krátkých řetízků. Buňky jsou schopny sporulace, za anaerobních podmínek jejich buněční stěna obsahuje meso-DAP, glutamovou kyselinu a alanin. Při kultivaci na krevních plotnách jsou kolonie velké v průměru 0,5 až 2 mm, cirkulámího až nepravidelného tvaru, ploché až mírně konvexní, barvy bílošedé lesklé s granulami povrchovou mozaikou. Podobné kolonie lze také kultivovat i za aerobních podmínek, ale kolonií vzniká výrazně méně a jsou mnohem menší. Kultivace je tedy vhodná hlavně za anaerobních podmínek, kdy se produkuje velké množství požadované kolagenázy. Bakterie jsou schopny růstu při teplotě od 25 °C do 45 °C, ale optimální teplota růstu je 37 °C. Kmen Clostridium histolyticum CCM 8656 je silně proteolytický a produkuje značné množství různých proteolytickcých enzymů včetně kolagenázy, elastinázy, neutrálních proteáz a clostripainu. Kmeny této bakterie jsou citlivé k chloramfenikolu, penicilinu, erytromycinu a tetracyklinu. Kmeny jsou toxické, ale při dlouhé kultivaci jejich prokurzované proteázy mohou degradovat vlastní toxiny. Specifická 16S RNA (GenBank accession number 16S rRNA genu: M59094)
-3 CZ 308157 B6 ukazuje, že tento druh je podobný druhům Clostridium limosum (97,2 %) a Clostridium proteolyticum (96,1 %).
Kolagenáza pro izolaci Langerhansových ostrůvků je získávána jako metabolit bakterie Clostridium histolyticum. Tento enzym působí synergicky při procesu degradace kolagenu a jiných mezibuněčných komponent. Kolagenáza pro izolaci Langerhansových ostrůvků je obecně vhodná pro izolaci buněk z mnoha typů živočišných tkáních. Přípravek je opatřen základní informací o enzymatické aktivitě. Optimální koncentraci enzymu a konkrétní podmínky pro použití degradací různých tkání je třeba určit empiricky. Enzym není animálního původu.
Kolagenáza pro izolaci Langerhansových ostrůvků je vhodná pro buněčné separace např. nádorových buněk, separace buněk myších ledvin, buněk plicních a různé epiteliální tkáně. Enzym lze použít i pro izolaci hepatocytů. Vzhledem k selektivní kolagenolytické aktivitě, která primárně nepoškozuje buněčné membrány, může být tento enzym použitý jako obecně disperzní buněčný prostředek, a to i v podmínkách buněčných kultur. Obecně platí to, že orgány s vyšším obsahem kolagenu lze inkubovat s kolagenázou pro izolaci Langerhansových ostrůvků delší dobu a při vyšších koncentracích než při práci s jinými proteolytickými enzymy, aniž by buňky ztratily svoji viabilitu.
Alternativní aplikace kolagenázy podle vynálezu jsou při přípravě různých buněčných kultur, dále při výzkumu léčivých přípravků na bázi enzymatické aktivity kolagenázy a v různých transplantačních programech.
Schéma technologického postupu
Lytífilkaíu·
-4CZ 308157 B6
Příklad 1:
Otevření a vyočkování konzervy:
Bakteriální kultura Clostridium histolyticum kmen č. CCM 8656 je uchovávána v zamražovacím médiu při - 80 °C nebo formou lyofilizátu ve skleněné ampuli při 4 °C. 100 pl rozmražené kultury se vyočkuje do 100 ml tekutého média, které je těsně před vyočkováním sterilizováno a poté vytemperováno na teplotu 37 °C. Dochází tak k odvzdušnění kultivační půdy vhodné pro kultivaci anaerobních bakterií. Složení tryptonové půdy vhodné pro dostatečnou produkci kolagenázy: (Trypton 60 g/1, pepton 1,5 g/1, NaCl 2,5 g/1, glukóza 1,25 g/1, Na2HPC>4 3,4 g/1) pH7,8 před zaočkováním se do kultivačního média přidává 100 μΐ vitamínu K o zásobní koncentraci 1% a 100 μΐ L-cysteinu o zásobní koncentraci 0,5 g/ml. Kultura se kultivuje 24 hodin při 37 °C ±1 °C bez třepání.
