FI103132B - Menetelmä rekombinantti-IgA-proteaasin valmistamiseksi - Google Patents

Description

103132

Menetelmä rekombinantti-IgA-proteaasin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee IgA-proteaasin valmistusmenetelmää E. colin solunsisäisistä 5 kappaleista.

Erilaiset patogeeniset bakteerilajit (esim. Neisseria-suvusta, kuten Neisseria gonor-rhoeae ja Neisseria meningitidis tai Haemophilus-suvusta, kuten Haemophilus influenzae), jotka kasvavat ihmisen limakalvoilla, erittävät proteaaseja, jotka ovat spesifi-10 siä ihmisen Ig Alille ja joita merkitään IgA-proteaaseiksi. Immunoglobuliini Ig AI on tärkeä komponentti erittävässä immuunivasteessa, jonka pitäisi suojata sellaisten patogeenisten organismien infektiota vastaan (katsaus: Komfeld ja Plaut, Ref. Infect. Dis. 3 (1981), 521-534). Nämä IgA-proteaaseiksi merkityt proteolyyttiset entsyymit pilkkovat esim. seuraavia tunnussekvenssejä kuten esim. Pohler et ai., 15 (Nature 325 (1987), 458-462) kuvaavat: 1. Pro-Ala-Pro-> Ser-Pro 2. Pro-Pro -> Ser-Pro 3. Pro-Pro —> Ala-Pro 20 4. Pro-Pro —> Thr-Pro Tällöin tarkoittaa kulloinkin IgA:n leikkauskohtaa.

Edellä mainitut IgA-proteaasit ovat erittäviä proteiineja, joissa on N-terminaalinen 25 signaalisekvenssi periplasmaan kuljettamista varten ja C-terminaalinen auttajaproteii-niosa, joka lopulta mahdollistaa erittämisen periplasmasta alustaan.

Neisseriasta peräisin olevan IgA-proteaasin kloonaus ja ekspressio E. colissa on kuvattu esim. PNAS USA 79 (1982) 7881-7885 ja EMBO J. 3 (1984) 1595-1601.

30

Eräs haittapuoli IgA-proteaasin talteenotossa tunnettujen menetelmien mukaisesti on kuitenkin IgA-proteaasigeenillä transformoitujen E. coli -solujen vähäinen tuottavuus ja elinkelpoisuus, minkä johdosta saadaan vain hyvin vähäinen IgA-saanto.

35 Koska IgA-proteaasilla on proteolyyttisenä entsyyminä geeniteknisesti tuotettujen fuusioproteiinien pilkkomisessa suuri merkitys (vertaa W091/11520), on suuri tarve :· IgA-proteaasin rikastamismenetelmälle, joka ainakin osittain voittaa tekniikan tason ongelmat.

103132 2

Keksinnön mukaisesti ongelma ratkaistaan rekombinantti-IgA-proteaasin valmistusmenetelmällä, joka tunnetaan siitä, että (1) IgA-proteaasi modifioidaan siten, että IgA-proteaasigeenin C-terminaalista aut- 5 tajaosaa koodaava DNA-alue ei toiminnallisesti ole enää aktiivinen, (2) transformoidaan prokaryootti-isäntäsolu vaiheessa (1) modifioidulla IgA-prote-aasigeenillä tai vektorilla, jossa on tämä modifioitu geeni, (3) saadaan modifioitu IgA-proteaasigeeni isäntäsolussa ekspressoitumaan, (4) eristetään isäntäsolusta solunsisäisten kappaleiden muodossa oleva IgA-pro- 10 teaasija (5) IgA-proteaasi muutetaan in vitro -aktivoinnilla aktiiviseksi proteiiniksi.

