CZ36714U1 - Termostabilní endolysin a kódující sekvence - Google Patents

Termostabilní endolysin a kódující sekvence Download PDF

Info

Publication number
CZ36714U1
CZ36714U1 CZ2022-40347U CZ202240347U CZ36714U1 CZ 36714 U1 CZ36714 U1 CZ 36714U1 CZ 202240347 U CZ202240347 U CZ 202240347U CZ 36714 U1 CZ36714 U1 CZ 36714U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
endolysin
thermostable
sequence
acc
protein
Prior art date
Application number
CZ2022-40347U
Other languages
English (en)
Inventor
LubomĂ­r Janda
Janda Lubomír RNDr., Ph.D
Šárka Kobzová
Šárka Mgr. Kobzová
Lukáš Vacek
Lukáš Mgr Vacek
Original Assignee
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i filed Critical Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i
Priority to CZ2022-40347U priority Critical patent/CZ36714U1/cs
Publication of CZ36714U1 publication Critical patent/CZ36714U1/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Termostabilní endolysin a kódující sekvence
Oblast techniky
Předkládané technické řešení se týká termostabilního endolysinu a genového konstruktu pro jeho expresi. Termostabilní bakteriofágový endolysin má katalytickou aktivitu CHAP domény (cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases).
Dosavadní stav techniky
Endolysin (EC 3.5.1.28) je monomerní enzym patřící do skupiny peptidů a proteinů známých jako bakteriofágové endolysiny. Jedná se o lytický enzym produkovaný bakteriofágem Φ812 (známý také jako bakteriofág Lys K, GH15, Sb-1, G1, SA11, A5W), respektive jeho mutovanou variantu F1. Jedná se o hydrolytický enzym N-acetylmuramoyl-L-alanin amidázu, který štěpí peptidovou vazbu mezi tetrapeptidovým řetězcem a penta-glycinovým můstkem peptidoglykanu v buněčných stěnách bakterií Staphylococcus aureus. Struktura aktivní zkrácené formy endolysinu je tvořena katalytickou CHAP doménou a vazebnou doménou (CWD), která interaguje s peptidoglykanem buněčných stěn. Obě domény jsou spojeny linkerem, což je řetězec 39 aminokyselin dlouhý.
Předkládané řešení si klade za cíl poskytnout termostabilní endolysin s vysokou aktivitou a stabilitou, s prodlouženou dobou antibakteriálního účinku a snadnou expresí, a rovněž genový konstrukt pro efektivní produkci tohoto endolysinu.
Podstata technického řešení
Předkládané technické řešení poskytuje termostabilní endolysin (β-lytickou endopeptidázu) s dvěma bodovými mutacemi T72P a G124P, který obsahuje sekvenci SEQ ID NO. 1. Místa mutací jsou vyznačena tučně:
MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAVDADGYYHAQCQDL ITDYVLWLTDNKVRPWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQW GHIGIVYDPGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAK KSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGA TIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK (SEQ ID NO. 1).
Ve výhodném provedení se termostabilní endolysin exprimuje ve formě fúzního termostabilního endolysinu, který kromě sekvence označené jako SEQ ID NO. 1 obsahuje sekvence ubikvitinu 3 a 14xHis-Tagu, přičemž sekvence kódující 14xHis-Tag je následována podtrženou sekvencí (NLYFQ) kódující štěpné místo pro TEV proteázu. Tento fúzní termostabilní endolysin má sekvenci SEQ ID NO. 2:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ KESTLHLVLQLESAHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHSGAENLYFQSGSGTMAKTQAEIN KRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAVDADGYYHAQCQDLITDYVLWLT DNKVRPWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDPG NTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASTPATRP VTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQ AGHIWIGYNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK (SEQ ID NO.2)
- 1 CZ 36714 U1
Fúzní termostabilní endolysin obsahující sekvenci ubikvitinu 3 má vysokou expresi (cca 10krát vyšší než samotný termostabilní endolysin sekvence SEQ ID NO. 1). Pro maximalizaci antibakteriální aktivity je však vhodné sekvence ubikvitinu a 14xHisTagu odštěpit.