Po kultivaci je prověřena čistota bakteriálních kmenů výsevem na pevných půdách (kultivace anaerobně) a posoudí se morfologie buněk mikroskopicky.
Příprava kultivace ve velkém objemu:
Bakteriální kultura Clostridium histolyticum km. č. CCM 8656 nakultivovaná ve 100 ml média se odebere ze spodní části lahve. 5 ml kultury se zaočkuje do 500 ml tekutého média, které je těsně před vyočkováním sterilizováno a poté vytemperováno na teplotu 37 °C. Dochází tak k odvzdušnění kultivační půdy vhodné pro kultivaci anaerobních bakterií. Složení tryptonové půdy vhodné pro dostatečnou produkci kolagenázy: (Trypton 60 g/1, pepton 1,5 g/1, NaCl 2,5 g/1, glukóza 1,25 g/1, Na2HPO4 3,4 g/1) pH 7,8 před zaočkováním se do kultivačního média přidává 100 μΐ vitamínu K o zásobní koncentraci 1% a 100 μΐ L-cysteinu o zásobní koncentraci 0,5 g/ml. Kultura se kultivuje 24 hodin při 37 °C ±1 °C bez třepání.
Kultivace ve fermentoru:
Ve fermentoru se připraví 19 litrů kultivační půdy (Trypton 60 g/1, pepton 1,5 g/1, NaCl 2,5 g/1, glukóza 1,25 g/1, Na2HPO4 3,4 g/1) pH 7,8 před zaočkováním se přidá 20 ml vitamínu K (zásobní 1%) a 20 ml L-cysteinu (zásobní 0,5 g/ml). Fermentor se zaočkuje 500 ml bakteriální kultury z předchozího kroku kultivace. Do takto připraveného kultivačního média se asepticky přesaje směsné inokulum. Po naočkování se provede odběr 0. vzorku. Kultivace probíhá při +37 °C ± 1 °C. Podmínky kultivace se upravují dle nárůstu bakterií. Od zahájení kultivace se provádí úprava pH kontinuálním způsobem 2M roztokem NaOH na hodnoty 7,8 + 0,5. Kultivace se provádí bez míchání a vzdušnění!
Kultivace se ukončí, jestliže 2 po sobě následující odběry nevykazují výrazný přírůstek a zároveň se nemění pH. Pokud se alespoň pH mění, kultivace probíhá 40 až 48 hodin.
Zpracování enzymu:
Po kultivaci se 20 litrů kultivačního média obsahujícího, jak bakterie, tak surovou kolagenázu, stočí do vhodné nádoby s 9,46 kg síranu amonného. Celá směs se rozmíchá, aby došlo k rozpuštění síranu amonného, poté je upraveno pH na hodnotu 6,8 až 7,6,Směs se nechá sedimentovat 4 až 7 dnů při teplotě 4 °C. Po 4 až 7 dnech, je pomocí peristaltické pumpy odsán supernatant, při zachování co největšího objemu sedimentu bez jeho rozčeření. Sediment obsahující sraženou kolagenázu se přenese do dialyzačních hadic (cca 0,3 až 1 litr sedimentu). Dialyzační hadice se umístí do 10 I pufiru Tris-CI (Tris 0,75 g/1, CaCL 0,484 g/1, pH 10) a nechá se dialyzovat 3 hodiny. Poté se pufr vymění za dalších 10 1 TRIS-HC1 na 24 hodin. Dále se pufir vymění za 10 I Tris-HCl o jiném pH (Tris 0,36 g/1, CaCL 0,242 g/1, pH 7,5 až 8,5) na 24 hodin. Po této době znovu proběhne výměna za čerstvý Tris III. Pokud by se jevil dialyzát příliš hustý, může výměna Tris pufiru proběhnout ještě 2 x za dalších 24 hodin.