Keksinnön muut olennaiset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

15 Yllättäen on havaittu, että IgA-proteaasi, jossa on ei enää toiminnallinen auttajaosa (ja siksi sitä ei voida enää erittää isäntäsolusta alustaan), on ei-aktiivisten solunsisäisten kappaleiden muodossa isäntäsolussa, ja että näiden solunsisäisten kappaleiden aktivoinnin jälkeen saatiin erittäin korkeat IgA-proteaasisaannot. Nämä ei-aktiiviset solunsisäiset kappaleet voidaan sitten eristää tavanomaisin menetelmin 20 soluista ja lopuksi in vitro -aktivoinnilla muuttaa aktiiviseen muotoon.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on olennaista, että IgA-proteaasin C-terminaa-lista auttajaosaa koodaava DNA-alue ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen. Tämä voi tapahtua esimerkiksi auttajaosaa koodaavan DNA-alueen osittaisella tai täydelli-? 25 sellä deleetiolla. DNA-ffagmenttien deleetio voi tapahtua ammattimiehelle sinänsä tunnetulla tavalla, esim. in vitro -mutageneesillä kaksoisjuosteiseen tai yksijuostei-seen DNA:han tai pilkkomalla sopivilla restriktioentsyymeillä ja poistamalla restrik-tiofragmentit auttajaosan alueelta. Toinen mahdollisuus IgA-proteaasigeenin tämän kaltaiseen modifiointiin on in vitro -mutageneesin suorittaminen auttaja-aluetta koo-30 daavalla DNA-alueella, minkä johdosta siihen viedään yksi tai useampi translaation lopetuskodoni, mikä sitten IgA-proteaasigeenin ekspressiossa estää täydellisesti auttajaosan translaation.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä modifioidaan IgA-proteaasigeeni edullisesti 35 niin, että auttajaosa on täysin deletoitu tästä modifioidun geenin koodaamasta IgA-proteaasista. Tämä voidaan saavuttaa esimerkiksi viemällä yksi tai useampi translaation lopetuskodoni IgA-proteaasigeeniin suoraan C-terminaalisen auttajaosan ai- 3 103132 kuun. Toinen mahdollisuus auttajaosan deleetioon on PCR-reaktio IgA-proteaasi-cDNA:han käyttämällä sopivaa aluketta, kuten esimerkissä 1 kuvataan.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään edullisesti isäntäsoluna prokaryoot-5 tista solua, edullisesti E. coli -solua. Lisäksi on edullista, että isäntäsolu transformoidaan IgA-proteaasia koodaavalla DNA-sekvenssillä, jossa on kontrollin alaisena indusoitava promoottori. Esimerkkejä sopivista indusoituvista promoottoreista ovat mahdollisesti tae-, lac- tai trp-promoottori tai muut sen kaltaiset promoottorit, jotka ovat ammattimiehelle tuttuja molekyylibiologian alueelta.

10

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetut IgA-proteaasit ovat isäntäsolussa so-lunsisäisten kappaleiden muodossa. Solunsisäisten kappaleiden eristäminen ja niiden muuttaminen aktiiviseksi proteiiniksi in vitro -aktivoinnilla voi tapahtua millä tahansa ammattimiehelle tutulla tavalla. Esimerkkejä sellaisista menetelmistä on 15 mm. kuvattu EP-A-0 361 475:ssä, DE-A-3 611 817:ssä, DE-A-3 537 708:ssa, WO-87/02673:ssa; Jaenicke, R. & Rudolph, R. (1989) Protein structure - a practical approach, Toim.: Creighton, T.E. Oxford University Press, 191; Rudolph, R. (1990) Modem methods in protein and nucleic acid analysis, toim.: Tschesche, E. Walter deGruyter Verlag, 149-171; Jaenicke, R. (1987) Prog. Biophys. Molec. Biol. 49, 20 117.

IgA-proteaasin in vitro -aktivointi käsittää edullisesti liuottamis- ja naturointivai-heen. Naturointivaihe voi tapahtua yhtä hyvin jatkuvalla tai ei-jatkuvalla denaturoidun proteiinin viemisellä naturointipuskuriin. Lisäksi naturointivaihe suoritetaan : 25 edullisesti ei-jatkuvan pulssinaturoinnin muodossa.

