CZ309541B6 - Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu - Google Patents
Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309541B6 CZ309541B6 CZ2021-400A CZ2021400A CZ309541B6 CZ 309541 B6 CZ309541 B6 CZ 309541B6 CZ 2021400 A CZ2021400 A CZ 2021400A CZ 309541 B6 CZ309541 B6 CZ 309541B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- clostripain
- collagenase
- protein
- isolation
- colh
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 title claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 41
- 101710090686 Collagenase ColH Proteins 0.000 title description 5
- 101710090707 Collagenase ColG Proteins 0.000 title description 4
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 21
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 49
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 49
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 34
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 11
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 8
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 3
- 108010067035 Pancrelipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100025566 Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000856199 Homo sapiens Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010013295 Microbial collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000008354 tissue degradation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12Y304/22008—Clostripain (3.4.22.8)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Geneticky modifikovaný kmen E. coli uložený v České sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 9176 s vneseným plazmidem pET28 obsahující gen pro clostripainovou peptidázu mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, produkující enzym peptidázu, a jeho použití.
Description
Vynález se týká přípravy rekombinantních proteinů v bakterii E. coli, jejich následné purifikace a použití směsi purifikovaných proteinů pro izolaci Langerhansových ostrůvků (LO) z tkáně slinivky břišní. Konkrétně se jedná o dva druhy kolagenáz (ColG a ColH) a hlavně nového druhu clostripainu, který synergicky působí se dvěma zmíněnými kolagenázami při izolaci LO.
Dosavadní stav techniky
Izolace Langerhansových ostrůvků (LO) má ve srovnání se separací jiných buněčných typů svá daná specifika. Nesmí při ní docházet k úplnému rozdělení stejných buněčných typů. V rámci této separace tkáňových buněk se stále hledá vyvážený postup, při kterém je nutná desintegrace tkání, ale zároveň protichůdný proces, udržení stejného buněčného klastru (LO) při sobě. Na tomto poli dochází ke značným pokrokům a do dnešní doby byly nastaveny procesy izolace LO a byla vytipována a vyzkoušena řada enzymů, díky kterým lze izolovat LO v poměrně dobré kvalitě. Stále existuje spousta oblastí, kde je nutné zlepšení. Jednou z hlavních je produkce standardizovaných šarží enzymů kolagenázy a pomocných enzymů jako je clostripain a neutrální proteázy a míchání jejich směsí. Prozatím nebyla vytvořena žádná specifická směs enzymů, která by byla rutinně používána pro izolaci LO. Důvodem jsou na jedné straně prozatím stále nedostatečné detailní informace o složení pankreatické tkáně a na straně druhé nedostatečná znalost synergie jednotlivých enzymů kolagenáz, clostripainu a jiných proteáz, při desintegraci tkáně slinivky. Enzymy jsou často detailně popsány po biochemické stránce a jednotlivě samy o sobě, ale chybí množství dat o tom, jak mohou působit in vivo při procesu izolace LO.
Kolagenázy jsou proteázy rozkládající kolagen, které jsou hojně používány v kosmetice, potravinářství, průmyslu, ale i v medicíně. Pro terapeutické účely, jakým je například i izolace LO, se používají mikrobiální kolagenázy, které na rozdíl od eukaryotických kolagenáz dovedou štěpit kolagen na více místech. Pro kvalitní optimalizaci a vyvážení izolace LO je potřeba najít vhodný poměr používaných enzymů, které mají synergický efekt působení.
K izolaci LO se původně využívala směs enzymů izolovaných z lyzátu bakterie Clostridium histolyticum, kdy se jednalo o směs až 12 různých enzymů podílejících se na degradaci tkáně. Tato směs ale dle kvality přečištění obsahovala také různé balastní proteiny jako pigmenty nebo endotoxiny. Tyto proteiny mohly být pro proces izolace LO nežádoucí mohou dokonce mít prozánětlivý účinek (Berney et al., 2001; Vargas et al., 1998). Ač tyto směsi byly a jsou produkovány vždy stejným způsobem, jejich charakter vede k nejednoznačným a neinterpretovatelným výsledkům. Tím se ztěžuje jejich kvalitní použití v medicíně. Takové směsi enzymů, které jsou parciálně purifikované, se pro izolace využívají dodnes, jsou však snahy používat vysoce purifikované enzymy přímo z produkčních bakterií, nebo využít produkce rekombinantních proteinů v dobře popsaných systémech, jako jsou bakterie E. coli (Ducka et al., 2009; Volpe et al., 2016), Bacillus (Jung et al., 1996) atd. Produkce rekombinantních proteinů však sebou nese také úskalí, jelikož nevznikají ve svém přirozeném organismu, mají různé tagy. Z toho důvodu byly optimalizovány (Alipour et al., 2014) například kodony pro produkci klostridiální kolagenázy v E. coli.
Již v devadesátých letech bylo prokázáno, že kolagenáza třídy I a II (ColH a ColG) stačí k úspěšné izolaci LO z tkáně slinivky břišní (Vos-Scheperkeuter et al., 1997; Gerrit H.J. Wolters et al., 1995). Přidáváním dalších purifikovaných enzymů by docházelo vzhledem k náročnosti procesu výroby, k prodražení celého postupu izolace LO. Několik biotechnologických firem se zaměřilo na purifikaci bakteriálních kolagenáz a tím přispěly k rozšíření metody izolace a transplantace LO
- 1 CZ 309541 B6 pacientům trpícím diabetem. V první řadě, produkce těchto purifikovaných enzymů v průmyslovém měřítku přispěla k tomu, aby se metoda mohla stát rutinní medicínskou praxí. Ovšem stále je spousta aspektů, které lze vylepšovat, jedním z nich je právě lepší specifita a čistota, ke které může přispívat synergický efekt přídatných enzymů jakými jsou např. clostripain.