-5 CZ 308157 B6
Po dialýze se obsah dialyzačních hadic rozlije do kyvet a stočí na centrifuze (3500 x G) po dobu 45 minut. Supernatant se slije do sterilní nádoby a přefiltruje přes filtr 0,45 pm. Následuje ultrafiltrace na kazetách millipore 50 kDa. Po použití této metody dojde k zakoncentrování a snížení objemu lyzátu. Po zakoncentrování kolagenázy na objem 120 ml se provede filtrace přes 0,45 pm filtr. Následuje rozplnění do lahviček a lyofilizace produktu.
Příklad 2:
Vyočkování a kultivace bakteriálního kmene Clostridium histolyticum CCM 8656 je stejné jako v příkladu 1. Po ukončení kultivace ve fermentoru však dojde k odstranění bakterií C. histolyticum centrifugací (7000 x G) a srážení kolagenázy síranem amonným se provádí pouze v supematantu. Sraženina obsahující síran se sraženým proteinem se nechá sedimentovat 4 až 6 dnů při teplotě 4 °C. Po dialýze proti tlumivým roztokem Tris-HCl pufirů (stejné pufry jako v příkladu 1) pak následuje opět ultrafiltrace na kazetách millipore s cut off' 50 kDa. Po zahuštění proteinu se vzorek rozplní po 10 ml do lahviček a lyofilizuje.
Příklad 3:
Vyočkování a kultivace bakteriálního kmene Clostridium histolyticum CCM 8656 je stejné jako v příkladu 1. Po dialýze však nastává ultrafiltrace přes ultrafiltrační kazety nejprve s cut off 300 kDa pro odstranění balastních proteinů o velké molekulové hmotnosti. Takto se zvětší objem, jelikož se zachovává flow trought a poté se roztok ultrafiltruje na kazetě s cut off 50 kDa pro odstranění menších proteinů a degradovaných částí. Při tomto zakoncentrování se neustále dodává Tris-HCl pufr (Tris 0,36 g/1, CaCfi 0,242 g/1 pH 7,5 až 8,5). Po zahuštění proteinu se vzorek rozplní po 10 ml do lahviček a lyofilizuje.
Příklad 4:
Vyočkování a kultivace bakteriálního kmene Clostridium histolyticum CCM 8656 je stejné jako v příkladu 1. Po ukončení kultivace ve fermentoru však dojde k odstranění bakterií Clostridium histolyticum centrifugací (7 000 x G). V tomto případě však nedochází ke srážení síranem amonným, ale dojde rovnou k zhušťování proteinu. Přes ultrafiltrační kazety nejprve s cut off 300 kDa se odstraní balastní proteiny o velké molekulové hmotnosti. Takto se zvětší objem, jelikož se zachovává flow trought a poté se roztok ultrafiltruje na kazetě s cut off 50 kDa pro odstranění menších proteinů a degradovaných částí a dojde ke snížení objemu. Po zahuštění proteinu se vzorek rozplní po 10 ml do lahviček a lyofilizuje.
Metoda:
Je popsáno několik metod purifikace kolagenázy, za použití srážení síranem amonným. Využíváme však jiné koncentrace pro optimální odstranění nežádoucích balastních proteinů a zachování enzymaticky aktivních proteinů (clostripain a neutrální proteázy) pro podporu vlastností finální kolagenázy, pro její využití při izolaci Langerhansových ostrůvků. Metoda využívá pouze srážení síranem amonným, dialýzu a sytém ultrafiltrací, což je jednoduchá dobře proveditelná metoda na rozdíl od nákladné a velmi náročné metody purifikace pomocí chromatografie. Navíc jde tímto způsobem zpracovat velké objemy kolagenázy na rozdíl od chromatografických metod. Při této metodě zůstávají zachovány jiné proteiny, které ve správném poměru podporují aktivitu kolagenázy. Jelikož je při výrobě zpracována i bakteriální kultura, dostávají se tyto intracelulámí proteiny do finálního přípravku. V jiných případech se zpracovává pouze supernatant po kultivaci a zde dochází ke ztrátám podpůrných enzymů. Metoda je také inovativní v použití dvou hodnot pH, kdy nejdříve sraženinu dialyzujeme proti pufiru o vysokém pH. Toto je zavedeno pro zvýšení stability proteinu a vyššímu výtěžku.