Předkládané technické řešení dále poskytuje kódující sekvenci termostabilního endolysinu, která obsahuje sekvenci SEQ ID NO. 3 se dvěma bodovými mutacemi T72P a G124P (odpovídající kodóny jsou vyznačeny malými písmeny a podtrženy) s optimalizovanou frekvencí kodonů pro E. coli:
ATGGCGAAAACCCAAGCGGAAATCAATAAGCGTCTGGATGCGTATGCGAAAGGTAC CGTCGACAGCCCGTACCGTGTGAAAAAGGCGACCAGCTACGACCCGAGCTTTGGTGT TATGGAAGCGGGTGCGGTCGACGCGGATGGTTACTATCACGCGCAGTGCCAAGACCT GATCACCGATTACGTGCTGTGGCTGACCGACAACAAAGTTAGGcctTGGGGCAACGCG AAGGATCAGATCAAACAAAGCTATGGCACCGGCTTCAAGATTCACGAGAACAAACC GAGCACCGTGCCGAAGAAAGGTTGGATCGCGGTTTTTACTAGTGGCAGCTACGAACA GTGGGGTCACATCGGCATTGTGTATGACccgGGCAACACCAGCACCTTCACCATTCTC GAGCAAAACTGGAACGGTTACGCGAACAAGAAACCGACCAAGCGTGTTGATAACTA CTATGGTCTGACCCACTTTATCGAGATTCCGGTGAAAGCGGGCACCACCGTTAAGAA AGAAACCGCGAAGAAAAGCGCGAGCACCCCGGCGACCCGTCCGGTGACCGGTAGCT GGAAGAAAAACCAGTACGGCACCTGGTATAAACCGGAAAACGCGACCTTCGTGAAC GGTAACCAACCGATCGTTACCCGTATTGGCAGCCCGTTTCTGAACGCGCCGGTTGGT GGCAACCTGCCGGCGGGTGCGACCATTGTGTACGATGAGGTTTGCATTCAGGCGGGT CACATCTGGATTGGCTACAACGCGTATAACGGCAACCGTGTGTATTGCCCGGTTCGT ACCTGCCAAGGTGTGCCGCCGAACCAGATTCCGGGTGTTGCGTGGGGTGTTTTCAAA TAA (SEQ ID NO. 3).
Pro zlepšení míry exprese je vhodné produkovat termostabilní endolysin ve formě fúzního termostabilního endolysinu, jehož kódující sekvence obsahuje kódující sekvenci ubikvitinu 3 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu 3 sekvenci kódující 14xHisTag, přičemž sekvence kódující 14xHisTag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována nukleotidovou sekvencí kódující termostabilní endolysin s dvěma bodovými mutacemi T72P a G124P s optimalizovanou frekvencí kodonů pro E. coli. Tato sekvence je zde uvedena jako SEQ ID NO. 4.
atgcagatcttcgttaaaaccctgaccggtaaaaccatcaccctggaagttgaaccgtctgacaccatcgaaaacgttaaagcgaaaatcca ggacaaagaaggtatcccgccggaccagcaggaactgatcttcgcgggtaaacagctggaagacggtcgtaccctgtctgactacaacat ccagaaagaatctaccctgcacctggttctgcagctcgagtctgcccaccaccaccactctggtcaccaccacacgggtcaccaccaccac tctggttctcaccaccactctggtgccgaaaacctgtacttccagtctggttctggtaccATGGCGAAAACCCAAGCGGAA ATCAATAAGCGTCTGGATGCGTATGCGAAAGGTACCGTCGACAGCCCGTACCGTGTG AAAAAGGCGACCAGCTACGACCCGAGCTTTGGTGTTATGGAAGCGGGTGCGGTCGA CGCGGATGGTTACTATCACGCGCAGTGCCAAGACCTGATCACCGATTACGTGCTGTG GCTGACCGACAACAAAGTTAGGcctTGGGGCAACGCGAAGGATCAGATCAAACAAAG CTATGGCACCGGCTTCAAGATTCACGAGAACAAACCGAGCACCGTGCCGAAGAAAG GTTGGATCGCGGTTTTTACTAGTGGCAGCTACGAACAGTGGGGTCACATCGGCATTG TGTATGACccgGGCAACACCAGCACCTTCACCATTCTCGAGCAAAACTGGAACGGTTA CGCGAACAAGAAACCGACCAAGCGTGTTGATAACTACTATGGTCTGACCCACTTTAT CGAGATTCCGGTGAAAGCGGGCACCACCGTTAAGAAAGAAACCGCGAAGAAAAGCG CGAGCACCCCGGCGACCCGTCCGGTGACCGGTAGCTGGAAGAAAAACCAGTACGGC ACCTGGTATAAACCGGAAAACGCGACCTTCGTGAACGGTAACCAACCGATCGTTACC CGTATTGGCAGCCCGTTTCTGAACGCGCCGGTTGGTGGCAACCTGCCGGCGGGTGCG ACCATTGTGTACGATGAGGTTTGCATTCAGGCGGGTCACATCTGGATTGGCTACAAC GCGTATAACGGCAACCGTGTGTATTGCCCGGTTCGTACCTGCCAAGGTGTGCCGCCG AACCAGATTCCGGGTGTTGCGTGGGGTGTTTTCAAATAA (SEQ ID NO.4)
- 2 CZ 36714 UI
Původní gen endolysinu kódující CHAP doménu (endopeptidázu) obsahuje enzymovou část a amidázovou doménu ovlivňující aktivitu enzymu (EF 136588.1 Staphylococcus phage 812 kmen Φ812Η putativní holin a zkrácené geny endolysinu, úplné cds). V rámci předkládaného řešení byla sekvence kódující enzymovou část vyňata z genu a byla optimalizována frekvence kodonů 5 pro E. coli. Navíc byly provedeny změny kodónů vedoucí k mutacím T72P a G124P (kodóny podtrženy), tím byla vytvořena SEQ ID NO. 3. Dále může být připojen fúzní protein ubiquitin 3 a 14xHisTag kotvička (malá písmena v SEQ ID NO. 4).