Pro kompletní izolaci a oddělení LO od okolní tkáně potřebuje kolagenáza ColG a ColH působit společně ve specifickém poměru a vyžaduje synergický efekt přídatných enzymů jako jsou neurální proteázy nebo termolyzin (O’Gorman et al., 2005; G. H.J. Wolters et al., 1992). I když jsou schopny kolagenázy ColH a ColG štěpit tkáň slinivky samostatně, případně samotné pouze s příměsí neutrálních proteáz, existují studie na efektivní poměry těchto dvou forem kolagenáz C. histolyticum. Uvádí se, že ideální poměr ColH a ColG je 0,64:1,0 (Brandhorst et al., 2008), z čehož vyplývá, že zásadní je pro štěpení v této kombinaci právě ColG. I když samotná ColH s příměsí neutrálních proteáz je schopna štěpit tkáň slinivky. Poměr dvou zmiňovaných kolagenáz určuje také množství neutrálních proteáz nutných k izolaci LO. Tyto poměry také určují kvalitu desintegrace tkání, která vede ke kvalitě a vyšší životaschopnosti (viabilitě) ostrůvků, která je vyžadována pro úspěšnost samotné transplantace.
Ideální pro izolaci LO je kromě použití specifických poměrů ColG a ColH také použití speciálně míchaných směsí obsahujících podpůrné lytické proteiny. Kromě neutrálních proteáz, termolyzinu a dispázy (používaná v experimentech s prasečími slinivkami) je dalším důležitým enzymem clostripain, který je zodpovědný za tryptickou aktivitu ve směsích pro izolaci LO. Experimenty s izolacemi LO z prasečích slinivek naznačují, že u purifikovaných kolagenáz, které vykazovaly vysokou tryptickou aktivitu a nízkou aktivitu neutrálních proteáz, docházelo k vyššímu výtěžku LO. Další experimenty na potkanech prokázaly, že použití clostripainu vede ke zkrácení času digesce tkáně a nedochází k porušení LO jako při použití jiných směsí (Klock et al., 1996). Základem pro izolaci LO je tedy použití správné proporce nejrůznějších specifických enzymů, které se mohou lišit také tím, jakým způsobem jsou produkovány. Existuje více studií, které potvrzují, že přítomnost clostripainu zvyšuje výnos a kvalitu LO při jejich izolaci (Brandhorst et al., 2009). Na rozdíl od synergického efektu clostripainu a neutrálních proteáz, jeho použití s termolyzinem nemá žádný pozitivní efekt. Ovšem použití různých enzymů se může lišit také vzhledem k materiálu pro izolaci (slinivka prasat, krys nebo humánní materiál). U izolace LO ze slinivky břišní humánního původu docházelo k lepší izolaci při použití clostripainu (Stáhle et al., 2015). Mechanismus působení clostripainu není do důsledku popsaný dodnes, dle hypotéz pomáhá svou aktivitou degradaci elastinu jako součásti extracelulární matrix.
Kromě použití kolagenáz a proteolytických enzymů, pocházejících přímo z produkčních organismů, lze využít k produkci dobře definované systémy pro rekombinantní proteiny. Příprava takových kmenů nemusí být snadná, jelikož protein nemusí být v cílovém organismu dobře produkován. Již v roce 1996 byla připravena kolagenáza ColH z C. histolyticum, produkovaná v bakterii Bacillus subtilis, jelikož je k C. histolyticum více příbuzný než běžně užívaná E. coli (Jung et al., 1996). Ovšem také v E. coli byla připravena funkční rekombinantní kolagenáza (Ducka et al., 2009), kterou lze použít pro izolaci LO.
Takto připravené enzymy byly úspěšně použity pro izolaci LO v experimentech (Brandhorst et al., 2003; Loganathan et al., 2018) a nebyly pozorovány žádné velké signifikantní rozdíly mezi purifikovanou kolagenázou a rekombinantní verzí proteinu. Některé vlastnosti LO byly lepší při použití clostridiální kolagenázy a jiné u té produkované v E. coli. Ovšem použitý poměr kolagenáz je stále předmětem výzkumů a možnost variant poměrů a kombinací s jinými enzymy (clostripain, neutrální proteázy) zvyšují počet všech možných kombinací pro izolaci LO.
Podobně jako rekombinantní kolagenázy byl připraven i rekombinantní clostripain, ovšem ten je odlišný od enzymu produkovaného podle tohoto vynálezu. Jedná se o protein, který má, podobně jako protilátky, lehký a těžký aminokyselinový řetězec a lze jej nalézt v proteinových databázích pod přístupovým číslem WP_138210406.1. Tento protein byl také připraven jako rekombinantní, ale vzhledem k jeho povaze musela být zvolena složitější příprava než u běžných bakteriálních
- 2 CZ 309541 B6 proteinů. (Kim et al., 2007; Witte et al., 1994). Existuje několik studií, při kterých byl použit klostridiální purifikovaný nebo rekombinantní purifikovaný clostripain, jenž zvýšil efektivitu izolace LO (Brandhorst et al., 2019; Dendo et al., 2015; Stáhle et al., 2015), ale vždy se jednalo o protein zmíněný výše (WP_138210406.1).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je kmen Escherichia coli CCM 9176, produkující v plazmidu pET28 rekombinantní protein identifikovaný jako clostripain. Dále způsob produkce, purifikace a použití tohoto proteinu (clostripainu Clos) ve směsi s rekombinantní kolagenázou G a H (ColG a ColH) pro izolaci Langerhansových ostrůvků. Při použití přídavku clostripainu produkovaného z kmene CCM 9176 dochází vždy k zisku vyššího počtu LO při izolaci než při použití samotné surové kolagenázy nebo směsi rekombinantních kolagenáz produkovaných kmeny CCM 9174 a CCM 9175. Součástí příkladů je také produkce kolagenázy G a kolagenázy H produkované kmeny E. coli CCM 9174 a CCM 9175 vytvořenými v laboratoři, s nimiž lze zaručit tento synergický účinek.