Sekvenace a PCR genu pro kolagenázu:
-6CZ 308157 B6
Před přípravou samotné DNA pro sekvenaci bylo potřeba ověřit, který z možných druhů kolagenázy produkuje kmen používaný pro výrobu. Na základě podobnosti a původu kmenů byl vytipován gen pro kolagenázu o velikosti 3967 bp. Na vytipovanou sekvenci byl navržen pár primerů pro PCR (KG Up: GGGATTATCTATGAAAAAAAA, KG Low: AATTATTTATTTACCCTTAACTCA ) a byla provedena PCR pro potvrzení přítomnosti genu v genomu bakterie. Reakce potvrdila přítomnost právě vytipovaného genu, což nám umožnilo identifikovat i proteinový produkt genu pro další analýzy proteinu. Důležitá byla hlavně sekvence aminokyselin a velikost proteinu (126 kDa).
Sbírka přihlašovatele MB PHARMA s.r.o. disponuje v současnosti třemi kmeny bakterie Clostridium histolyticum, které produkují nejen bakteriální kolagenázu, ale také v signifikantním množství clostripain a neutrální proteázy. Ty mohou, ale také nemusejí, být potřebné pro výrobu finálního produktu. Při jejich absenci je však nutné je pro izolaci ostrůvků následně odděleně přidávat.
Jedná se o kmeny s pracovním označením MB 201, MB 202 a MB 204 (CCM 8656), kdy se pro účely hromadné výroby vybral kmen Clostridium histolyticum MB 204 (CCM 8656). U tohoto produkčního kmene byl sice gen pro kolagenázu potvrzen pomocí PCR, ale pro lepší charakterizaci bylo lepší stanovit celou sekvenci genomové DNA. Tím lze najít i geny pro clostripain a potenciální neutrální proteázy. Pro úspěšnou sekvenaci se proto musí připravit DNA ve velmi dobré kvalitě a koncentraci. Po sekvenování se musí zpracovat velké množství dat a hotové sekvence kontigů se poté musí anotovat. Sekvenovány byly všechny tři kmeny C. histolyticum a po anotaci jejich genomů se ukázalo, že kódují geny pro dva typy kolagenázy. Jak pro kolagenázu prokázanou pomocí PCR (col 2) tak i druhý typ kolagenázy o molekulové hmotnosti 116 kDa (col 1). Kmen MB 201 obsahoval gen pro col 1 ve dvou kopiích a gen pro col 2 pouze v jedné kopii, kmen MB 202 má naopak gen col 1 v jedné kopii a gen col 2 ve dvou kopiích. V produkčním kmenu MB 204 byly oba geny col 1 a col 2 pouze v jedné kopii.
V genomu všech kmenů se nachází gen pro clostripain. Tento enzym může napomáhat kolagenáze k lepšímu rozkladu tkání při izolaci Langerhansových ostrůvků. Ve finální směsi kolagenázy by měla tvořit hlavní složku kolagenáza a clostripain by měl být složkou minoritní. To se prokázalo.
Všechny kmeny Clostridium histolyticum disponují genem pro produkci clostripainu, ale alternativně by bylo výhodnější pro správný poměr kolagenázy a clostripainu produkovat oba enzymy zvlášť a směs vytvářet ve vhodném poměru až před aplikací. Clostripain má molekulovou hmotnost 43,4 kDa, takže by bylo možné jej poměrně snadno produkovat i jako rekombinantní protein např. v E. coli.
Jedná se o směs dvou kolagenáz coll a col2, které produkuje bakterie Clostridium histolyticum CCM 8656 o molekulové hmotnosti 116 kDa a 126 kDa.