Erityisen edullisesti suoritetaan naturointivaihe IgA-proteaasin aktivoimiseksi 0,2-1 mol/1 arginiinia, edullisimmin 0,4-0,8 mol/1 arginiinia, läsnäollessa. Lisäksi on edullista, että uudelleenaktivointi suoritetaan pH-arvossa 5-9, erittäin edullisesti pH-30 arvossa 6-8.

IgA-proteaasin renaturoinnissa ei-aktiivisista solunsisäisistä kappaleista muodostuu aktiivinen, liukoinen proteiini sellaisella saannolla, joka lähtömateriaalin ja renatu-rointimenetelmän mukaan yltää noin 10 % - noin 30 %:iin. Vaikkakaan renaturointi-35 saanto ei ole kvantitatiivinen, saadaan keksinnön mukaisella menetelmällä olennaisesti korkeampi saanto aktiivista IgA-proteaasia kuin totunnaisilla menetelmillä.

. · < 103132 4

Keksintö koskee lisäksi rekombinantti-DNA.ta, joka koodaa IgA-proteaasia ja on niin modifioitu, että rekombinantti-DNA:n ekspressiossa saadaan IgA-proteaasi, jonka C-terminaalinen auttajaosa ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen ja edullisesti on jopa täysin deletoitu. Keksinnön mukainen rekombinantti-DNA on edullisesti lisäksi niin 5 modifioitu, että rekombinantti-DNA:ta ekspressoitaessa saadaan IgA-proteaasi, jonka N-terminaalinen signaaliosa ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen ja edullisesti on täysin deletoitu. Geeniteknologian menetelmät modifioida tai deletoida DNA-alueita, jotka johtavat toivottuun ratkaisuun, on jo mainittu tai molekyylibiologian alan ammattimies on niin hyvin niistä perillä, että niitä ei tarvitse selittävästi valaista.

10

Lisäksi tämän keksinnön eräs kohde on myös rekombinantti-vektori, jossa on vähintään yksi kopio keksinnön mukaisesta rekombinantti-DNA:sta. Keksinnön mukainen rekombinantti-DNA on edullisesti tässä vektorissa indusoituvan promoottorin kontrollin alaisena. Keksinnön mukainen vektori voi olla isäntäsolun kromosomin ulko-15 puolella (esim. plasmidi) tai olla integroitunut isäntäsolun genomiin (esim. bakteriofagi λ E. coli -solussa). Vektori on edullisesti plasmidi.

Keksintö koskee myös solua, joka on transformoitu keksinnön mukaisella rekombi-nantti-DNA:lla tai keksinnön mukaisella rekombinanttivektorilla. Solu on ensi si-20 jassa prokaryoottinen soluja erityisen edullisesti on E. coli -solu.

Keksintöä valaistaan edelleen lähemmin tässä olevilla esimerkeillä sekvenssilista-uksiin viitaten.

• 25 SEKV. ID. nr. 1 osoittaa esimerkissä 1 käytetyn alukkeen A

SEKV. ID. nr. 2 osoittaa alukkeen B

SEKV. ID. nr. 3 osoittaa alukkeen C

SEKV. ID. nr. 4 osoittaa alukkeen D

30 Plasmidi pMACl on tallennettu Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, numerolla DSM 6261.

« « 5 103132

Esimerkki 1

Plasmidirakenteen valmistaminen IgA-proteaasin ekspressoimiseksi solunsisäis-ten kappaleiden muodossa 5 IgA-proteaasin valmistamiseksi solunsisäisinä kappaleina kloonataan proteiinin koo-daava alue ilman signaalisekvenssiä ja auttajasekvenssiä, kuten seuraavassa kuvataan, vahvan promoottorin taakse (aminohappoasema +1 - asema 959, Pohler J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F., Nature 325, (1987), 458-462).