Pomocí bioinformatických nástrojů byly v genomu bakterie C. histolyticum (=Hathewaya histolytica) identifikovány geny pro kolagenázu typu I a typu II (ColG a ColH) a také geny pro podjednotky clostripainu, využívaného běžně ve směsích pro izolaci LO (WP_138210406.1). Dále byl identifikován gen, který některé databáze označily automatickou anotací jako clostripain, ale sekvenčně se liší od běžně používaných clostripainů používaných ve studiích s izolacemi LO. Sekvence tohoto clostripain-like proteinu označeného jako clostripain CCM 9176 je znázorněna na obrázku 1 (SEQ ID NO: 1). Tento gen byl naklonován do expresního plazmidu pomocí restrikčního klonování (Ncol a BamHI) a histidinová kotva byla umístěna na C-konec proteinové sekvence. Místo pro odštěpení tagu nebylo integrováno, jelikož protein je funkční i bez odstranění. Teoretický izoelektrický bod proteinu včetně his-tagu je 8,31 a molekulová hmotnost (mw) je 45,7 kDa. Po analýze sekvence aminokyselin vyplývá, že protein obsahuje cystein-peptidázovou doménu patřící do peptidázové rodiny C11 (obrázek 4), která je označovaná jako clostripainová rodina enzymů a obsahuje chymotripsin-like specifické sekvence (Barrett & Rawlings, 2014).
Clostripain má pozitivní vliv na použití směsi kolagenáz pro izolaci LO a byl zkoušen s rekombinantními kolagenázami, produkovanými v E. coli kmen CCM 9174 a CCM 9175. Jedná se o kolagenázy ColG a ColH (SEQ ID NO: 2 a 3, obrázek 2 a 3) původem z C. histolyticum a produkované z plazmidu pET28 pomocí expresních buněk E. coli. V případě ColH se jedná o protein, na jehož C-konci je přidána histidinová kotva, která nemá místo pro odštěpení aminokyselinové sekvence. Produkovaný protein má předpokládanou molekulovou hmotnost 114 kDa a izoelektrický bod 5,68. V případě kolagenázy označené ColG je his-tag na N-konci proteinu a za ním následuje štěpné místo pro trombin, kterým lze kotvu odštěpit. Oba proteiny vykazují biochemickou aktivitu i bez odštěpení histidinové kotvy. ColG má molekulovou hmotnost 123 kDa a teoretický izoelektrický bod 5,58. Všechny postupy jsou optimalizovány tak, aby při produkci a purifikaci proteinů byly použity shodné podmínky. Nedochází sice k produkci a přečištění vysoce purifikovaných enzymů, ale procesy jsou snadno proveditelné pro všechny zmíněné proteiny.
Podstata vynálezu
Celý proces, exprese a purifikace a zapracování je navržen tak, aby byl shodný u všech proteinů, kolagenázy G, kolagenázy H a hlavně nově popsaného clostripainu, který má zásadní pozitivní efekt na izolaci LO. To znamená, že níže popsaný postup lze použít pro všechny bakteriální kultury (E coli CCM 9174, CCM 9175 a CCM 9176) a všechny produkované a purifikované proteiny (ColG, ColH a Clostripain).
Příprava konzervy bakteriální kultury: Práce s bakteriální kulturou probíhá sterilně, při pipetování kultur se používají špičky s filtrem. Do 50 ml LB média (trypton 5 g/l, yeast extract 10 g/l, NaCl
- 3 CZ 309541 B6 g/l, pH 7) se přidá 50 μΐ zásobního roztoku kanamycinu (finální koncentrace 0,05 mg/ml) a 20 μΐ kultury obsahující plazmid pET28 pro produkci Clostripainu nebo ColH nebo ColG. Kultivuje se ve 200 ml Erlenmayerově baňce, v inkubátoru na třepačce, při 37 °C přes noc (14 až 18 hodin). Druhý den se kultura centrifuguje (3500 x g, 20 min, 4 °C), supernatant se odstraní. Pelet se rozpustí v 1 ml vychlazeného 10% glycerolu a po 200 μl rozdělí do sterilních zkumavek, které budou sloužit jako zásobní konzervy. Připravené konzervy se dají zamrazit do -80 °C a takto se dlouhodobě uchovávají. Z nich se vychází při přípravě všech proteinů (ColG, ColH a Clos).
Produkce kolagenáz a clostripainu: Při přípravě produkční kultury se do 600 ml LB média přidá 600 μl zásobního roztoku kanamycinu a zaočkuje 50 μl zásobní kultury v glycerolu, kultivuje se ve 2 l Erlenmayerově baňce. Kultivace probíhá v termoboxu při 37 °C za intenzivního třepání. Kultura se nechá růst do OD6oo= 0,5 po dobu přibližně 3 hodiny. Po dosažení cílené optické denzity se indukuje exprese přidáním IPTG do finální koncentrace 0,2 mM. Po přidání induktoru se kultura následně kultivuje při 22 °C po dobu 18 hodin a stále intenzivně aeruje. Druhý den ráno se sklidí narostlá kultura pomocí centrifugace. Centrifuguje se při 3500 rpm, 20 min, 4 °C. Supernatant se slije a k peletům se přidá 10 až 100 ml vychlazeného sonikačního pufru (do každé kyvety 10 ml), chladí se ledem. Centrifugační kyvety se opláchnou dalšími 10 ml sonikačního pufru a zbytek buněk se přenese k hlavní frakci buněčného peletu ve vhodné nádobě.