Coll,Mw: 116,3 kDa, pl: 5,82
-7CZ 308157 B6
Sekvence:
MKRKCLSKRLMLA.ITOATIFTVNSTIÍĚYAAVDKNNATAAVQNESKRYTVSYUCTLNYYDLMSLLVKTEIEN
LPDLFQ’^SDAKEFVGiVKTftMSFtfclDEIGRRAPQYITiOHKGlPUVEWRAGFYLGFHNKELNEINKRSFK
ERWSIWIQKlYPNFKLGITVaDKWSATGLLAGNEFAPPEWNNnPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFN
VlAAPTYOTEYLRATKEKPÉNTPWYGKICGFINEUíKULYGKiaiONNSWIlDNGiYHIAPLGKLHSNNKIG lETLTEWlKVYPYLSMQHLQSADQJKRHYQSKDAEGNKfPLDKFKKEGKEKYCPKTYTFDCGKVflKAGAR
VE£TKVKRLYWA$KEVN5QFFRVYGIDKPLEEGNPDDILTMVIYNSPEEYKLN$VLYGYDTNNGGMYIEP£
GTFnYEREA^STYTLEELFRHEYmYLQGRYAVPGQWGRmYDNORLTWYEEGGAELFAGSTRTSGL
PRKSA^NÍHNTTRNNRYKLS&TVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGiLNXLNDLAKNNDVDGY
DNyiROLSSN¥MNDKY£»»iMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKLKDAKSEWK
SQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDIYSWSGYKIITAYFTNYKVOSSNRVTYDVVF
HGYlPMEGDSKNSLPYGKíNGlYKGTEKEKIKFSSEG5FDPDGKiyS^WDFGDGNKSMEENPEHSYĎKV
GTYTWUWrDDKGESWSmAEÍKDLSENKlPVlYMHVPKSGALNQKVVFYGKGlYDPĎGSIAGYQWD
FGDGSDF$SEQNPSHVYTKKGEYT¥riRVMD5SGQIVISEKTMKIKITDPVYPlGTEKEPNNSKETASGPIVP
GIPV5GTOT5DQDYFYFDWPGEVWÍNKLGYGGATWVV¥DENNNAV5YAT0DGQNi.SGKF'KADKP
GRYYIHLYMFNGSYMPYR1MEGSVGR
Col 2, Mw: 126,2, pl: 5,62
Sekvence:
MKKMILKILMDSYSKESKIQTVRRVTSVSLLAVYLTMNTSSLVLAKPIENTNDTSÍKNVEKI.RMAPNEENSKK
VEDSKNDKVEHVKNIEEAKVEQVAPEVKSKSHRSASIANTNSEKYDFEYL.NGLSYlTLTNUKiilKWNQIN
GLFNYSTGSQKFFG DKNRVQAl IN ALQESG RTYTANDM KGIETFTEVLRAGFYLG YYN DGLSYLMDRNFQ
DKClPAMIAIQKNPMFKLGTAVQDEVnSLGKUG«ASANAEVVNNCWW.KQFRENLNQYAPDWKGTA
VMEUKGEFDFSGAAYEKDVKTMPWYGKlDPFIřiElKALGLYGhinSATEWASDVGlYYLSKPGLYSTNRN
DIVQSLEKAWMYKYGKIAFVAMERITWDYOGIGSWGKWOHDKFLDDAEKHYLPKTYTFDNGTFIIRAG
DKVSEEKIKRLYWA5REVKSQFHRWGNDKALEVGNADDVLTMKlFM$PEEYiaNTNINGV.$TDNGGLY!