Níže je uvedena kódující sekvence SEQ ID NO. 4 s kódovanými aminokyselinami (SEQ ID 10 NO. 2). Podtrženy jsou kodóny a aminokyseliny odpovídající mutacím T72P a G124P:
atg cag atc ttc gtt aaa acc ctg acc ggt aaa acc atc acc ctg gaa gtt gaa ccg tet
M a I F V K T L T G K T I T L T V E P 5
gac acc atc gaa aac gtt aaa gcg aaa atc cag gac aaa gaa ggt atc ccg ccg gac cag
D T I E N V K A K I Q □ K E G I P P D Q
cag gaa ctg atc ttc gcg ggt aaa cag ctg gaa gac ggt cgt acc ctg tet gac tac aac
Q E L I F A G K Q L T Π G R T L 3 □ Y N
atc cag aaa gaa tet acc ctg cac ctg gtt ctg cag ctc gag tet gcc cac cac cac cac
I Q K E S Γ L H L V L a L E 5 A H H H H
tet ggt cac cac cac acg ggt cac cac cac cac tet ggt tet cac cac cac tet ggt gcc
S G H H H Γ G H H H H Ξ G 5 H H H 3 G A
gaa aac ctg tac ttc cag tet ggt tet ggt acc atg gcg aaa acc caa gcg gaa atc aat
i H L Ϊ F Q 3 G 3 G Γ M A K I Q A E I N
aag cgt ctg gat gcg tat gcg aaa ggt acc gtc gac age ccg tac cgt gtg aaa aag gcg
K R L D A Y A K G V □ 3 P Ϊ R V E K A
acc age tac gac ccg age ttt ggt gtt atg gaa gcg ggt gcg gtc gac gcg gat ggt tac
T 3 Y D F Ξ F G V M T A G A V D A □ G Ϊ
tat cac gcg cag tgc caa gac ctg atc acc gat tac gtg ctg tgg ctg acc gac aac aaa
Y H A Q C Q D L I D Y V L W L T □ N K
gtt agg cct tgg ggc aac gcg aag gat cag atc aaa caa age tat ggc acc ggc ttc aag
V R P W G N A K D Q I K Q 5 Ϊ G T G F K
att cac gag aac aaa ccg age acc gtg ccg aag aaa ggt tgg atc gcg gtt ttt act agt
I H E N K P 3 T v P K K G W I A V F I Ξ
ggc age tac gaa cag tgg ggt cac atc ggc att gtg tat gac ccg ggc aac acc age acc
G 3 Y E Q w G H I G I V Y D P G N T 3 2
ttc acc att ctc gag caa aac tgg aac ggt tac gcg aac aag aaa ccg acc aag cgt gtt
F T I L E Q N W N G Ύ A N K K P T E R V
gat aac tac tat ggt ctg acc cac ttt atc gag att ccg gtg aaa gcg ggc acc acc gtt
D N Y Ϊ G L T H F I i I P V K A G T I V
aag aaa gaa acc gcg aag aaa age gcg age acc ccg gcg acc cgt ccg gtg acc ggt age
-3CZ 36714 UI
K K E T A K K s A 5 Γ P A I R P V T G 5
tgg aag aaa aac cag tac ggc acc tgg tat aaa ccg gaa aac gcg acc ttc gtg aac ggt
W K K N Q Y G T W Ϊ K P E N A T F V N G
aac caa ccg atc gtt acc cgt att ggc agc ccg ttt ctg aac gcg ccg gtt ggt ggc aac
N a P I V Γ R I G 5 P F L N A P V G G N
ctg ccg gcg ggt gcg acc att gtg tac gat gag gtt tgc att cag gcg ggt cac atc tgg
L P A G A Γ I V Ϊ D E V C I Q A G H I W
att ggc tac aac gcg tat aac ggc aac cgt gtg tat tgc ccg gtt cgt acc tgc caa ggt
I G Ϊ N A Y N G N R V Y C P V R T C Q G
gtg ccg ccg aac cag att ccg ggt gtt gcg tgg ggt gtt ttc aaa taa
V P P N Q I P G V A W G V F K -
Genový konstrukt podle technického řešení lze s výhodou exprimovat pomocí expresního systému zahrnujícího rekombinantní plasmid obsahující indukovatelný promotor a selekční gen, a dále obsahující sekvenci označenou výše jako SEQ ID NO.4.
Indukovatelným promotorem může být promotor T7, selekčním genem gen pro rezistenci k antibiotiku kanamycin. Vhodným plasmidem je například expresní vektor pUbEx20 (Funkční vzorek 5792/2019 „Plasmid pUbEx20 k produkci proteinů pro komerční využití v heterologním expresním systémuE. coli“. Janda, L., Kobzová, Š., Norek, A. ISBN 978-80-88233-86-2).