Zpracování kultury po expresi proteinů: Pro uvolnění proteinů z buněk se sonikují 3x10 min na ledu, nebo se buňky desintegrují jiným vhodným způsobem, po každých 10 minutách se udělá 5 min pauza, aby se lyzát příliš nezahříval. Sonikuje se na 70% výkonu, při vyšších hodnotách se lyzát velmi rychle zahřívá. Po skončení sonikace se lyzát přenese do ultracentrifugačních zkumavek (Beckman coulter). Centrifuguje se při 1400 x g, 30 min, 4 °C. Získaný supernatant se přefiltruje přes 0,22 μm filtr s PES membránou, aby během purifikace větší časti buněčných zbytků neucpaly chromatografickou kolonu. Pelet se uschová do lednice pro pozdější analýzu na SDSPAGE.
Přečištění proteinů: Purifikace proteinu s histidinovou kotvou se provádí pomocí metalochelatační chromatografie. Používá se např. kolona HisTrap HP 5ml (naplněná a nabitá Ni Sepharose High Perfomance). Metodika ekvilibrace kolony, nanesení vzorku a eluce vzorku je pro všechny systémy stejná. Používané pufry a vodu je nutné před purifikací 10 až 15 min odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Níže používaná zkratka CV, znamená objem kolony (column volume). Kolona je ekvilibrována minimálně 5 CV pufru pro nastavení vhodných podmínek pro purifikaci (50mM Tris, 300mM NaCl, 10mM imidazol, pH 7,5). Po ekvilivbraci kolony je na ni nanesen lyzát obsahující požadovaný solubilní protein (ColG, nebo ColH, nebo Clostripain). Po nanesení celého objemu na kolonu dojde k zachycení proteinu na koloně pomocí histidinové kotvy a odstranění balastních proteinů. Kolona je promyta opět ekvilibračním pufem (3 CV), pro dodatečné odstranění nezachycených nečistot. Na kolonu je nanesen 8% eluční pufr (50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM imidazol, pH 7,5) pro odstranění slabě se vázajících proteinů. Clostripain zůstává zachycený na koloně, část se sice může odmýt, ale dochází k přečištění produktu. Ve druhém kroku je na kolonu nanesen 50% roztok elučního pufru (50mM Tris, 300mM NaCl, 500mM imidazol, pH 7,5), který zapříčiní uvolnění clostripainu z kolony. Tato frakce (obrázek 5) je použita při dalším postupu.
Krok následující po purifikaci je odstranění imidazolu a převod do finálního pufru (50mM Tris, 300mM NaCl, pH 7,5), k tomu se použije chromatografická kolona HiTrap Desalting 5 ml (náplň je na bázi dextranu - Sephadex G-25 Superfine). Metoda pracuje na principu SEC (size exclusion chromatography). V případě, že dojde k tvorbě sraženiny v purifikovaném vzorku, je nutné ho před výměnou pufru přefiltrovat přes 0,45 μm filtr. Pro práci s HiTrap Desalting kolonou lze opět použít injekční stříkačku nebo peristaltickou pumpu. Injekční stříkačka se naplní pufrem pro výměnu v objemu 25 ml (50mM Tris, 300mM NaCl, pH 7,5) a připojí se Luer Lock nástavec. K nástavci se připojí kolona tak, aby nedošlo ke vstupu vzduchu do kolony („drop to drop“). Kolona se ekvilibruje 25 ml pufru při průtoku 5 ml/min (maximální doporučený průtok pro kolonu je 10 ml/min, a tlak 0,25 bar = 25 kPa). V případě, že se do kolony dostane vzduch, proplachuje se
- 4 CZ 309541 B6 tak dlouho, dokud bublina nevyjde ven (otočení kolony během proplachu odstraní vzduch efektivněji).
Na obrázku 5 je fotka gelu po provedené SDS PAGE jednotlivých purifikovaných frakcí clostripainu. Clostripain je přítomen ve všech frakcích, nejčistší je však frakce A10. Koncentrace elučního pufru použitá pro frakci A10 byla použita jako finální eluční koncentrace.
Odstranění imidazolu ze vzorku: Vzorek se na kolonu nanáší injekční stříkačkou 2 až 5 ml. Stříkačka se naplní pufrem pro výměnu a opět připojí bez průniku vzduchu do kolony. Vzorek z kolony se eluuje objemem pufru v závislosti na objemu nanášeného vzorku. V eluátu je poté přítomen požadovaný protein v novém pufru bez imidazolu. Lze také využít klasickou dialýzu proti stejnému pufru s vhodnou dialyzační hadicí s odpovídající porozitou. Dialyzuje se proti 10 x většímu objemu pufru, aby došlo k odstranění nežádoucího imidazolu.
Lyofilizace: Po odstranění imidazolu a po převodu do vhodného pufru, se vzorek přefiltruje přes 0,22 μm PES filtr. Do nové eppendorfky se odebere 50 až 100 μ! vzorku pro další analýzy charakterizující finální produkt (měření koncentrace proteinů - Bradford, určení čistoty produktu - SDS-PAGE, aktivita enzymu). Přefiltrovaný vzorek se sterilně plní do zvážených vialek dle požadovaného množství jednotek potřebných v jedné vialce. Naplněné vialky se dají zamrazit na - 80 °C, alespoň na 1 hodinu. Po namražení lyofilizátoru a zmrznutí vzorku se dají vialky lyofilizovat. Pokud je objem vzorku do 10 ml, vzorek je zlyofilizován do 24 h. Po ukončení lyofilizace se zváží vialka s lyofilizátem a určí se hmotnost produktu.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci clostripainového proteinu podle vynálezu produkovaného kmenem E. coli CCM 9176. Geneticky modifikovaný kmen zachovává sekvenci zjištěnou sekvenací kmene Clostridium histolyticum CCM 8656, popsaného v české přihlášce vynálezu zn. PV 2017-537, na niž byl udělen patent CZ 308157.
Obrázek 2 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci kolagenázy ColG produkovanou kmenem E. coli CCM 9174. Geneticky modifikovaný kmen zachovává sekvenci zjištěnou sekvenací kmene Clostridium histolyticum CCM 8656, popsaného v české přihlášce vynálezu zn. PV 2017-537, na niž byl udělen patent CZ 308157.