10 Tätä varten eristetään kromosomaalista DNA:ta N. gonorrhoeaesta (esim. MS 11) ja käytetään polymeraasiketjureaktion suorittamiseen (PCR, menetelmä vertaa EP-A 0 200 362, EP-A 0 201 184). PCR:ään käytetään seuraavaa aluketta:

Aluke A (SEKV. ID. nr. 1): 15 5' GAAGAATTCGGAGGAAAAATTAATGGCACTGGTACGTGATGATGTCGATTATCAAA 3'

Aluke B (SEKV. ID. nr. 2): 20 5' TTTTTGTAATAAAGATCTTTGCCTTG 3' A-aluketta varten, jossa on ATG-aloituskodoni samoin kuin EcoRI-tunnistussek-venssi (GAATTC), optimoitiin IgA-proteaasin 5 ensimmäistä kodonia tehokkaampaa ekspressoitumista varten E. colissa, ilman että aminohapposekvenssiä muutet- 25 tiin.

Alukkeessa B on sekvenssi IgA-proteaasin Bglll-tunnistussekvenssin vieressä (ami-nohappoasemat noin 553-561). Siten saatu PCR-fragmentti (A/B 0 noin 1659 bp, IgA-proteaasigeenin 5-terminaalialue) puhdistetaan ja pilkotaan uudestaan Eco-30 RI/BgHI-entsyymillä.

IgA-proteaasigeenin 3'-alueen valmistamiseksi suoritetaan toinen PCR seuraavilla alukkeilla: 35 Aluke C (SEKV. ID. nr. 3): : ’ 5' C AAGGC AAAG ATCTTT ATT AC AAAAA 3' 6 103132

Aluke D (SEKV. ID. nr. 4): 5' TTCAGCTGGTCGACTTATCACGGGGCCGGCTTGACTGGGCGGCC 3' 5 Aluke C vastaa alukkeen B koodaavaa aluetta (Bglll-leikkauskohta) ja alukkeessa D on sekvenssit aminohappoasemista 959-959 lopussa olevan lopetuskodonin ja Sall-tunnistussekvenssin kanssa. Siten saatu PCR-fragmentti (C/D = 1200 bp) eristetään ja pilkotaan uudestaan entsyymillä Bglll/Sall.

10 Myöhemmin suoritetaan kolmen fragmentin ligaatio: fragmenteilla A/B, fragmentilla C/D ja vektorilla pKK223-3 (DSM 3694P), joka on ensin EcoRI- ja Sali-entsyymillä pilkottu ja puhdistettu. Siten saatua vektoria merkitään IgA-Prot ΠΙ ja transformoidaan E. coli K12:een.

15 Esimerkki 2 (vertailuesimerkki)

Liukoisen IgA-proteaasin rikastaminen perinteisellä tavalla a) Rikastaminen 1 l:n ravisteluviljelmästä 20 Lähtömateriaalina käytetään E. coli K12-soluja, jotka on transformoitu plasmidilla pMACl (8878 bp). Tällä plasmidilla on IgA-proteaasin täydellinen koodaava alue lambda-promoottorin kontrollin alaisena. Plasmidilla on ampisilliini-resistenssi.

Soluja kasvatettiin LB-alustalla yön yli 28 °C:ssa ja myöhemmin laimennettiin • 25 1:100 LB-alustalla. Viljelmää inkuboitiin sitten vielä 4 h 37 °C:ssa. Solut erotettiin sentrifiigointivaiheessa. Viljelmäsupematantti steriilisuodatettiin selluloosa-asetaat-tisuodattimella, dialysoitiin 20 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,5, 10 mmol/1 EDTA, 10 % glyseriini (puskuri A) vastaan ja konsentroitiin 1/10 tilavuuteen SALVIA-kapil-laaridialysaattorin E-15U avulla.