Genový konstrukt a (fúzní) termostabilní endolysin podle technického řešení byly navrženy s využitím energetického a evolučního výpočetního přístupu stabilizace proteinů. Bylo navrženo 15 potenciálně stabilizujících jednobodových mutací β-lytické endopeptidázy. Po verifikaci jednobodových mutací bylo navrženo a experimentálně ověřeno pět dvoubodových mutací, z nichž varianta, která je předmětem tohoto technického řešení, vykazuje zlepšení teplotní stability enzymu o 3,4 °C. Sekvence obsahuje dvě bodové mutace T72P (prolin za threonin) v katalytické doméně a G124P (prolin za glycin) ve vazebné doméně. Mutovaný enzym kromě vyšší teplotní stability prodlužuje antibakteriální aktivitu o 4 hodiny.
Universální tag Ubikvitin (Ub) je protein vytvářející s většinou proteinů interakci s afinitou Kd>0,3 rnM, který zakrývá hydrofobní části fúzovaného proteinu s přímým vlivem na expresi a rozpustnost proteinu. Ubikvitin 3 při práci s vektorem slouží jako fúzní tag, který usnadňuje práci s rekombinantními proteiny. Původně je ubikvitin eukaryotický protein o velikosti 8,5 kDa s mnoha funkcemi. Jeho sekvence je vysoce konzervovaná od jednobuněčných organismů až po člověka. Jeho přítomnost v sekvenci usnadňuje produkci, izolaci a identifikaci proteinu z hostitelského produkčního systému. Produkovanému proteinu zvyšuje rozpustnost. Sekvence 76 aminokyselin modifikovaného ubikvitinu 3 je téměř totožná s lidským ubikvitinem a liší se jen v pěti aminokyselinách R42E, R72Q a R74E, G75S, G76A. Díky těmto změnám došlo ke snížení pí ubikvitinu z 7,0 na 6,2 a k zabránění spontánní degradace fúzovaného konstruktu v bakteriích, což je spojeno s nespecifickým štěpením vazby Ub-GG-X proteázou ElaD. Tato změna vedla ke zvýšení termodynamické stability fúzního endolysinu.
Dále je výhodné použít fúzní tag 14xHisTag zajišťující vysokou výtěžnost čistého proteinu během purifikace. Díky delší a flexibilnější sekvenci nedochází u tohoto afinitního tágu ke skrytí do struktury fúzního proteinu. Tento fúzní 14xHisTag je umístěn za ubikvitinem 3 a následován štěpným místem pro TEV proteázu. Přítomnost TEV štěpného místa (podtržená sekvence NLYFQ v SEQ ID NO. 2), kódující štěpné místo pro TEV proteázu usnadňuje oddělení obou fúzních tagů pro strukturní a funkční studie a pro praktické použití samotného termostabilního endolysinu.
-4CZ 36714 U1
Objasnění výkresů
Obr. 1 Bod tání původní (nativní) β-lytické endopeptidázy (endolysinu) měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufru 0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCh + 400 mM NaCl.
Obr. 2 Bod tání termostabilního endolysinu podle technického řešení měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufru 0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCh + 400 mM NaCl.
Obr. 3 Bod tání původní β-lytické endopeptidázy měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v 0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCl2.
Obr. 4 Bod tání termostabilního endolysinu podle technického řešení měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufru 0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCl2.
Obr. 5 Antibakteriální účinek divokého typu (wild type) původní β-lytické endopeptidázy (plná čára) a termostabilního endolysinu podle technického řešení (přerušovaná čára) na kmeny Staphylococcus aureus ST22 (a) a ST30 (b). Koncentrace β-lytické endopeptidázy a termostabilního endolysinu byla 12,5 μg/ml.
Příklady uskutečnění technického řešení
Klonování
Pro klonování rekombinantního proteinu byl použit expresní vektor pUbEx20. Tento vektor obsahuje silný promotor T7 a gen pro rezistenci k antibiotiku kanamycin, který uděluje buňkám selekční výhodu a usnadňuje expresi genů (Funkční vzorek 5792/2019 „Plasmid pUbEx20 k produkci proteinů pro komerční využití v heterologním expresním systému E. coli “. Janda, L., Kobzová, Š., Norek, A. ISBN 978-80-88233-86-2).
Všechna subklonování a veškerá genetická manipulace byla prováděna v kmeni E. coli DH10e (Invitrogen, Carlsbad, US). Gen pro termostabilní endolysin byl syntetizován firmou GenScript na zakázku podle zadání původců, jednalo se o sekvenci popsanou výše jako SEQ ID NO. 3, protože zvolený plasmid již obsahuje kódující sekvence pro ubikvitin 3, 14xHisTag a TEV štěpné místo. Navržená sekvence obsahovala místa pro restrikční štěpení. Celý gen byl štěpen enzymy NcoI a NotI a vložen do vektoru pUbEx20 (NcoI, NotI).
Při použití expresního vektoru, který neobsahuje kódující sekvence pro ubikvitin 3, 14xHisTag a TEV štěpné místo, by vkládanou sekvencí byla SEQ ID NO. 4.