Obrázek 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci ColH produkovanou kmenem E. coli CCM 9175. Geneticky modifikovaný kmen zachovává sekvenci zjištěnou sekvenací kmene Clostridium histolyticum CCM 8656, popsaného v české přihlášce vynálezu zn. PV 2017-537, na niž byl udělen patent CZ 308157.
Obrázek 4 představuje schematické znázornění peptidázové domény predikované v proteinu clostripain podle vynálezu.
Obrázek 5 je fotografie gelu po provedené SDS PAGE jednotlivých purifikovaných frakcí clostripainu. Clostripain je přítomen ve všech frakcích, nejčistší je však frakce A10. Koncentrace elučního pufru použitá pro frakci A10 byla použita jako finální eluční koncentrace.
Příklady uskutečnění vynálezu
1. Příklad kultivace/produkce ve fermentoru:
Při přípravě produkční kultury se do 10 litrů LB média přidá 10 ml zásobního roztoku kanamycinu a zaočkuje se 10 ml zásobní kultury v glycerolu, kultivuje se v objemu 10 l ve fermentoru při
- 5 CZ 309541 B6 teplotě 37 °C za intenzivního míchání a vzdušnění. Kultura se nechá růst do OD600 = 0,5. Po dosažení cílené optické denzity se indukuje exprese přidáním IPTG do finální koncentrace 0,2 mM. Po přidání induktoru se kultura následně kultivuje při 22 °C po dobu 18 hodin a stále intenzivně aeruje. Druhý den ráno se narostlá kultura centrifuguje v 0,5 l kyvetách při 3500 x g, 20 min, 4 °C. Supernatant se slije a k peletům se přidá 10 až 100 ml vychlazeného sonikačního pufru (do každé kyvety 10 ml) do falkony, která se chladí ledem.
2. Příklad purifikace pomocí centrifugace:
Protino Ni-NTA Agarose lze využít pro purifikaci na běžné centrifuze bez nutnosti použití FPLC apod. Při ekvilibraci se resuspenduje Protino Ni-NTA Agarose důkladným protřepáním. Ihned se odebere potřebné množství suspenze do vhodné zkumavky (objem se volí min. 10 x větší, než je objem agarózových kuliček - gelu. Například pro 1 ml gelu se použijí 12 ml zkumavky). Gel se sedimentuje centrifugací při 500 x g, 5 minut. Přidá se 10 objemů ekvilibračního pufru (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazol) pro kalibraci gelu. Opakovaným otočením zkumavky se její obsah promíchá. Gel se sedimentujeme při 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant do odpadní nádobky. Pro navázání proteinů ke gelu se aplikuje přefiltrovaný bakteriální lyzát s obsahem požadovaných proteinů. Celá suspenze se jemně míchá po dobu 30 až 60 min (vznik vazby mezi His-tag proteiny a Ni2+ ionty). Gel se sedimentuje centrifugací 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant do odpadní nádobky. Přidá se 10 objemů oplachového pufru (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazol) pro oplach gelu. Opakovaným otočením zkumavky se její obsah promíchá. Gel se sedimentuje při 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant do odpadní nádobky a opakuje se oplachovací krok. Pro eluci proteinu se k sedimentovanému gelu přidá 1 objem elučního pufru (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazol). Suspenze se jemně míchá 2 min při pokojové teplotě. Dojde k uvolnění navázaných Histag proteinů (Clostripain, nebo ColG nebo ColH) z gelu. Gel se sedimentuje při 500 x g, 5 minut. Opatrně se odebere supernatant s požadovanými proteiny do nové zkumavky. Eluované proteiny se skladují na ledu. Eluční kroky se opakují celkem 5 x. Eluované frakce se odebírají vždy do nové zkumavky. Ze vzorku se odstraní imidazol dialýzou, ultrafiltrací nebo pomocí odsolovací kolony (HiTrap desalting).
3. Izolace LO ze slinivky břišní na experimentálních zvířatech (potkani wistar):
Potkaní slinivky byly ošetřeny kontrolní kolagenázou (Sigma Aldrich) a kolagenázou produkovanou kmeny E. coli CCM 9174 a CCM 9175 s přídavkem clostripainu produkovaného kmenem E. coli CCM 9176. Byl použit objem 15 ml roztoku směsi s kolagenázovou aktivitou 2 U/ml. Poměr enzymů činil ColG:ColH:Clos (5:5:1). Digesce probíhá v teplotě 37 °C po dobu 10 až 40 minut dle stavu pankreatu a jednotlivé buněčné tkáně jsou následně separovány pomocí diskontinuální gradientové centrifugace. Izolované ostrůvky byly kultivovány v CMRL-1066 médiu doplněném o 10% FBS, 5% HEPES, 1% Glutamax a 1% penicilinu-streptomycinu v zvlhčovacím inkubátoru v 37 °C a 5% atmosféře CO2. Kvalita izolovaných LO byla stanovena pomocí vitálního barvení a stimulovanou sekrecí inzulinu.
4. Izolace LO ze slinivky břišní na experimentálních zvířatech v jiných poměrech A:
Potkaní slinivky byly ošetřeny kontrolní kolagenázou (Sigma Aldrich) a kolagenázou ColH podle vynálezu s přídavkem clostripainu Clos podle vynálzu. Byl použit objem 15 ml roztoku směsi s kolagenázovou aktivitou 2 U/ml. Poměr kolagenáz činil ColH:Clos (5:2). Digesce probíhá dle příkladu č. 3.
5. Izolace LO ze slinivky břišní na experimentálních zvířatech v jiných poměrech B:
Potkaní slinivky byly ošetřeny kontrolní kolagenázou (Sigma Aldrich) a kolagenázou CCM 9174 a CCM 9175 s přídavkem clostripainu CCM 9176. Byl použit objem 15 ml roztoku směsi
- 6 CZ 309541 B6 s kolagenázovou aktivitou 2 U/ml. Poměr kolagenáz činil ColG:ColH:Clos (7:4:2). Digesce probíhá dle příkladu č. 3.