30

Ensimmäisenä puhdistus vaiheena suoritettiin negatiivieluutio DEAE-Sephadex A-50:llä 20 mmol/1 Tris/HCl:ssä, pH 7,5, 10 mmol/1 EDTAissa ja 10 % glyseriinissä. Pylvästäytteenä oli 0,5 mg proteiinia/1 ml geelimatriisia. Tällä erotuksella on IgA-proteaasi läpimenevässä nesteessä ja suurin osa E. coli -proteiinista sitoutuu kanta-35 jaan. Pesemällä pylväsmatriisi jälkeenpäin puskurilla A plus 1 mol/1 NaCl:a osoitettiin, että vähemmän kuin 10 % IgA-proteaasia sitoutui pylväsmateriaaliin.

• · 103132 7

Lopuksi seurasi puhdistus kationinvaihtajalla (Fractogel®-EMD-S03* -650M). Proteiinin sitoutuminen tapahtuu 20 mmol/1 Tris/HCLssa, 10 mmol/1 EDTA:ssa, 10 % glyseriinissä pH 7,0. Sitten voi seurata uudelleenpuskurointi pH:ssa 8,0.

5 Eluutio tapahtuu lineaarisesti nousevalla NaCl-gradientilla, jolloin IgA-proteaasi eluoituu puskurilla pH 8,0 suolakonsentraatiolla 0,1 mol/1 NaCl ja pH 7,0 puskurilla, 0,2 mol/1 NaCl kanssa.

Tasapaino: 10 Konsentraatti ennen DEAE-Sephadexia 3,5 mg proteaasia (70 % puhdas)

Eluaatti DEAE-Sephadexin jälkeen 2,4 mg proteaasia (90 % puhdas)

Eluaatti Fractogel®-EMD-S03‘ 650 M 1 mg proteaasia 15 jälkeen (> 95 % puhdas) b) IgA-proteaasin rikastaminen 10 1 fermenttorista Lähtömateriaali ja puhdistus olivat vastaavat kuin esimerkissä 2a).

20

Tasapaino:

Konsentraatti ennen DEAE-Sephadexia 50 mg proteaasia (50 % puhdas)

Eluaatti DEAE-Sephadexin jälkeen 30 mg proteaasia (60 % puhdas)

Eluaatti Fractogel®-EMD-S03' 650 M jälkeen 12 mg proteaasia (>95% puhdas) · 25

Esimerkki 3

IgA-proteaasin rikastaminen solunsisäisistä kappaleista (keksinnön mukainen menetelmä) 30 Lähtömateriaali oli rakenne IgA-Prot ΙΠ (esimerkki 1) E. coli -soluissa DSM 3689, jossa oli lisäksi laclq-plasmidi lac-repressorin ekspressiota varten.

1 1 fermentaatiota varten laitettiin 500 ml LB-alustaan kulloinkin 50 pg/ml kana-mysiiniä ja ampisilliinia. Tämä alusta siirrostettiin 7,5 ml:lla yön yli kasvanutta vil-35 jelmää, josta saatiin OD550 n. 0,1. Sitten seurasi 3-4 h inkubaatio 37 °C:ssa ravistellen (150 rpm). Solut indusoitiin OD550 n. 0,8:ssa 5 mmol/1 IPTG:llä. 4 h inkubaation jälkeen ravistellen 37 °C:ssa (150 rpm) solut kerättiin.

8 103132 IB-valmiste:

Solut otettiin talteen sentrifugoimalla, lisättiin 10 ml Tris-magnesiumpuskuria (10 mmol/1 Tris, pH 8,0, 1 mmol/1 MgCk) ja rikottiin lysotsyymillä (0,3 mg/ml).

5

Inkuboitiin 15 min 37 °C:ssa ja vietiin French-Pressin läpi (1200 psi). Myöhemmin seurasi DNAasi-käsittely (1 mg DNAasi I) 30 min 37 °C.