EPRGTFYTYERTPQQSlFSLEElfRHEYTHYLQARYLVDGLWGQGPFYEKHRLTWFDEGIAEFFAGSTRTS
GVU^RKSiLGYLAWKVDHRYSLKKTLNSGYDDSDWMFYNYGFAVAHYL^KDMPTFIKMNKAILNnJVK
SWEIIKKLSDDANKfITEYQNHiQELADKYQGAGIPL.VSODYLKOHGmASE'mEISKAASLTMTSVTAE
KSQ¥F^TFTLRGT¥TGETSKGEFKDWDEMSKKLDGTLE$LAKNSíW$GYKTLTAYFTN¥RVT$DNKVQYD
WFHGVLTDNADISNNKAPIAKVTGPSTGAVGRNtEFSGKDSKDEDGKřVSYDWDFGĎGATSRGKNSVH
AYKKAGTYHVTLKVTDDKGATATESFriElKNEDnTPITKEMEPMODIKEAIMGPIVEGVTVKGDLNGSDO
ADTFYH3VKEDGDVTIELPY5G5SKFTWL\<WEGDDQNHIASGIDICráNSÍÍVGTFKSTKGRH¥VH¥KHDSA
SNÍSYSLP^KGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPMFNTTMQG^.LGDDSRDYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEF n GVTWTmPESNINDRiTYGQVDGNKVSMKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGfíYELRVNK
Ve směsi proteinů kolagenáza a její přirozené degradované části tvoří většinu sušiny ve finálním produktu. Obsahovat mohou také clostripain, případně neutrální proteázy zjistitelné vhodnou metodou měření aktivity těchto příměsí. Podstatná je však přítomnost jak nedegradovaných kolagenáz, tak případně jejich částí. Na gelu 12% SDS-PAGE musí být patrné oba dva pruhy odpovídající velikosti 116 kDa a 126 kDa a je zde možnost i výskytu proužků o nižší molekulové hmotnosti, které mají stále katalytickou aktivitu. Pokud je použitý zymogram, mohou být tedy patrné lytické zóny i proteinů s nižší mol. hmotností. Menší molekuly samotných katalytických domén tak díky lepší difúzi v substrátu doplňují aktivitu poměrně velké molekuly kompletních enzymů. Kolagenáza musí mít specifickou aktivitu vyšší než 200 PZS/g. Tato jednotka je definována, jako počet mikromolů substrátu rozložených jedním gramem enzymu za jednu minutu při teplotě 25 °C. Žádoucí může být i clostripainová aktivita, která není nutná. Clostripain může být žádoucí příměsí výsledné kolagenázové směsi. Jednotka U/mg je taková enzymová aktivita clostripainu, která katalyzuje hydrolýzu 1 pmol substrátu (BAEE) za 1 minutu při teplotě 25 °C, pH 7,6 a za přítomnosti 2,5 mmol/1 DTT. Optimální hodnota aktivity by měla ležet mezi 1,2 až 1,45 U/mg.
Kmen Clostridium histolyticum MB 204 uložený ve sbírce jako CCM 8656 měl mnohem vyšší výtěžnost kolagenázy než ostatní testované kmeny běžně použité pro produkci kolagenázy. Tento kmen sice na rozdíl od komerčně používaných bakterií obsahuje pouze po jedné kopii genu pro kolagenázu typu I a pro kolagenázu typu II, ale její produkce je zvýšená, pravděpodobně díky expresi způsobené silným promotorem. Navíc kmen produkuje minimální množství toxických proteinů, a během způsobu přípravy dochází k degradaci nežádoucích proteinů, což je velká výhoda pro praktické použití v transplantační medicíně.
Novým postupem v kombinaci s novým kmenem dochází k produkci stabilní kolagenázy z Clostridium histolyticum. Ve finálním produktu jsou při kultivaci relativně malého objemu dostatečné výtěžky obou typů kolagenáz. Dochází u ní sice k částečné degradaci, ale taje spíše prospěšná v kombinaci s dostatečnou přítomností nedegradované části enzymu, jelikož degradované části si zachovávají stále proteolytickou aktivitu.
Enzym kolagenáza se používá k digesci tkáně slinivky břišní, při které dochází k uvolnění Langerhansových ostrůvků (LO), které mohou být použity k léčbě diabetes. Izolované LO pomocí kolagenázy musí splňovat přísná kritéria, aby mohly být transplantovány pacientům s diabetem. Nej důležitějšími sledovanými parametry u izolace jsou: délka digesce, kvalita digesce, kvalita oddělení ostrůvků od exokrinní tkáně a kvalita získaných ostrůvků po izolaci a kultivaci. Kvalita ostrůvků je hodnocena pomocí barvení živých a mrtvých buněk, pomocí glukózou stimulované sekrece inzulínu beta buňkami LO (vyjádřena jako stimulační index) a pomocí měření spotřeby kyslíku. Pomocí kolagenázy podle vynálezu bylo dosaženo času digesce 15 min, a výtěžnosti v průměru 1000 LO, které si zachovávají dostatečnou vitalitu (více jak 95%). Tato kolagenáza je tedy vhodná pro izolaci LO pro transplantační účely.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (5)
1. Kmen bakterie Clostridium histolyticum uložený v CCM - České sbírce mikroorganismů Masarykové univerzity Přírodovědecké fakulty, Kamenice 5, 625 00 Brno pod depozitním číslem CCM 8656, produkující za anaerobních podmínek při teplotě od 25 °C do 45 °C proteolytické enzymy včetně kolagenázy, elastinázy, neutrálních proteáz a clostripainu.