Průmyslová využitelnost
Směs rekombinantní kolagenázy G a H obsahující nový typ clostripainu lze využít pro zefektivnění izolace LO. Nový typ rekombinantního clostripainu produkovaný bakterií E. coli CCM 9176 může být přidán také do směsí surových kolagenáz anebo být využit do jiných směsí rekombinantních kolagenáz, než je výše zmíněná směs CCM 9174 a CCM 9175.
Seznam sekvencí:
SEQ ID NO: 1
Clostripain podle vynálezu Clos
MENKKFKKWTILIYTDGNNEMEDIMFKSMNDCKSVEVKEDINLVMQIGLLGESKLYNK NKFSGVRRYYLNAKEPMLLENLGKANMGDPNILYNFIRWGIKEFPAHHYMVIISGHGTS FVGALTDTSLDKNYIMGIPEMIKAISLGCKELKSIIDILVLDMCFMNSIEILYELSQYESIDR MITYTDTAPYGGLGYKKLVEAIEKNCNLKDIDLFTKNLITNLNFNLTAYDLDKFKLELIK KKFSYLAFNYLNNKERSKNPLDIINSIHPSNPYYSFNNTYYDYFNEINGTIKSTIIHDKSKF NGINSSIKIENKDINNLIAFYRKLEFSRENSWTDLLYNNSNTQKRDINKVKVRTPTSSLTTT HYILQFNPKDPNSSSVDKLAAALEHHHHHH
SEQ ID NO: 2
Sekvence produkované kolagenázy ColG
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMEPIENTNDTSIKNVEKLRNAPNEENSKKVEDSKNDKVE HVKNIEEAKVEQVAPEVKSKSTLRSASIANTNSEKYDFEYLNGLSYTELTNLIKNIKWNQI NGLFNYSTGSQKFFGDKNRVQAIINALQESGRTYTANDMKGIETFTEVLRAGFYLGYYN DGLSYLNDRNFQDKCIPAMIAIQKNPNFKLGTAVQDEVITSLGKLIGNASANAEVVNNC VPVLKQFRENLNQYAPDYVKGTAVNELIKGIEFDFSGAAYEKDVKTMPWYGKIDPFINE LKALGLYGNITSATEWASDVGIYYLSKFGLYSTNRNDIVQSLEKAVDMYKYGKIAFVAM ERITWDYDGIGSNGKKVDHDKFLDDAEKHYLPKTYTFDNGTFIIRAGDKVSEEKIKRLY WASREVKSQFHRVVGNDKALEVGNADDVLTMKIFNSPEEYKFNTNINGVSTDNGGLYIE PRGTFYTYERTPQQSIFSLEELFRHEYTHYLQARYLVDGLWGQGPFYEKNRLTWFDEGT AEFFAGSTRTSGVLPRKSILGYLAKDKVDHRYSLKKTLNSGYDDSDWMFYNYGFAVAH YLYEKDMPTFIKMNKAILNTDVKSYDEIIKKLSDDANKNTEYQNHIQELADKYQGAGIPL VSDDYLKDHGYKKASEVYSEISKAASLTNTSVTAEKSQYFNTFTLRGTYTGETSKGEFK DWDEMSKKLDGTLESLAKNSWSGYKTLTAYFTNYRVTSDNKVQYDVVFHGVLTDNAD ISNNKAPIAKVTGPSTGAVGRNIEFSGKDSKDEDGKIVSYDWDFGDGATSRGKNSVHAY KKAGTYNVTLKVTDDKGATATESFTIEIKNEDTTTPITKEMEPNDDIKEANGPIVEGVTV KGDLNGSDDADTFYFDVKEDGDVTIELPYSGSSNFTWLVYKEGDDQNHIASGIDKNNSK VGTFKSTKGRHYVFIYKHDSASNISYSLNIKGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPNFNTTM QGSLLGDDSRDYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEFGVTWTLHPESNINDRITYGQVDGNKV SNKVKLRPGKYYLLVYKYSGSGNYELRVNK
SEQ ID NO: 3
Sekvence produkované kolagenázy ColH
MVQNESKRYTVSYLKTLNYYDLVDLLVKTEIENLPDLFQYSSDAKEFYGNKTRMSFIMD EIGRRAPQYTEIDHKGIPTLVEVVRAGFYLGFHNKELNEINKRSFKERVIPSILAIQKNPNF
- 7 CZ 309541 B6
KLGTEVQDKIVSATGLLAGNETAPPEVVNNFTPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFNVLA APTYDITEYLRATKEKPENTPWYGKIDGFINELKKLALYGKNDNNSWIIDNGIYHIAPLG KLHSNNKIGIETLTEVMKVYPYLSMQHLQSADQIKRHYDSKDAEGNKIPLDKFKKEGKE KYCPKTYTFDDGKVIIKAGARVEEEKVKRLYWASKEVNSQFFRVYGIDKPLEEGNPDDI LTMVIYNSPEEYKLNSVLYGYDTNNGGMYIEPEGTFFTYEREAQESTYTLEELFRHEYTH YLQGRYAVPGQWGRTKLYDNDRLTWYEEGGAELFAGSTRTSGILPRKSIVSNIHNTTRN NRYKLSDTVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGILNKLNDLAKNNDVDGYDNY IRDLSSNYALNDKYQDHMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKL KDAKSEVKKSQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDTYSWSGYKT LTAYFTNYKVDSSNRVTYDVVFHGYLPNEGDSKNSLPYGKINGTYKGTEKEKIKFSSEG SFDPDGKIVSYEWDFGDGNKSNEENPEHSYDKVGTYTVKLKVTDDKGESSVSTTTAEIK DLSENKLPVIYMHVPKSGALNQKVVFYGKGTYDPDGSIAGYQWDFGDGSDFSSEQNPS HVYTKKGEYTVTLRVMDSSGQMSEKTMKIKITDPVYPIGTEKEPNNSKETASGPIVPGIP VSGTIENTSDQDYFYFDVITPGEVKIDINKLGYGGATWVVYDENNNAVSYATDDGQNLS GKFKADKPGRYYIHLYMFNGSYMPYRINIEGSVGRDPNSSSVDKLAAALEHHHHHH
Přehled literatury
Alipour, H., Raz, A., Dinparast Djadid, N., Rami, A., & Mahdian, S. M. A. (2014). Codon optimization of Col H gene encoding Clostridium histolyticum collagenase to express in Escherichia coli. Codon Optimization of Col H Gene Encoding Clostridium Histolyticum Collagenase to Express in Escherichia Coli. https://doi.org/10.7287/peeij.preprints.754
Barrett, A. J., & Rawlings, N. D. (2014). Evolutionary Lines of Cysteine Peptidases. Biological Chemistry. https://doi.org/ 10.1515/bchm.2001.382.5.727
Berney, T., Molano, R. D., Cattan, P., Pileggi, A., Vizzardelli, C., Oliver, R., Ricordi, C., & Inverardi, L. (2001). Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. https://doi.org/10.1097/00007890-200101150-00020
Brandhorst, H., Brandhorst, D., Hesse, F., Ambrosius, D., Brendel, M., Kawakami, Y., & Bretzel, R. G. (2003). Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. https://doi.org/10.2337/diabetes.52.5.1143
Brandhorst, H., Friberg, A., Andersson, H. H., Felldin, M., Foss, A., Salmela, K., Lundgren, T., Tibell, A., Tufveson, G., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2009). The importance of tryptic-like activity in purified enzyme blends for efficient islet isolation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0b013e31819499f0