Transformace
Za expresní systém byl zvolen bakteriální systém E. coli buňky BL21(DE3), což jsou geneticky modifikované kmeny E. coli s upraveným genomem pro cílenou manipulaci a načasování exprese rekombinantního proteinu. Klíčovou roli zde hraje gen lacI, který kóduje lac represor, a gen DE3, který nese informaci pro syntézu T7 RNA polymerázy, která je zodpovědná za transkripci inzertu. Lac represor nasedá na lac promotor (promotor genu DE3), blokuje tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripce neprobíhá.
Pokud je v buňce přítomen IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalaktopyranosid), váže na sebe lac represor, který se uvolní z vazby na lac promotor a umožní tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripci. Transformace plasmidové DNA byla provedena metodou teplotního šoku do chemokompetentních buněk E. coli. Pro další manipulaci a analýzy byly z kolonií připraveny bakteriální konzervy, které byly zamraženy v hluboko mrazicím boxu při -80 °C, kde je možno bakterie uchovat až několik let.
- 5 CZ 36714 U1
Jako buňky schopné přijmout rekombinantní DNA byly tedy použity kompetentní buňky E. coli kmen BL21(DE3). Do mikrozkumavky, společně s kompetentními buňkami (100 μl), bylo vloženo 5 μl plasmidové DNA. Takto vzniklá směs byla promíchána na vortexu a ponechána na ledu. Po 30 minutách byla směs krátce zahřáta na 42 °C ve vodní lázni po dobu 1 minuty. Ke směsi bylo přidáno 500 pl SOC media, vzorek byl inkubován ve 37 °C 1 hodinu za stálého míchání (200 ot/min). Nakonec byl vzorek sedimentován ve stolní centrifuze (3 000 ot/min, 1 min, laboratorní teplota), určitý objem média byl odlit a ve zbylém objemu (asi 100 pl) byl buněčný pelet rozpuštěn a nanesen na agarové misky, jež obsahovaly antibiotikum kanamycin.
Jednotlivé kolonie byly kultivovány odděleně v 5 ml LB (Luria-Bertoni) média s přídavkem příslušného antibiotika, a to opět přes noc při teplotě 37 °C za stálého třepání. Následující den byla z jednotlivých kolonií izolována DNA pomocí NucleoSpin® PlasmidQuickPureKit (Macherey-Nagel). Kontrola sekvence plazmidu byla provedena pomocí restrikčního štěpení enzymy BamHI a NcoI.
Příprava bakteriálních konzerv
Z agarové plotny obsahující narostlé kolonie expresních buněk bylo odpíchnuto 20 až 30 kolonií a ty byly zaočkovány do 100 ml TB média (Terrific Broth medium - bohaté médium) s přídavkem 1% glukózy (v/v) a 50 pg/ml kanamycinu. Bakteriální suspenze rostla přes noc při 37 °C. Následovala centrifugace (10 minut, 5 000 ot/min). Pelet byl rozpuštěn ve 4 ml 10% sterilního glycerolu, rozdělen pomocí mikropipety do mikrozkumavek po objemu 1 ml, a pro další použití zamražen v tekutém dusíku a skladován při -80 °C.
Exprese v bohatém médiu
Pro kultivaci expresních buněk nesoucích rekombinantní plasmidovou DNA bylo zvoleno LB médium s obsahem 1% glukózy. Buňky byly indukovány 0,4 mM IPTG po dosažení optické hustoty 0,6 při 22 °C.
Složení bohatého média (1 litr): 20 g LB média, 1 ml kanamycinu (pro výslednou koncentraci 50 μg/ml), 1% glukóza.
Do jednoho litru bohatého média byl přidán 1 ml bakteriální konzervy a kultivace probíhala při 37 °C po dobu 2 hodin (200 ot/min).
Po této době dosáhla optická hustota (měřená při 600 nm) hodnoty 0,6 = log fáze, což je růstová fáze vhodná pro indukci pomocí IPTG (isopropyl e-D-1-thiogalaktopyranosid) o výsledné koncentraci 0,4 mM. Kultivace probíhala při 22 °C po dobu 16 hodin.
Purifikace
Pro uvolnění proteinů z bakteriálních buněk byla zvolena metoda ultrasonikace, kdy jsou buněčné stěny dezintegrovány pomocí ultrazvuku. Proteiny byly přečištěny pomocí afinitní metalochromatografie, využívající kompetice látek histidin - imidazol pro vazbu k niklu, který je imobilizován na matrici kolony. Purifikace byla díky histidinové kotvičce velmi efektivní a pro zisk čistého proteinu stačila její jednokroková varianta. Z jednoho litru kultury je možno získat okolo 200 mg čistého proteinu.
Kultura byla sedimentována (30 minut, 4 °C, 8 000 ot/min) a pelet byl rozpuštěn v 40 ml sonikačního pufru (100mM Tris pH 8; 500mM NaCl, 10mM imidazol; 0.1% TritonX-100).