Lisättiin 20 ml 0,5 mol/1 NaCl:a, 20 mmol/1 EDTA:ta, pH 8,0 ja 3,0 ml 20 % Tri-10 ton x 100:aa ja inkuboitiin 10 min huoneenlämpötilassa.

Suspensiota sentrifugoitiin 10 min 15 000 rpm ja 4 °C. Pelletti suspendoitiin 30 ml:aan 50 mmol/1 Tris:ä, pH 8,0, 50 mmol/1 EDTA:ta ja 0,5 % Triton x 100:aa ja käsiteltiin ultraäänellä. Jälleen sentrifugoitiin, suspendoitiin uudestaan ja käsiteltiin 15 ultraäänellä. Tämä proseduuri toistettiin vielä kaksi kertaa. Myöhemmin sentrifugoitiin ja siten saadut pelletit laitettiin IB:ksi esimerkkiin 3.

Taulukossa 1 nähdään tulokset fermentaatiosta 1 1 ravisteluviljelmästä ja 10 1 fer-menttorista.

20

Taulukko 1

Fermen- £. coli- Kokonaisproteiini IgA-proteaasi taatio kanta IB-materiaalista (g) (%) (g) ; 25 11 HB 101 0,125 50-70 0,06-0,09 101 K12C600 20,8 30-50 6,2-10,4

Taulukosta 1 nähdään, että 1 1 ravisteluviljelmästä saatiin 60-90 mg proteaasia so-lunsisäisenä (IB) materiaalina. Noin 10 % renaturointisaannolla antoi tämä 6-9 mg 30 aktiivista IgA-proteaasia (verrattuna 3,5 mg:aan perinnäisillä menetelmillä).

10 1 fermenttorista saatiin 6,2-10,4 mg proteaasia IB-materiaalina. 10 % renaturointi antoi tästä 620-1040 mg IgA-proteaasia (verrattuna 50 mg:aan proteaasia perinnäisillä menetelmillä).

35 • · 9 103132 Näistä tuloksista on selvästi nähtävissä, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan vähintään kertoimella 2-3 (1 1 viljelmä) tai 20-30 (10 1 fermenttori) suurempi saanto.

5 Esimerkki 4

IgA-proteaasin renaturointi solunsisäisistä kappaleista (11 fermentaatio)

Solunsisäiset kappaleet liuotettiin ensin, sitten dialysoitiin ja sitten naturoitiin vastaavassa puskurissa.

10 IB-materiaalin liuottaminen:

6 mol/1 guanidiini/HCl, pH 8,5 0,1 mol/l Tris 1 mmol/1 EDTA

15 0,1 mol/1 ditioerytreitoli (DTE)

Inkubaatio: 2 h huoneenlämpötilassa Tilav: 10 ml

Proteiinikonsentraatio: 10 mg/ml 20 Liuenneen dialyysi:

6 mol/1 guanidiini/HCl, pH 3 1 mmol/1 EDTA

Kestoaika: 12 h huoneenlämpötilassa 101 puskuria vastaan i 25 Naturointipuskuri: 1) 100 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DTE, pH 8,5 2) 100 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DTE, pH 7,5 3) 20 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DTE, pH 8,0 4) 0,6 mol/1 Arg/HCl, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 DTE, pH 8,0 30 5) 0,6 mol/1 Arg/HCl, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 glutationi pelkistetty (GSH)/0,5 mmol/1 glutationi hapetettu (GSSG), pH 8

Pulssinaturointi:

Denaturoitu proteiini laitettiin 5 annoksena renaturointipuskuriin, jolloin aikaero 35 yksittäisten lisäysten välillä oli 30 min ja pulssia kohti proteiinikonsentraatio lisääntyi seoksessa 20 pg/ml. Proteiinin loppukonsentraatio oli lopuksi 100 pg/ml.