Brandhorst, H., Johnson, P. R., Monch, J., Kurfurst, M., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2019). Comparison of Clostripain and Neutral Protease as Supplementary Enzymes for Human Islet Isolation. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1177/0963689718811614
Brandhorst, H., Raemsch-Guenther, N., Raemsch, C., Friedrich, O., Huettler, S., Kurfuerst, M., Korsgren, O., & Brandhorst, D. (2008). The ratio between collagenase class I and class II influences the efficient islet release from the rat pancreas. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0b013e31816050c8
Dendo, M., Maeda, H., Yamagata, Y., Murayama, K., Watanabe, K., Imura, T., Inagaki, A., Igarashi, Y., Katoh, Y., Ebina, M., Fujimori, K., Igarashi, K., Ohuchi, N., Satomi, S., & Goto, M. (2015). Synergistic Effect of Neutral Protease and Clostripain on Rat Pancreatic Islet Isolation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/TP.0000000000000662
Ducka, P., Eckhard, U., Schonauer, E., Kofler, S., Gottschalk, G., Brandstetter, H., & Nuss, D.
- 8 CZ 309541 B6 (2009) . A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collagenases in E. coli. Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253009-1953-4
Jung, C. M., Matsushita, O., Katayama, S., Minami, J., Ohhira, I., & Okabe, A. (1996). Expression of the colH gene encoding Clostridium histolyticum collagenase in Bacillus subtilis and its application to enzyme purification. Microbiology and Immunology. https://doi.org/10.1111/j.13480421.1996.tb01161.x
Kim, C. K., Lee, S. Y., Kwon, O. J., Lee, S. M., Nah, S. Y., & Jeong, S. M. (2007). Secretory expression of active clostripain in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2007.07.936
Klock, G., Kowalski, M. B., Hering, B. J., Eiden, M. E., Weidemann, A., Langer, S., Zimmermann, U., Federlin, K., & Bretzel, R. G. (1996). Fractions from commercial collagenase preparations: Use in enzymic isolation of the islets of Langerhans from porcine pancreas. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1016/0963-6897(96)00023-1
Loganathan, G., Subhashree, V., Breite, A. G., Tucker, W. W., Narayanan, S., Dhanasekaran, M., Mokshagundam, S. P., Green, M. L., Hughes, M. G., Williams, S. K., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., & Balamurugan, A. N. (2018). Beneficial effect of recombinant rC1rC2 collagenases on human islet function: Efficacy of low-dose enzymes on pancreas digestion and yield. American Journal of Transplantation. https://doi.org/10.1111/ajt.14542
O’Gorman, D., Kin, T., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., & Lakey, J. R. T. (2005). Multilot analysis of custom collagenase enzyme blend in human islet isolations. Transplantation Proceedings. https://doi.org/10.1016/j.transproceed.2005.09.139
Stáhle, M., Foss, A., Gustafsson, B., Lempinen, M., Lundgren, T., Rafael, E., Tufveson, G., Korsgren, O., & Friberg, A. (2015). Clostripain, the Missing Link in the Enzyme Blend for Efficient Human Islet Isolation. Transplantation Direct.
https://doi.org/10.1097/txd.0000000000000528
Vargas, F., Vives-Pi, M., Somoza, N., Armengol, P., Alcalde, L., Marti, M., Costa, M., Serradell, L., Dominguez, O., Fernández-Llamazares, J., Julian, J. F., Sanmarti, A., & Pujol-Borrell, R. (1998). Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation. https://doi.org/10.1097/00007890-19980315000020
Volpe, L., Salamone, M., Giardina, A., & Ghersi, G. (2016). Optimization of a Biotechnological Process for Production and Purification of Two Recombinant Proteins: Col G and Col H. Chemical Engineering Transactions. https://doi.org/10.3303/CET1649011
Vos-Scheperkeuter, G. H., Van Suylichem, P. T. R., Vonk, M. W. A., Wolters, G. H. J., & Van Schilfgaarde, R. (1997). Histochemical Analysis of the Role of Class I and Class II
Clostridium Histolyticum Collagenase in the Degradation of Rat Pancreatic Extracellular Matrix for Islet Isolation. Cell Transplantation. https://doi.org/10.1177/096368979700600407
Witte, V., Wolf, N., Diefenthal, T., Reipen, G., & Dargatz, H. (1994). Heterologous expression of the clostripain gene from Clostridium histolyticum in Escherichia coli and Bacillus subtilis: Maturation of the clostripain precursor is coupled with self-activation. Microbiology. https://doi.org/10.1099/13500872-140-5-1175
Wolters, G. H.J., Vos -Scheperkeuter, G. H., van Deijnen, J. H. M., & van Schilfgaarde, R. (1992).