2. Použití kmene bakterie Clostridium histolyticum CCM 8656 podle nároku 1 k produkci směsi dvou kolagenáz col 1 a col 2 o molekulové hmotnosti 116 kDa a 126 kDa.
3. Použití kmene bakterie Clostridium histolyticum CCM 8656 podle nároku 1 k produkci směsi dvou kolagenáz col 1 a col 2 o molekulové hmotnosti 116 kDa a 126 kDa a clostripainu.
-9CZ 308157 B6
4. Použití směsi dvou kolagenáz col 1 a col 2 získané z kmene bakterie Clostridium histolyticum CCM 8656 podle nároku 2 pro izolaci Langerhansových ostrůvků.
5 5. Použití směsi dvou kolagenáz col 1 a col 2 a clostripainu získané z kmene bakterie
Clostridium histolyticum CCM 8656 podle nároku 3 pro izolaci Langerhansových ostrůvků.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-537A CZ308157B6 (cs) | 2017-09-13 | 2017-09-13 | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
| US16/646,874 US11220666B2 (en) | 2017-09-13 | 2018-09-11 | Bacterial strain clostridium histolyticum and methods of use thereof |
| AU2018333356A AU2018333356B2 (en) | 2017-09-13 | 2018-09-11 | Bacterial strain Clostridium histolyticum and its use |
| EP18779553.9A EP3682013B1 (en) | 2017-09-13 | 2018-09-11 | Bacterial strain clostridium histolyticum and its use |
| PCT/CZ2018/000044 WO2019052586A1 (en) | 2017-09-13 | 2018-09-11 | BACTERIAL STRAIN CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM AND USE THEREOF |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-537A CZ308157B6 (cs) | 2017-09-13 | 2017-09-13 | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017537A3 CZ2017537A3 (cs) | 2018-10-10 |
| CZ308157B6 true CZ308157B6 (cs) | 2020-01-29 |
Family
ID=69177238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-537A CZ308157B6 (cs) | 2017-09-13 | 2017-09-13 | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11220666B2 (cs) |
| EP (1) | EP3682013B1 (cs) |
| AU (1) | AU2018333356B2 (cs) |
| CZ (1) | CZ308157B6 (cs) |
| WO (1) | WO2019052586A1 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023030562A1 (en) | 2021-08-30 | 2023-03-09 | MB PHARMA s.r.o. | Genetically modified bacterial strain e. coli producing clostripain peptidase |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ308157B6 (cs) | 2017-09-13 | 2020-01-29 | MB PHARMA s.r.o. | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
| CN113215058B (zh) * | 2021-06-08 | 2022-05-03 | 山东大学 | 一株能够降解胶原蛋白的菌株及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2047306A1 (en) | 1990-07-23 | 1992-01-24 | Milan Holjevac | Mutant bacterium clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase |
| US20110294192A1 (en) * | 2008-11-19 | 2011-12-01 | Tohoku University | Fusion collagenase in which affinity tag is linked and method for producing the same |
| BR112014017229B1 (pt) | 2012-01-12 | 2022-05-17 | Auxilium International Holdings, Inc | Ácido nucleico recombinante, cassette de expressão, vetor, célula hospedeira recombinante, método de produção da colagenase i ou ii, colagenase i ou ii, composição farmacêutica, e método de produção de um produto de droga |
| CZ308157B6 (cs) | 2017-09-13 | 2020-01-29 | MB PHARMA s.r.o. | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
-
2017
- 2017-09-13 CZ CZ2017-537A patent/CZ308157B6/cs unknown
-
2018
- 2018-09-11 WO PCT/CZ2018/000044 patent/WO2019052586A1/en active Search and Examination
- 2018-09-11 US US16/646,874 patent/US11220666B2/en active Active
- 2018-09-11 AU AU2018333356A patent/AU2018333356B2/en active Active
- 2018-09-11 EP EP18779553.9A patent/EP3682013B1/en active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GenBank Q46085.1, KUNIKO YOSHIHARA, et al.: Cloning and Nucleotide Sequence Analysis of the colH Gene from Clostridium histolyticum Encoding a Collagenase and a Gelatinase, 1994, JOURNAL OF BACTERIOLOGY 176, 6489-6496 * |