- 6 CZ 36714 U1
Buňky byly následně lyžovány ultrazvukovými pulzy po dobu 30 minut (doba jednoho pulsu byla 1 s, pauza mezi jednotlivými pulsy 4 s). Lyzát byl sedimentován (30 minut, 4 °C, 14 000 ot/min). Supernatant byl před nanesením na chromatografickou matrici zbaven zbytků buněčných stěn přečištěním přes mikrofiltr s póry o velikosti 0,22 pm. Pro purifikaci byl použit automatický purifikační systém FPLC AZURA Bio purification system s automatickým sběračem frakcí FOXY R1 a kolona naplněná matricí (Ni Sepharose High Performance) a s imobilizovaným iontem niklu (HisTrap HP, 5 ml, GE Healthcare). Kolona byla promyta třemi objemy ekvilibračního pufru, který vytvořil podmínky pro vazbu histidinové kotvičky proteinu k iontům niklu. Celý objem supernatantu byl na kolonu nanesen rychlostí 1 ml/min. Následně byla kolona promyta ekvilibračním pufrem, aby se vymyly nenavázané proteiny, obvykle 5 až 7 objemů kolony při rychlosti 2,5 ml/min. Pro uvolnění a vymytí cílového proteinu (SEQ ID NO. 2) byl použit eluční pufr s 300mM imidazolem. Po ukončení purifikace byl vzorek bezprostředně dialyzován. Výměna pufru probíhala s využitím přístroje pro proteinovou kapalinovou chromatografii AZURA® BIO PURIFICATION) na koloně HiPrep 26/10 Desalting GE Health Care. Všechny použité roztoky byly filtrovány přes 0,22 um filtr, odvzdušněny a zchlazeny na 4 °C. Kolona a roztoky byly umístěny v lednici (4 °C). Maximální objem vzorku na uvedené koloně může být 13 ml. U dialyzovaného endolysinu byla určena koncentrace proteinu. Roztok proteinu se doplnil glycerolem na výslednou koncentraci 20 % v/v a smíchal v hmotnostním poměru 1:30 s TEV proteázou. Směs byla inkubována při laboratorní teplotě 2,5 h za mírného míchání 20 ot/min a následně při 4 °C po dobu 16 hodin.
K odstranění ubikvitinu s afinitní kotvou 14xHisTag byla použita reversní chromatografie na 5 ml Ni-NTA niklové koloně. Kontaminující fúzní protein byl zachycen a cílový protein endolysin o sekvenci SEQ ID NO. 1 volně protékal kolonou. Zároveň došlo k zachycení proteinů, u nichž nedošlo k odštěpení ubikvitinu. K purifikaci byl využit přístroj pro proteinovou kapalinovou chromatografii (AZURA® BIO PURIFICATION) s ventilem pro změnu nasávaného roztoku. Všechny použité roztoky byly filtrovány přes 0,22 um filtr, odvzdušněny a zchlazeny na 4 °C. Kolona a roztoky byly umístěny v lednici (4 °C).
Volně protékající protein byl sbírán do sběrače frakcí. Následně byla kolona propláchnuta elučním pufrem 300 mM, regenerována a konzervována v 20% etanolu. Po ukončení purifikace byl vzorek ihned dialyzován do skladovacího pufru (TrisHCl 100 mM; NaCl 300 mM, glycerol 20 % v/v, pH 7,5). K tomu byl využit přístroj pro proteinovou kapalinovou chromatografii na koloně HiPrep 26/10 GE Health Care.
Určení stability endolysinu
Pro experiment byla použita metoda Thermal Shift Assay (TSA), známá v literatuře také jako diferenciační skenovací fluorimetrie (DSF), která umožňuje stanovit optimální podmínky pro stabilizaci proteinů bez nutnosti použít specializovaný přístroj. TSA sleduje tepelné rozbalení (denaturaci) proteinu v přítomnosti fluorescenční barvy (SYPRO oranž). Barva je v nepolárním prostředí vysoce fluorescenční. Nepolární prostředí zajišťují hydrofobní místa denaturujícího se proteinu, které se při postupném zvyšování teploty odkrývají na povrch. Měřená teplota tání (Tm) proteinu tak vyjadřuje jeho stabilitu. Porovnávány byly původní (nativní, divoký typ) β-lytická endopeptidáza a termostabilní endolysin podle technického řešení, mající sekvenci SEQ ID NO. 1.
Do 96-jamkové destičky byla aplikována směs o celkovém objemu 25 pl v pořadí - pufr (12,5 pl), voda (9 pl), protein (2,5 pl o koncentraci 1 mg/ml) a nakonec fluorescenční barvivo SYPRO oranž (1 pl), které je citlivé na světlo a je nutno s ním manipulovat rychle, aby nedošlo k předčasné reakci. Přes destičku byla nalepena ochranná fólie a krátce sedimentována (max. 5 000 ot/min). Na thermocykleru byl nastaven program gradient 25 °C ^ 85 °C, který zvyšuje teplotu o 0,2 °C na cyklus. Výsledky byly zpracovány pomocí softwaru LightCycler® 480 Software, verze 1.5.
- 7 CZ 36714 UI
Použité pufry byly vybrány na základě diplomové práce Mgr. Kateřiny Melkové, která určila nejlepší podmínky pro purifikaci a skladování endolysinu F1 (Melková 2015, https://is.muni.cz/th/ss9s4/Sablona.pdf).