- 9 CZ 309541 B6
An analysis of the role of collagenase and protease in the enzymatic dissociation of the rat pancreas for islet isolation. Diabetologia. https://doi.org/10.1007/BF00429093
Wolters, Gerrit H.J., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., & Van Schilfgaarde, R. (1995).
Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. https://doi.org/10.2337/diab.44.2.227
Claims (4)
1. Geneticky modifikovaný bakteriální kmen E. coli uložený v České sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 9176 s vneseným plazmidem pET28 obsahující gen pro clostripainovou peptidázu 5 mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, produkující enzym peptidázu.
2. Použití purifikovaného kmene podle nároku 1 pro produkci clostripainové peptidázy o sekvenci SEQ ID NO: 1.
3. Použití kmene E. coli uloženého v České sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 9176 pro produkci clostripainové peptidázy o sekvenci SEQ ID NO: 1 vhodné v kombinaci s kolagenázou G 10 a/nebo kolagenázou H pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu.
4. Použití podle nároku 3, kde se použije kolagenáza G o sekvenci SEQ ID NO: 2 produkovaná kmenem E. coli CCM 9174 a/nebo kolagenáza H o sekvenci SEQ ID NO: 3 produkovaná kmenem E. coli CCM 9175.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-400A CZ309541B6 (cs) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu |
| PCT/CZ2022/050081 WO2023030562A1 (en) | 2021-08-30 | 2022-08-23 | Genetically modified bacterial strain e. coli producing clostripain peptidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-400A CZ309541B6 (cs) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2021400A3 CZ2021400A3 (cs) | 2023-03-29 |
| CZ309541B6 true CZ309541B6 (cs) | 2023-03-29 |
Family
ID=83438874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2021-400A CZ309541B6 (cs) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309541B6 (cs) |
| WO (1) | WO2023030562A1 (cs) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2193354A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Catherine Lee | Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet cells |
| CZ308157B6 (cs) * | 2017-09-13 | 2020-01-29 | MB PHARMA s.r.o. | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
-
2021
- 2021-08-30 CZ CZ2021-400A patent/CZ309541B6/cs unknown
-
2022
- 2022-08-23 WO PCT/CZ2022/050081 patent/WO2023030562A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2193354A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Catherine Lee | Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet cells |
| CZ308157B6 (cs) * | 2017-09-13 | 2020-01-29 | MB PHARMA s.r.o. | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DENDO, Mami, et al. Synergistic effect of neural protease and clostripain on rat pancreatic islet isolation. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2015, Vol. 99, No. 7, p. 1349-1355, ISSN 0041-1337, celý dokument * |
| HEISER, Axel, et al. Isolation of porcine pancreatic islets: Low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 1994, Vol. 8, No. 6, p. 407-411, ISSN 0887-8013, celý dokument. * |
| McCARTHY, Robert C., et al. Evolution of enzyme requirements for human islet isolation. OBM Transplantation, 2018, Vol. 2, No. 4, p. 1 - 30, ISSN 2577-5820, celý dokument * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2021400A3 (cs) | 2023-03-29 |
| WO2023030562A1 (en) | 2023-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12234491B2 (en) | Methods of recombinantly producing neutral protease originating from Paenibacillus polymxa | |
| AU2013337574B2 (en) | Cytochrome P450 and cytochrome P450 reductase polypeptides, encoding nucleic acid molecules and uses thereof | |
| WO1998024889A1 (en) | Enzyme composition for tissue dissociation | |
| JP2953477B2 (ja) | クロストリジウム・ヒストリティカムからの組換えプロティナーゼ並びに細胞及び細胞群の単離のためのその使用 | |
| NO323623B1 (no) | Isolert og renset TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)-polypeptid med evnen til a omdanne TNF-<alfa> fra formen pa 26 kD til formen pa 17 kD, isolerte og rensede antistoffer, fremgangsmate for pavisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertcelle, fremgangsmate for fremstilling av et TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)- polypeptid, anvendelse av TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)- polypeptid for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer, inflammasjon eller fertilitetsforstyrrelser. | |
| US11220666B2 (en) | Bacterial strain clostridium histolyticum and methods of use thereof | |
| CZ309541B6 (cs) | Kmen produkující clostripain-like protein pro použití ve směsi s rekombinantní kolagenázou ColG a ColH pro izolaci Langerhansových ostrůvků pankreatu | |
| EP2319921B1 (en) | Novel protease and use thereof | |
| EP3221448B1 (en) | Process for producing recombinant trypsin | |
| US10047353B2 (en) | Grimonitia-hollisae-derived recombinant collagenase and enzyme agent for cell and tissue dissociation | |
| KR20010109348A (ko) | 췌장의 프로카복시-펩티다제 ｂ, 이의 동질 효소 및뮤테인의 제조 방법, 및 이들의 용도 | |
| Leontovyc et al. | A Preliminary Characterization of a Novel Recombinant Clostridial Collagenase Blend. | |
| CN120665848A (en) | Gram-negative bacterial lyase and application thereof | |
| CN120098978A (zh) | 一种丝氨酸肽酶、核酸分子及其应用 | |
| Loganathan et al. | Journal of Transplantation Technologies & Research | |
| CZ36714U1 (cs) | Termostabilní endolysin a kódující sekvence |