*« 103132 10

Renaturoidun IgA-proteaasin aktiivisuuden määrittämiseksi seurasi dialyysi pilk-komispuskurissa (50 mmol/1 Tris/HCl pH 8, 1 mmol/l CaCl2). Pilkkomissubstraatti-na käytettiin ihmisen IgA:ta. Taulukko 2 osoittaa pilkkomiskokeen tuloksen renatu-roidulle materiaalille (inkubaatio: 6 h 37 °C), joka saatiin käyttämällä edellä ollutta 5 naturointipuskuria (1-5).

Taulukko 2

Ihmisen IgA:n pilkkominen esillä olevan esimerkin mukaan eristetyllä IgA-10 proteaasilla (inkubaatio: 6 h 37 °C). Dialyysin jälkeen saadussa isolaatissa oli noin 50 % IgA-proteaasia.

Suhde

Renaturantti Proteaasi/Substraatti Pilkkominen 15 (pg) (%) 1 1:20 10 2 1:20 30 3 1:20 10 4/5 1:100 100 20 1:500 50 1:1000 30 1:2000 10 1:5000 5 liukoinen proteaasi 1:500 100 i 25 (100 % puhdas)

Taulukosta 2 nähdään, että IgA-proteaasi renaturoituu kaikissa puskureissa. Saannot ovat kuitenkin arginiini (Arg) -puskurissa kertoimella 10-100 korkeammat kuin ilman arginiinia. Vertailuksi pilkottiin substraatti liukoisella, puhdistetulla IgA-30 proteaasilla (esimerkin 1 mukaisesti) suhteessa proteaasi .substraatti 1-500 100-. prosenttisesti. Siitä saadaan puskurilla 4) ja 5) noin 50 %:n renaturointisaanto.

Esimerkki 5

IgA-proteaasin renaturoinnin optimointi solunsisäisistä kappaleista riippuen 35 pH-arvosta ja arginiinikonsentraatiosta • a

Liuottaminen ja dialyysi vastaavasti kuin esimerkissä 4.

11 103132

Pulssinaturointi: proteiinilisäys tapahtui kuin esimerkissä 4 on kuvattu.

1) Naturointisaannon määritys muuntelemalla pH-arvoa 0,6 mol/1 Arg/HCl

5 1 mmol/1 EDTA

pH 4, 6, 8 2) Naturointi muimtelemalla arginiinikonsentraatiota 1 mmol/1 EDTA, pH 8

10 1 mmol/1 DTE

Arg/HCl: 0,2; 0,4; 0,6 ja 0,8 mol/1

Myöhemmin seurasi dialyysi huoneenlämpötilassa 100-kertaista pilkkomispuskurin tilavuutta vastaan (50 mmol/1 Tris/HCl, pH 8, 1 mmol/1 CaCl2).

15

Taulukko 3

Ihmisen IgA.n pilkkominen edeltävän esimerkin mukaan saadulla IgA-proteaasilla. Dialysaatissa on noin 50-70 % IgA-proteaasia. Pilkkomiserässä inkuboitiin 50 μg 20 substraattia 1 μg kanssa renaturoitua IgA-proteaasia yli 6 h 37 °C:ssa.

pH Pilkkomis-% Arginiini (mol/1) Pilkkomis-% 4 10 0,2 85 6 95 0,4 90 · 25 8 100 0,6 95 0,8 95

IgA-proteaasin optimaalinen uudelleenaktivointi tapahtuu pH-arvossa 6-8 ja argi-niini-konsentraatiossa 0,6-0,8 mol/1.