Výstupem experimentu jsou křivky teploty tání pro každý testovaný pufr. Jejich vrcholem je bod tání, kdy právě polovina proteinu je v denature váném stavu, který určuje stabilitu proteinu.
V 0,1 M irisovém pufru pH 8, za přítomnosti vysoké koncentraci soli 400 mM NaCl a 5 mM vápenatých iontů CaCh byl termostabilní endolysin podle technického řešení (SEQ ID NO. 1) stabilnější než původní (nemutovaná) _-lytická endopeptidáza o 3,2 °C (obr. 3 a 4).
V 0,1 M irisovém pufru pH 8, bez přídavku soli a s doplněním o 5 mM vápenatých iontů CaCh (0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCh) dosáhl termostabilní endolysin podle technického řešení vůbec nejvyšší stability 53,66 °C (obr. 2). Stejně tak v tomto pufru původní β-lytická endopeptidáza dosáhla nejvyšší stability 50,28 °C (obr. 1). Oproti termostabilnímu endolysinu podle technického řešení měla ovšem β-lytická endopeptidáza sníženou stabilitu o 3,38 °C.
Křivky jsou vypočítané automaticky, a to dvěma numerickými metodami - Boltzmannovou metodou a metodou první derivace. Největší teplotní stabilita obou enzymů byla naměřena u pufrů v pH 8,0 (tabulka níže).
β-lytická endopeptidáza - divoký typ
Pufr Tm divoký typ [°C] Směrodatná odchylka
0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCh 50,28 ± 0,72
0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCh + 400 mM NaCl 49,81 ± 0,80
Termostabilní endolysin T72P G124P
Pufr Tm termostabilní typ [°C] Směrodatná odchylka
0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCh 53,66 + 0,36
0,1 M Tris pH 8 + 5 mM CaCb + 400 mM NaCl 53,02 ± 0,12
Průmyslová využitelnost
Fúzní termostabilní endolysin podle předkládaného technického řešení může být využit jako antibakteriální činidlo proti Staphylococcus aureus včetně MRSA (methicillin rezistentní S. aureus).

Claims (4)

1. Termostabilní endolysin, vyznačující se tím, že jeho aminokyselinová sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID NO. 1:
MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAVDADGYYHAQCQDLI TDYVLWLTDNKVRPWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWG HIGIVYDPGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKK SASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATI VYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK.
2. Termostabilní endolysin podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeho aminokyselinová sekvence je SEQ ID NO. 2:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ KESTLHLVLQLESAHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHSGAENLYFQSGSGTMAKTQAEINK RLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAVDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTD NKVRPWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDPGN TSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASTPATRPV TGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAG HIWIGYNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK.
3. Kódující sekvence termostabilního endolysinu uvedeného nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO. 3:
ATGGCGAAAACCCAAGCGGAAATCAATAAGCGTCTGGATGCGTATGCGAAAGGTACC GTCGACAGCCCGTACCGTGTGAAAAAGGCGACCAGCTACGACCCGAGCTTTGGTGTT ATGGAAGCGGGTGCGGTCGACGCGGATGGTTACTATCACGCGCAGTGCCAAGACCTG ATCACCGATTACGTGCTGTGGCTGACCGACAACAAAGTTAGGcctTGGGGCAACGCGA AGGATCAGATCAAACAAAGCTATGGCACCGGCTTCAAGATTCACGAGAACAAACCGA GCACCGTGCCGAAGAAAGGTTGGATCGCGGTTTTTACTAGTGGCAGCTACGAACAGT GGGGTCACATCGGCATTGTGTATGACccgGGCAACACCAGCACCTTCACCATTCTCGAG CAAAACTGGAACGGTTACGCGAACAAGAAACCGACCAAGCGTGTTGATAACTACTAT GGTCTGACCCACTTTATCGAGATTCCGGTGAAAGCGGGCACCACCGTTAAGAAAGAA ACCGCGAAGAAAAGCGCGAGCACCCCGGCGACCCGTCCGGTGACCGGTAGCTGGAAG AAAAACCAGTACGGCACCTGGTATAAACCGGAAAACGCGACCTTCGTGAACGGTAAC CAACCGATCGTTACCCGTATTGGCAGCCCGTTTCTGAACGCGCCGGTTGGTGGCAACC TGCCGGCGGGTGCGACCATTGTGTACGATGAGGTTTGCATTCAGGCGGGTCACATCTG GATTGGCTACAACGCGTATAACGGCAACCGTGTGTATTGCCCGGTTCGTACCTGCCAA GGTGTGCCGCCGAACCAGATTCCGGGTGTTGCGTGGGGTGTTTTCAAATAA.