| Igarashi Kazuhiko et al.: Synergistic Effect of Neutral Protease and Clostripain on Rat Pancreatic Islet Isolation 2015 Transplantation 99, 1349-1355, ISSN: 0041-1337 * |
| Paul de Vos: Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing β-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence, 2016, PLoS ONE 11, E-ISSN: 1932-6203 * |
| UniProtKB/Swiss-Prot: Q9X721.1, RecName: Full=Collagenase ColG; AltName: Full=Class I collagenase; AltName: Full=Gelatinase ColG; AltName: Full=Microbial collagenase; Flags: Precursor. Matsushita,O., et al.: Gene duplication and multiplicity of collagenases in Clostridium histolyticum, JOURNAL J. Bacteriol. 181 (3), 923-933 (1999) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023030562A1 (en) | 2021-08-30 | 2023-03-09 | MB PHARMA s.r.o. | Genetically modified bacterial strain e. coli producing clostripain peptidase |
| CZ309541B6 (cs) * | 2021-08-30 | 2023-03-29 | MB PHARMA s.r.o. | Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2018333356B2 (en) | 2021-02-25 |
| EP3682013B1 (en) | 2021-06-02 |
| US20200339941A1 (en) | 2020-10-29 |
| CZ2017537A3 (cs) | 2018-10-10 |
| EP3682013A1 (en) | 2020-07-22 |
| WO2019052586A1 (en) | 2019-03-21 |
| AU2018333356A1 (en) | 2020-04-16 |
| US11220666B2 (en) | 2022-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI64640B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en kombinations-dna-molekylsom innehaoller en foer insulin kodande nukleotidsekvens hocsom kan anvaendas vid framstaellning av en insulin produ rcende mikroorganism | |
| EP3682013B1 (en) | Bacterial strain clostridium histolyticum and its use | |
| US5252481A (en) | Mutant of bacterium Clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase | |
| CN111471669A (zh) | 一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法 | |
| Jain et al. | Production and partial characterization of collagenase of Streptomyces exfoliatus CFS 1068 using poultry feather | |
| CN1152134C (zh) | 一种制备重组脱氧核糖核酸酶i的方法 | |
| RU2193063C2 (ru) | Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа | |
| US3686072A (en) | L-asparaginase from erwinia | |
| RU2835675C1 (ru) | Лабораторный способ биосинтеза бациллярной рибонуклеазы (варианты) | |
| RU2707118C1 (ru) | Способ повышения продуктивности бактерий escherichia coli | |
| CN111424023B (zh) | 产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用 | |
| RU2158302C2 (ru) | Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий | |
| KR0169804B1 (ko) | 비피도박테리움의 배양 방법 | |
| RU2403283C2 (ru) | Штамм staphylococcus epidermidis bvm-1987 - продуцент стафилолитического ферментного комплекса | |
| RU2221041C1 (ru) | ШТАММ Bacillus licheniformis БСТ-1-ПРОДУЦЕНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ | |
| FI65446C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer insulin kodande nukleotidsekvens | |
| CN114478794A (zh) | 幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用 | |
| US10301611B2 (en) | Process for refolding recombinant chymotrypsin | |
| FI65447C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer tillvaexthormon kodande nukleotidsekvens | |
| KR101180419B1 (ko) | 어류의 세균성 질병에 대한 복합 불활화 백신 | |
| FI74732B (fi) | Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en nukleotidsekvens som kodar foer tillvaexthormon. | |
| JPH08214878A (ja) | 低温性プロテアーゼおよび低温性細菌 | |
| KR910004362B1 (ko) | 세라티아 sp.Y-4가 생산하는 신규의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 그의 생산방법 | |
| JPH02312590A (ja) | プラスミドｐＴＹ１ | |
| Clark Jr | Method of Polarographic Analysis of Lactic Acid and Lactate |