30 SEKV. ID. nr.: 1 (Aluke A)

Sekvenssin laatu: Nukleiinihappo yksijuosteinen

Sekvenssin pituus: 56 nukleotidiä

35 GAAGAATTCG GAGGAAAAAT TAATGGCACT GGTACGTGAT GATGTCGATT ATCAAA

4 · 103132 12 SEKV. ID. nr.: 2 (Aluke B)

Sekvenssin laatu: Nukleiinihappo yksijuosteinen

Sekvenssin pituus: 26 nukleotidiä

5 TTTTTGTAAT AAAGATCTTT GCCTTG

SEKV. ID. nr.: 3 (Aluke C)

Sekvenssin laatu: Nukleiinihappo yksijuosteinen

Sekvenssin pituus: 26 nukleotidiä 10

CAAGGCAAAG ATCTTTATTA CAAAAA

SEKV. ID. nr.: 4 (Aluke D)

Sekvenssin laatu: Nukleiinihappo yksijuosteinen 15 Sekvenssin pituus: 44 nukleotidiä

TTCAGCTGGT CGACTTATCA CGGGGCCGGC TTGACTGGGC GGCC

«

Claims (14)

103132

1. Menetelmä rekombinantti-IgA-proteaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (1) IgA-proteaasigeeni modifioidaan niin, että IgA-proteaasigeenin C-terminaalista 5 auttajaosaa koodaava DNA-alue ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen, (2) transformoidaan prokaryootti-isäntäsolu vaiheessa (1) modifioidulla IgA-prote-aasigeenillä tai vektorilla, jossa on tällainen modifioitu geeni, (3) saadaan modifioitu IgA-proteaasigeeni ekspressoitumaan isäntäsolussa, (4) eristetään solunsisäisten kappaleiden muodossa oleva IgA-proteaasi isäntäso- 10 lustaja (5) muutetaan IgA-proteaasi in vitro -aktivoinnilla aktiiviseksi proteiiniksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IgA-proteaasigeeni modifioidaan siten, että modifioidusta geenistä ekspressiossa syntyvän IgA- 15 proteaasin C-terminaalinen auttajaosa on täysin deletoitu.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että auttaja-osaa koodaavaan DNA-alueeseen viedään yksi tai useampia translaation lopetusko-doneita tai auttajaosaa koodaava DNA-alue deletoidaan osittain tai kokonaan. 20

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IgA-proteaasigeeniä modifioidaan lisäksi siten, että IgA-proteaasigeenin N-termi-naalista signaaliosaa koodaava DNA-alue ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen. : 25 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IgA-proteaa sigeeni modifioidaan siten, että modifioidusta geenistä ekspressiossa syntyvän IgA-proteaasin N-terminaalinen signaaliosa on täysin deletoitu.

6. Jonkin edellä olleen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 30 että isäntäsoluna käytetään E. coli -solua.

7. Jonkin edellä olleen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että naturointivaihe tehdään 0,2-1 mol/1 arginiinia läsnäollessa.

8. Rekombinantti-DNA, joka koodaa IgA-proteaasia, tunnettu siitä, että se on niin modifioitu, että rekombinantti-DNA:n ekspressiossa saadaan IgA-proteaasi, jonka C-terminaalinen auttajaosa ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen. 103132

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen rekombinantti-DNA, tunnettu siitä, että re-kombinantti-DNA:n ekspressiossa saadaan IgA-proteaasi, jonka auttajaosa on täysin deletoitu.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen rekombinantti-DNA, tunnettu siitä, että se on lisäksi siten modifioitu, että rekombinantti-DNA:n ekspressiossa saadaan IgA-proteaasi, jonka N-terminaalinen signaaliosa ei ole enää toiminnallisesti aktiivinen.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen rekombinantti-DNA, tunnettu siitä, että re-10 kombinantti-DNA:n ekspressiossa saadaan IgA-proteaasi, jonka signaaliosa on täysin deletoitu.

12. Rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että siinä on ainakin yksi patenttivaatimusten 8-11 mukaisen rekombinantti-DNA:n kopio. 15

13. Prokaryoottisolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimusten 8-11 mukaisella rekombinantti-DNA:lla tai patenttivaatimuksen 12 mukaisella re-kombinanttivektorilla.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on E. coli -solu.