4. Kódující sekvence podle nároku 3, vyznačující se tím, že má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO. 4:
atgcagatcttcgttaaaaccctgaccggtaaaaccatcaccctggaagttgaaccgtctgacaccatcgaaaacgttaaagcgaaaatccag gacaaagaaggtatcccgccggaccagcaggaactgatcttcgcgggtaaacagctggaagacggtcgtaccctgtctgactacaacatcc agaaagaatctaccctgcacctggttctgcagctcgagtctgcccaccaccaccactctggtcaccaccacacgggtcaccaccaccactctg gttctcaccaccactctggtgccgaaaacctgtacttccagtctggttctggtaccATGGCGAAAACCCAAGCGGAAATC AATAAGCGTCTGGATGCGTATGCGAAAGGTACCGTCGACAGCCCGTACCGTGTGAAA AAGGCGACCAGCTACGACCCGAGCTTTGGTGTTATGGAAGCGGGTGCGGTCGACGCG GATGGTTACTATCACGCGCAGTGCCAAGACCTGATCACCGATTACGTGCTGTGGCTGA CCGACAACAAAGTTAGGcctTGGGGCAACGCGAAGGATCAGATCAAACAAAGCTATGG CACCGGCTTCAAGATTCACGAGAACAAACCGAGCACCGTGCCGAAGAAAGGTTGGAT CGCGGTTTTTACTAGTGGCAGCTACGAACAGTGGGGTCACATCGGCATTGTGTATGAC ccgGGCAACACCAGCACCTTCACCATTCTCGAGCAAAACTGGAACGGTTACGCGAACA AGAAACCGACCAAGCGTGTTGATAACTACTATGGTCTGACCCACTTTATCGAGATTCC
- 9 CZ 36714 U1
GGTGAAAGCGGGCACCACCGTTAAGAAAGAAACCGCGAAGAAAAGCGCGAGCACCC CGGCGACCCGTCCGGTGACCGGTAGCTGGAAGAAAAACCAGTACGGCACCTGGTATA AACCGGAAAACGCGACCTTCGTGAACGGTAACCAACCGATCGTTACCCGTATTGGCA GCCCGTTTCTGAACGCGCCGGTTGGTGGCAACCTGCCGGCGGGTGCGACCATTGTGTA
5 CGATGAGGTTTGCATTCAGGCGGGTCACATCTGGATTGGCTACAACGCGTATAACGGC
AACCGTGTGTATTGCCCGGTTCGTACCTGCCAAGGTGTGCCGCCGAACCAGATTCCGG GTGTTGCGTGGGGTGTTTTCAAATAA.
CZ2022-40347U 2022-10-14 2022-10-14 Termostabilní endolysin a kódující sekvence CZ36714U1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2022-40347U CZ36714U1 (cs) 2022-10-14 2022-10-14 Termostabilní endolysin a kódující sekvence

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2022-40347U CZ36714U1 (cs) 2022-10-14 2022-10-14 Termostabilní endolysin a kódující sekvence

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ36714U1 true CZ36714U1 (cs) 2022-12-22

Family

ID=84540833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2022-40347U CZ36714U1 (cs) 2022-10-14 2022-10-14 Termostabilní endolysin a kódující sekvence

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ36714U1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9181531B2 (en) Process for purifying VLPs
Kim et al. C-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 protein contains an RNA helicase activity
CN113528575B (zh) 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
Lyon et al. Interspecies chimeric sperm lysins identify regions mediating species-specific recognition of the abalone egg vitelline envelope
KR20220061126A (ko) 카스파제-2 변이체
Araújo et al. Influence of the histidine tail on the structure and activity of recombinant chlorocatechol 1, 2-dioxygenase
Wang et al. Improving the activity of immobilized subtilisin by site-directed attachment through a genetically engineered affinity tag
US5932440A (en) Mammalian ribonuclease inhibitors and use thereof
He et al. High-level expression of human extracellular superoxide dismutase in Escherichia coli and insect cells
CZ36714U1 (cs) Termostabilní endolysin a kódující sekvence
US5935840A (en) Activated recombinant adenovirus proteinases
DK2319921T3 (en) New protease and use of this
Greimann et al. Reconstitution of RNA exosomes from human and Saccharomyces cerevisiae: cloning, expression, purification, and activity assays
CZ33404U1 (cs) Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin
FI103132B (fi) Menetelmä rekombinantti-IgA-proteaasin valmistamiseksi
Scotter et al. Expression and purification of sea raven type II antifreeze protein from Drosophila melanogaster S2 cells
RU2143492C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека
US9139619B2 (en) Fusion protein containing a single-stranded DNA binding protein and methods for expression and purification of the same
US20120009657A1 (en) Novel fusion carbonic anhydrase/cellulose binding polypeptide encoded by a novel hybrid gene, and method of creating and using the same
KR20010109348A (ko) 췌장의 프로카복시-펩티다제 ｂ, 이의 동질 효소 및뮤테인의 제조 방법, 및 이들의 용도
Tarnawski et al. Heterologous expression and initial characterization of recombinant RbcX protein from Thermosynechococcus elongatus BP-1 and the role of RbcX in RuBisCO assembly.
RU2144082C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека
CN103993030A (zh) 一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白的方法
RU2451076C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ Ulp275
CA2594178C (en) Methods of production of modified proteins

Legal Events

Date Code Title Description
FG1K Utility model registered

Effective date: 20221222